Name: Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode de visualisation des réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires de larves de Drosophila melanogaster. Cette technique permet d'étudier la dynamique des microtubules et les protéines régulatrices impliquées dans le système nerveux.

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Nous remercions le Dr Ying Xiong pour les discussions et les commentaires sur le manuscrit. Ces travaux sont soutenus par une subvention de la National Science Foundation of China (NSFC) à C. M. (31500839).

1. Dissection des larves
REMARQUE : La solution de dissection solution saline de type hémolymphatique (HL3.1)18 et la solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde (PFA)19,20 sont utilisées à température ambiante car les microtubules se dépolymérisent lorsque la température est trop basse.
<ol><li>Repérez une larve errante du 3e stade à l’aide d’une longue pince émoussée. Lavez-le avec HL3.1 et placez-le sur la boîte de dissection sous le stéréomicroscope. NOTA : La larve errante du 3e stade larvaire est identifiée par le spiracle antérieur ramifié et rampe autour du tube à environ 96 h (25 °C)21.</li>
	<li>Positionnez la larve avec le côté dorsal ou ventral vers le haut. Identifiez la face dorsale par les deux longues trachées et la face ventrale par les ceintures denticules abdominales.<ol><li>Selon le tissu à observer, optez pour une dissection dorsale ou ventrale. Cela permettra d’avoir une vue plus précise et détaillée de la zone d’intérêt spécifique. Pour l’observation de la JNM et des cellules musculaires, ouvrez les régions dorsale et ventrale des larves, respectivement.</li>
	</ol></li>
	<li>Épinglez les crochets buccaux et la queue. Ajustez les broches pour maintenir la larve dans un état étendu. Ajoutez une goutte de HL3.1 à la larve pour éviter qu’elle ne se dessèche. REMARQUE : Le HL 3.1 sans Ca2+ peut être utilisé pour minimiser la contraction des muscles pendant la dissection.</li>
	<li>Utilisez les ciseaux à dissection pour faire une petite coupe transversale près de l’extrémité postérieure, mais ne coupez pas l’extrémité postérieure. Coupez ensuite le long de la ligne médiane ventrale vers l’extrémité antérieure.</li>
	<li>Insérez quatre épingles à insectes aux quatre coins de la larve. Réajustez les épingles à insectes de manière à ce que la larve soit étirée au maximum dans toutes les directions.</li>
	<li>Utilisez la pince pour retirer les organes internes sans endommager les muscles.</li>
</ol>2. Fixation
<ol><li>Ajouter 100 μL de PFA (4 %) pour immerger les carcasses pendant 40 min pendant qu’elles sont encore épinglées sur la boîte de dissection. ATTENTION : Des mesures de protection efficaces sont prises pour éviter tout contact direct avec la peau ou l’inhalation, car le PFA est un danger.</li>
	<li>Démontez les broches et transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Rincer le PFA avec 1x solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) pour remplir un tube de microcentrifugation de 2 mL pendant 10 min sur l’agitateur décolorant à 15 tr/min. Répétez le processus de lavage 5 fois.</li>
</ol>3. Immunocytochimie
<ol><li>Immergez les carcasses dans un agent bloquant (5 % de sérum de chèvre dans 0,2 % de PBST) et bloquez pendant 40 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez l’agent bloquant et remplacez-le par 200 μL de l’anticorps primaire (p. ex., anti-α-tubuline, 1 :1000 ; anti-Futsch, 1 :50) dilué avec 0,2 % de PBST à 4 °C pendant la nuit. Visualisez les microtubules musculaires par immunomarquage avec un anti-α-tubuline monoclonal. L’anti-Futsch peut refléter indirectement la morphologie des microtubules dans la JNM.</li>
	<li>Après l’incubation de l’anticorps primaire, laver les larves avec du PBST à 0,2 % pendant 10 min. Répéter 5 fois.</li>
	<li>Incuber les larves avec 200 μL d’anticorps secondaires (p. ex., anticorps de chèvre anti-Mouse-488, 1 :1000) dilués avec 0,2 % de PBST à température ambiante pendant 1,5 h dans l’obscurité.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez un colorant nucléaire tel que l’iodure TO-PRO(R) 3 (T3605) à une concentration de 1 :1000 dans le tube d’incubation pendant 30 min lors de la coloration des microtubules dans l’obscurité20,22.</li>
	<li>Rincez l’anticorps secondaire et le colorant nucléaire avec 0,2 % de PBST pendant 10 minutes. Répétez 5 fois dans l’obscurité.</li>
</ol>4. Montage
<ol><li>Placer la carcasse de la larve dans du PBST à 0,2 % sur une lame de verre et l’ajuster au stéréomicroscope. Assurez-vous que la surface intérieure de la carcasse larvaire est orientée vers le haut et que toutes les carcasses larvaires sont disposées comme vous le souhaitez.</li>
	<li>Absorbez l’excès de solution PBST à l’aide d’une lingette et ajoutez délicatement une goutte de produit de montage anti-décoloration.</li>
	<li>Placez une lamelle sur la lame pour couvrir les larves disséquées lentement et doucement afin d’éviter les bulles.</li>
	<li>Appliquez du vernis à ongles autour de la lamelle. Placez la diapositive dans l’espace sombre pour réduire l’atténuation des fluorescents.</li>
</ol>5. Acquisition d’images
<ol><li>Pour acquérir les images, utilisez un microscope confocal à balayage laser, sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 60x (ouverture numérique 1,42) ou similaire, et ajustez la puissance et la longueur d’onde du laser en fonction de l’expérience.</li>
	<li>Pour identifier la JNM, capturez des images dans le muscle 4 du segment A3 (comme indiqué dans l’emplacement de la figure 1F). Sélectionnez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline ou le Futsch et un laser de 543 nm pour activer la piste d’imagerie HRP. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 800 pixels x 800 pixels, à un zoom numérique de 2,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,8 μm dans les JNM (Figure 2).</li>
	<li>Pour identifier les microtubules dans le muscle, capturez des images du muscle 2 dans le segment A3-A5 (comme indiqué à l’emplacement de la figure 1G) car il a moins de branches trachéales. Choisissez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline et un laser de 635 nm pour activer la piste d’imagerie T3605. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 1024 pixels x 1024 pixels, à un zoom numérique de 3,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,4 μm dans les cellules musculaires (Figure 3).</li>
</ol>

Observation des réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires de la drosophile

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un protocole est décrit ici pour la dissection et l’immunomarquage des jonctions neuromusculaires et des cellules musculaires des larves de drosophile . Il y a plusieurs points essentiels à considérer. Tout d’abord, il est crucial d’éviter de blesser les muscles observés pendant le processus de dissection. Il peut être utile de fixer le filet avant de retirer les organes internes pour éviter tout contact direct entre la pince et les muscles. Pour éviter les lésions musculaires ou la séparation de l’épiderme larv...

Les microtubules (MT), en tant que l’un des composants structurels du cytosquelette, jouent un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la division cellulaire, la croissance et la motilité cellulaires, le transport intracellulaire et le maintien de la forme cellulaire. La dynamique et la fonction des microtubules sont modulées par des interactions avec d’autres protéines, telles que MAP1, MAP2, Tau, Katanine et Kinésine 1,2,3,4,5.
Dans les neurones, les microtubules sont essentiels au développement et au maintien des axones et des dendrites. Des anomalies dans les microtubules entraînent un dysfonctionnement et même la mort des neurones. Par exemple, dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer, l’hyperphosphorylation de la protéine Tau réduit la stabilité du réseau de microtubules, provoquant des irrégularités neurologiques6. Ainsi, l’examen des réseaux de microtubules contribuera à une compréhension du neurodéveloppement et de la pathogenèse des maladies neurologiques.
La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse périphérique formée entre une terminaison axonale de motoneurone et une fibre musculaire, qui est un système modèle excellent et puissant pour l’étude de la structure et des fonctions synaptiques7. Futsch est une protéine de la drosophile qui est homologue à la protéine de liaison aux microtubules MAP1B que l’on trouve chez les mammifères8. Il ne s’exprime que dans les neurones et joue un rôle dans le développement des boutons synaptiques de la JNM 8,9. Dans le type sauvage, les faisceaux filamenteux qui longent le centre des processus NMJ sont visualisés par immunomarquage avec un anti-Futsch. Lorsqu’il atteint l’extrémité de la JNM, ce faisceau a la capacité soit de former une boucle constituée de microtubules, soit de perdre sa structure filamenteuse, ce qui donne un aspect diffus et ponctué10. Les boucles de microtubules sont associées à des cônes de croissance en pause, ce qui suggère que le réseau de microtubules est stable11. Par conséquent, nous pouvons déterminer indirectement le développement de microtubules stables dans la JNM par coloration de Futsch. La grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Les facteurs affectant la stabilité du réseau de microtubules peuvent être trouvés en analysant la densité et la forme des microtubules. Simultanément, l’état du réseau de microtubules des cellules musculaires peut être vérifié de manière croisée avec le résultat de la JNM pour obtenir des conclusions plus complètes.
De nombreux protocoles ont été utilisés pour étudier le réseau et la dynamique des microtubules. Cependant, ces recherches se sont souvent concentrées sur des études in vitro 12,13,14,15,16. Alternativement, certaines expériences in vivo ont utilisé la microscopie électronique pour détecter le cytosquelette17. Du fait de la liaison spécifique d’anticorps marqués par fluorescence ou de colorants chimiques à des protéines ou à de l’ADN, les méthodes présentées ici permettent la détection de réseaux de microtubules dans les JNM au niveau des neurones individuels in vivo, avec des résultats corroborés par des observations dans les cellules musculaires. Ce protocole est simple, stable et reproductible lorsqu’il est combiné avec les puissants outils génétiques disponibles chez Drosophila melanogaster, permettant une gamme variée d’examens phénotypiques et de criblages génétiques pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux in vivo.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>dilué 1:200</td></tr><tr><td>Anti-décoloration amélioré Montage Moyen</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW Microscope confocal</td><td>Olympus</td> Goat anti-souris, Alexa <td></td><td></td></tr><tr><td>Fluor 488 conjugué</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>dilué 1:1 000</td></tr><tr><td>Microscope confocal laser LSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Futsch</td><td>de souris Etudes développementales Hybridoma Bank&nbsp ; &nbsp ;</td><td>22C10</td><td>dilué 1:50</td></tr><tr><td>Anticorps anti-&alpha ;-tubuline de souris</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td>dilué 1:1 000</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Wako</td><td>168-20955</td><td>Concentration finale : 4 % dans le tampon PB</td></tr><tr><td>Acier inoxydable Minutien Pins</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>0,1 mm Diam</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope SMZ161</td><td>Fluorescence</td> stéréoscopique motique <td></td><td></td></tr><tr><td> microscope BX41</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Chèvre conjuguée rouge anti-HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>dilué 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 iodure</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>dilué 1:1 000</td></tr><tr><td>Agitateur décolorant par transfert TS-8</td><td>Kylin-Bell instruments de laboratoire</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

Le réseau de microtubules est une composante essentielle du système nerveux. Des mutations dans de nombreuses protéines régulatrices des microtubules sont associées à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurologiques, telles que la protéine Tau associée aux microtubules aux maladies neurodégénératives, la protéine sectionnante des microtubules Spastin et Katanin 60 provoquent respectivement une paraplégie spastique héréditaire et des anomalies neurodéveloppementales. La détection de réseaux de microtubules dans les neurones est avantageuse pour élucider la pathogenèse des troubles neurologiques. Cependant, la petite taille des neurones et la disposition dense des faisceaux de microtubules axonaux rendent difficile la visualisation des réseaux de microtubules. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire et des cellules musculaires, ainsi que l’immunomarquage de la α-tubuline et de la protéine de Futsch associée aux microtubules pour visualiser les réseaux de microtubules chez Drosophila melanogaster. La jonction neuromusculaire nous permet d’observer à la fois les microtubules pré et post-synaptiques, et la grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Ici, en mutant et en surexprimant Katanin 60 chez Drosophila melanogaster, puis en examinant les réseaux de microtubules dans la jonction neuromusculaire et les cellules musculaires, nous révélons avec précision le rôle régulateur de Katanin 60 dans le neurodéveloppement. Par conséquent, combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Nous avons démontré une procédure étape par étape pour visualiser le réseau de microtubules dans les jonctions neuromusculaires (JNM) et les cellules musculaires. Après la dissection selon le schéma de principe (Figure 1A-E), l’immunomarquage est effectué, puis les images sont observées et recueillies sous un microscope confocal laser ou un microscope à fluorescence stéréoscopique (Figure 1F,G).
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Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Actuellement, la dynamique des microtubules est observée indirectement par l’intermédiaire de protéines de liaison aux microtubules telles que EB1. Étant donné que les hétérodimères de tubuline alphabeta sont abondants dans le cytoplasme, se replient directement, les hétérodimères de tubuline voisins n’ont pas la dynamique des réseaux de microtubules in vivo. Notre protocole permet de visualiser les microtubules dans les synapses neuromusculaires et les cellules musculaires.Lorsqu’il est combiné avec les puissants outils génétiques disponibles chez Drosophila melanogaster, il permet une gamme variée d’examens phénotypiques et le criblage génétique du rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux in vivo. Nos recherches portent sur la relation entre le cytosquelette et le neurodéveloppement, ainsi que sur ses implications pour les maladies neurologiques. Nous espérons découvrir le mécanisme du neurodéveloppement et de la parthénogenèse des maladies neurologiques en mettant en évidence l’effet des protéines régulatrices du cytosquelette sur les neurones.

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Découvrez une méthode de visualisation des réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires de larves de Drosophila melanogaster. Cette technique permet d'étudier la dynamique des microtubules et les protéines régulatrices impliquées dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

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