Name: Une approche globale pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux par dissolution du caillot, coloration cellulaire et examen sanguin. Cette approche libère les cellules intactes de la fibrine pour améliorer le diagnostic de la thrombose cérébrale.

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Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070, n° 2021Y0027).

La recherche a été réalisée conformément aux directives institutionnelles du Comité d’éthique médicale de l’Université Huaqiao. Les caillots sanguins cérébraux ont été retirés chirurgicalement et prélevés au premier hôpital de Quanzhou, affilié à l’Université médicale du Fujian, avec le consentement éclairé des patients.
1. Prétraitement des caillots sanguins
<ol><li>Placez les caillots sur un plat propre, ajoutez 5 mL de sérum physiologique à l’aide d’une pince à épiler, secouez doucement le plat et retirez le sérum physiologique à l’aide d’une pipette. REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois.</li>
	<li>Coupez les caillots en petits morceaux (moins de 5 mm x 5 mm x 5 mm) avec des ciseaux. Ajouter 5 mL de sérum physiologique, agiter doucement le plat et retirer le sérum physiologique à l’aide d’une pipette. REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois. Assurez-vous qu’aucun caillot n’est aspiré pendant le rinçage.</li>
	<li>Transférez les caillots sur une autre plaque en U propre. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici (stocker la plaque entre 2 et 8 °C) et redémarré plus tard.</li>
</ol>2. Thrombolyse
<ol><li>Préparer la solution de travail de sFE en ajustant la concentration de sFE à 2000 U/mL avec une solution saline physiologique. REMARQUE : Le sFE a été préparé selon les protocoles bien établis du Tang Lab15.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de solution de travail sFE dans les caillots prétraités.</li>
	<li>Effectuez le premier cycle de dégradation.<ol><li>Incuber le mélange de sFE et de caillots à 37 °C pendant 0,5 h. REMARQUE : Le transfert traité avec une solution saline physiologique a été défini comme témoin négatif. Ne faites pas pivoter l’échantillon sur l’agitateur.</li>
		<li>Mélangez délicatement l’échantillon. Transférez la partie liquide dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette propre. REMARQUE : Les caillots restants ont été utilisés pour une autre série de dégradations.</li>
		<li>Centrifuger la partie liquide à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Transférez le surnageant dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette pour obtenir la solution de sFE récupérée.</li>
		<li>Mélangez délicatement la précipitation cellulaire avec 50 μL de solution saline physiologique. REMARQUE : Le mélange cellulaire a été stocké entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une dégradation ultérieure.<ol><li>Dégrader les caillots restants (étape 2.3.2) avec la solution de sFE récupérée (étape 2.3.4) à 37 °C pendant 0,5 h. REMARQUE : Les étapes de repos étaient les mêmes que celles du premier cycle de dégradation. Le processus de dégradation a été terminé jusqu’à ce que l’ensemble des caillots soit dégradé.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez la collecte de cellules.<ol><li>Préparez l’échantillon de cellules sanguines en recueillant le mélange cellulaire de chaque cycle de dégradation.</li>
	</ol></li>
</ol>3. La coloration de Wright
<ol><li>Effectuer un frottis cellulaire.<ol><li>Ajustez les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/mL.</li>
		<li>Ajoutez 5 μL de cellules sur la lame de verre enduite de poly-L lysine, puis étalez-les à l’aide de la lamelle.</li>
		<li>Évaporez le liquide à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez la coloration.<ol><li>Ajouter doucement 200 μL de colorant de Wright (voir le tableau des matériaux) au frottis cellulaire et ajouter 600 μL de colorant B de Wright pour mélanger uniformément.  Colorer pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Rincez délicatement la teinture à l’eau claire. REMARQUE : Le frottis cellulaire coloré peut être conservé à température ambiante pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer de l’imagerie microscopique.<ol><li>Examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope optique (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Examen sanguin de routine
<ol><li>Ajustez les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Analysez les composants cellulaires tels que les plaquettes, les érythrocytes, les globules blancs, les lymphocytes, les neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles, les basophiles et les granulocytes immatures à l’aide d’un analyseur d’autohématologie selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>

Procédé basé sur une enzyme fibrinolytique pour étudier les composants de cellules de thrombus cérébral

<ol><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edoxaban+versus+dual+antiplatelet+therapy+for+leaflet+thrombosis+and+cerebral+thromboembolism+after+TAVR%3A+The+ADAPT-TAVR+Randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial.</a> Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).</li>
<li>Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+venous+sinus+thrombosis+incidence+is+higher+than+previously+thought%3A+a+retrospective+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study.</a> Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).</li>
<li>Sacco, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+definition+of+stroke+for+the+21st+century%3A+a+statement+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).</li>
<li>Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+villains+and+targets+in+arterial%2C+venous%2C+and+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).</li>
<li>Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li>
<li>Dhanesha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKM2+promotes+neutrophil+activation+and+cerebral+thromboinflammation%3A+therapeutic+implications+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke.</a> Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).</li>
<li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombus+neutrophil+extracellular+traps+content+impair+tpa-induced+thrombolysis+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li>
<li>Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+methodology+for+calculating+platelet+contribution+to+clot+strength+%28platelet+component%29+in+thromboelastometry+and+thrombelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography.</a> Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).</li>
<li>Daraei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber+diameter+and+porosity+measurements+of+plasma+clots+in+scanning+electron+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images.</a> Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).</li>
<li>Abbasi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+thrombus+composition+in+thrombectomy+stroke+patients+with+longer+time+to+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization.</a> Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).</li>
<li>C W Francis, a, Marder, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+clot+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concepts of clot lysis.</a> Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).</li>
<li>Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).</li>
<li>Fotso Fotso, A., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Diagnosis+of+tick-borne+african+relapsing+fevers%3A+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments.</a> Front Public Health. 3, 254(2015).</li>
<li>Liou, G. Y., Byrd, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioliquid+markers+for+pancreatic+cancer%3A+What+we+have+vs.+what+we+need%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need.</a> Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).</li>
<li>Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+a+fibrinolytic+enzyme+from+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus.</a> Journal of Visualized Experiments. 196, e65631(2023).</li>
<li>Ge, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+Nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus.</a> International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+whole+cells+and+cell+debris+using+surface+plasmon+coupled+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission.</a> Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).</li>
<li>Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+prescribing+for+adults+in+ambulatory++care+in+the+USA%2C+2007-09%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La sFE est un agent fibrinolytique qui peut dégrader la fibrine directement et efficacement12,16. Ici, la sFE a été utilisée pour dégrader la fibrine réticulée des caillots sanguins cérébraux, libérer les cellules enfermées dans les caillots et analyser qualitativement et quantitativement les composants cellulaires des caillots. Les données microscopiques et l’examen sanguin de routine ont indiqué que les cellules enfermées avaient été libérées des caillots sangu...

Les maladies cérébrovasculaires sont l’une des trois principales maladies qui peuvent menacer la santé humaine, parmi lesquelles les maladies cérébrovasculaires ischémiques représentent plus de 80%. La thrombose cérébrale et la thrombose veineuse cérébrale sont les maladies cérébrovasculaires ischémiques les plus concernées aujourd’hui, principalement causées par des caillots sanguins cérébraux 1,2. Si le traitement n’est pas effectué correctement, il aura des taux élevés d’invalidité et de mortalité et un taux de récidive élevé après la sortie3.
Récemment, un nombre croissant d’études ont montré que les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux sont étroitement corrélés au diagnostic, au traitement et au pronostic de la thrombose cérébrale 4,5,6. Par conséquent, la disponibilité de données sur la composition du thrombus, en particulier les composants cellulaires, est importante pour le diagnostic clinique et le traitement. Malheureusement, les méthodes actuellement disponibles ne permettent pas d’analyser de manière exhaustive le composant du caillot sanguin quantitativement et qualitativement. Par exemple, la coloration in situ basée sur Martius Scarlett Blue ne peut étudier que les globules rouges/blancs de certaines tranches du caillot7. La coloration in situ basée sur l’immunohistochimie (IHC) ne permet d’étudier que des composants sanguins limités de certaines tranches du caillot à l’aide de leurs anticorps8. Les méthodes basées sur l’imagerie microscopique ne s’intéressent qu’à la structure spécifique du caillot9. De plus, toutes ces méthodes sont laborieuses et chronophages10. À ce jour, les procédures permettant d’étudier quantitativement et qualitativement les composants des cellules des thrombus cérébraux n’ont pas été rapportées. Il est largement reconnu que la fibrine réticulée enveloppe étroitement les cellules sanguines dans les caillots11. Par conséquent, la dégradation spécifique de la fibrine réticulée et la libération des cellules intactes sont essentielles pour l’analyse précise des composants cellulaires.
Des travaux antérieurs ont isolé une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE), qui peut dégrader la fibrine de manière spécifique et rapide12. Ici, une méthode d’analyse des composants cellulaires des thrombus cérébraux basée sur l’activité unique de la sFE a été proposée. Ce protocole a utilisé la sFE pour dégrader d’abord la fibrine des caillots, puis a analysé les composants cellulaires par coloration de Wright et examen sanguin de routine13,14. Selon cette méthode, les composants cellulaires des thrombus cérébraux peuvent être étudiés quantitativement et qualitativement. Ce protocole simple et efficace pourrait être appliqué pour l’analyse des composants cellulaires d’autres caillots sanguins.

<table><tbody><tr><td>Plaque de réaction d’agglutination</td><td>ROTEST</td><td>RTB-4003</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d’hématologie automatique</td><td>SYSMEX</td><td>XNB2</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur automatique à vapeur à pression verticale&nbsp ;</td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger (1,5 mL)</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>Banc propre</td><td>AIRTECH</td><td>BLB-1600</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à température constante</td><td>JINGHONG</td><td>JHS-400</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture (100 mm)</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>DHG Series Four de chauffage et de séchage&nbsp ;</td><td>SENXIN</td><td>DGG-9140AD</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique électronique</td><td>DENVER</td><td>TP-213</td><td></td></tr><tr><td>Membrane filtrante (0,22 &micro ; m)</td><td>Millex GP</td><td>SLGP033NK</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifugeuse réfrigérée&nbsp ;</td>Lames de microscope <td>Cence</td><td>H1650-W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CITOGLAS</td><td>01-30253-50</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Référence</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0CN</td><td></td></tr><tr><td>Saline normale</td><td>CISEN</td><td>H37022337</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE E100</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette (1 mL</td>) <td>Axygene</td><td>T-1000XT-C</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette (200 &micro ; L)</td><td>Pipette Axygene</td><td>T-200XT-C</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>Pipette Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY18723</td><td></td></tr><tr><td>(200 &micro ; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY20280</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>MARTOR</td><td>23111</td><td></td></tr><tr><td>Oscillateur Vortex de petite taille</td><td>Kylin-Bell</td><td>VORTEX KB3</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Hystic</td><td>HKQS-180</td><td></td></tr><tr><td>Wright Staining Solution</td><td>Beyotime</td><td>C0135-500ml</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche globale pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

La thrombose cérébrale, un caillot sanguin dans une artère ou une veine cérébrale, est le type d’infarctus cérébral le plus courant. L’étude des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux est importante pour le diagnostic, le traitement et le pronostic. Cependant, les approches actuelles pour étudier les composants cellulaires des caillots sont principalement basées sur la coloration in situ , ce qui ne convient pas à l’étude complète des composants cellulaires car les cellules sont étroitement enveloppées dans les caillots. Des études antérieures ont réussi à isoler une enzyme fibrinolytique (sFE) de Sipunculus nudus, qui peut dégrader directement la fibrine réticulée, libérant les composants cellulaires. Cette étude a permis d’établir une méthode complète basée sur la sFE pour étudier les composants cellulaires du thrombus cérébral. Ce protocole comprend la dissolution du caillot, la libération des cellules, la coloration des cellules et l’examen sanguin de routine. Selon cette méthode, les composants cellulaires pourraient être étudiés quantitativement et qualitativement. Les résultats représentatifs des expériences utilisant cette méthode sont présentés.

Au stade initial du processus de dégradation, il a été constaté que les caillots sanguins avaient une structure compacte rouge et que la solution de travail était incolore. Après une incubation de 30 minutes, la solution de travail est devenue rouge clair, ce qui indique que les cellules sanguines croisées ont été libérées dans la solution de travail. La plupart des caillots ont été dissous lors de l’allongement du temps d’incubation à 5 h, et la solution de travail est devenue rouge clair. Au contraire, il n’y a pas eu ...

Cette étude décrit une méthode rapide et efficace pour l’analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux par la dissolution des caillots, la coloration cellulaire et l’examen sanguin de routine.

Une approche globale pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Nos recherches portent principalement sur la thrombose cérébrale. De nombreuses études ont montré que les composants des cellules du caillot sanguin cérébral sont en corrélation avec le diagnostic, le traitement et le pronostic de la thrombose cérébrale. Dans cette étude, nous avons établi une nouvelle méthode pour l’analyse de la composante cellulaire des caillots sanguins cérébraux.Ce défi dans l’analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux est la libération de la tige entière des caillots sanguins. C’est parce que les caillots ont fui des éruptions cutanées de fibrage, les cellules sanguines dans les caillots. Il est préférable d’adopter des approches ciblées pour démarrer les composants cellulaires des caillots en position C2, ce qui ne convient pas au démarrage complet des composants cellulaires.Au contraire, notre méthode permet d’éclairer à la fois quantitativement et qualitativement les composants cellulaires de la pente cérébrale. Notre méthode utilise l’enzyme fibrinolytique pour retarder le fibrage des caillots sanguins, libérant ainsi les cellules intactes. Les données obtenues à partir de l’analyse des composants cellulaires faciliteront l’étude d

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Source : Kim, D., et. al. Imagerie fluorescente proche infrarouge combinée et micro-tomodensitométrie pour la visualisation directe de thromboembolis cérébraux. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre la visualisation d’un thrombus cérébral chez la souris à l’aide de l’imagerie par micro-tomodensitométrie (micro-CT). Un modèle de souris à thrombus cérébral est injecté avec des nanoparticules d’or ciblées sur la fibrine agissant comme un agent de contraste. La souris est placée sur le lit d’un...

Visualisation d’un thrombus cérébral chez une souris à l’aide de l’imagerie par micro-tomodensitométrie

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Combiné proche infrarouge imagerie fluorescente et la tomographie par Micro-calculé pour Directement Visualizing cérébrale thromboembolies

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