Étudier l’initiation de la mort cellulaire à l’aide d’un microscope numérique
10 novembre 2023
Nous présentons ici un protocole d’étude du taux d’initiation de la mort cellulaire programmée par imagerie en continu des feuilles inoculées après l’induction de la mort cellulaire.
Pour commencer, transférez les plants de pommes de terre infectés par le virus dans une chambre de croissance maintenue à 22 degrés Celsius. Choisissez une plante pour l’observation et utilisez du ruban adhésif pour immobiliser complètement la deuxième feuille inoculée. Ensuite, connectez le microscope numérique à l’ordinateur et lancez le logiciel de capture d’image.
Placez la feuille sous le microscope. Utilisez ensuite le cadran pour faire la mise au point sur la surface de la feuille. Pour régler les paramètres de l’appareil photo, cliquez sur le bouton Paramètres.
Réglez maintenant la luminosité sur 64, le contraste sur 14 et la teinte sur zéro. Ensuite, réglez la balance des blancs, puis réglez la saturation sur 47, la netteté sur zéro et le gamma sur cinq. Cliquez sur l’icône de capture d’image et sélectionnez l’option vidéo accélérée.
Ensuite, définissez la capture d’image toutes les 15 minutes pour un total de 24 heures. Appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer la capture d’image. Pour enregistrer les images capturées, sélectionnez toutes les images et cliquez sur l’icône d’enregistrement.
Choisissez maintenant les options d’exportation, puis définissez les points par pouce au maximum. Une fois enregistrées, supprimez toutes les images du programme. Pour éditer les images, lancez un logiciel de retouche comme ImageJ.
Cliquez sur fichier, puis sélectionnez importer, et choisissez séquence d’images pour importer les séquences temporelles d’images à partir d’un seul champ de vision. Collez le chemin du répertoire des images enregistrées, puis appuyez sur OK. Une fois la conversion terminée, ImageJ lancera automatiquement un lecteur vidéo interne affichant la vidéo terminée.
Cliquez sur fichier, puis enregistrez sous et sélectionnez le format AVI pour exporter le fichier vidéo. Lorsqu’une petite fenêtre s’ouvre, réglez la fréquence d’images sur 0,3 FPS, puis appuyez sur OK pour enregistrer la vidéo en tant que fichier AVI. Des plants de pommes de terre inoculés âgés de trois à quatre semaines avec au moins trois à quatre feuilles complètement développées ont été utilisés pour l’analyse microscopique numérique.
La même zone sur la feuille inoculée a été observée à des intervalles de 15 minutes pour déterminer l’apparition et l’expansion de la lésion au fil du temps. Après 14 heures d’observation, aucune lésion n’était visible. Environ 90 minutes plus tard, une lésion visible a été enregistrée.
La lésion a commencé à s’étendre deux heures plus tard et s’est poursuivie au cours des huit heures et demie suivantes.
Aperçu
Cette étude examine la vitesse d'initiation de la mort cellulaire programmée chez les plants de pomme de terre en utilisant un protocole d'imagerie continue pour observer les feuilles inoculées. La méthode permet une détermination précise du moment de la formation des lésions, offrant ainsi des informations sur la dynamique de la résistance cachée par réponse hypersensible.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Initiation de la mort cellulaire
- Réponse hypersensible
- Biologie végétale
Contexte
- La mort cellulaire programmée est un mécanisme de défense essentiel chez les plantes.
- L'étude utilise des plants de pomme de terre comme système modèle.
- L'identification du moment de la mort cellulaire peut améliorer la compréhension de l'immunité végétale.
Méthodes utilisées
- Imagerie continue des feuilles inoculées
- Utilisation de plants de pomme de terre comme modèle biologique
- Analyse microscopique pour l'observation en temps réel du développement des lésions
Résultats principaux
- Les lésions sont devenues visibles environ 90 minutes après l'inoculation initiale.
- L'expansion des lésions a été suivie pendant une période de 8,5 heures.
- La méthode permet un enregistrement en laps de temps haute résolution de la progression de la maladie.
Conclusions
- Ce protocole quantifie efficacement les taux d'initiation de la mort cellulaire chez les plants de pomme de terre.
- Il constitue un outil précieux pour des recherches approfondies sur les défenses végétales contre les agents pathogènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification précise de l'initiation de la mort cellulaire dans les systèmes végétaux permet des tests d'hypothèses robustes concernant les déterminants génétiques et moléculaires de la réponse hypersensible. La microscopie numérique à haute résolution renforce la confiance prédictive dans l'identification des composants qui modulent la mort cellulaire programmée, influant directement sur la découverte précoce et la validation de cibles en biotechnologie végétale. Cette capacité renforce les décisions stratégiques en permettant une évaluation rapide et reproductible de la fonction des gènes candidats dans des systèmes pertinents pour les maladies.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse des facteurs génétiques et moléculaires influant sur l'initiation de la mort cellulaire.
- Permet la validation fonctionnelle des gènes de résistance et des composants des voies de signalisation.
- Facilite la caractérisation mécanistique des risques en reliant la perturbation génique à des résultats phénotypiques.
- Améliore la fiabilité prédictive pour la sélection de cibles candidates dans les filières de résistance aux maladies des plantes.
Développement de tests et criblage
- Fournit des sorties d'imagerie quantitatives normalisées pour le développement de tests.
- Permet la mesure reproductible des taux d'initiation et d'expansion des lésions.
- Facilite l'extensibilité et la réutilisation de la plateforme à travers différents pathosystèmes avec de légères modifications du protocole.
- Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages en aval de composés ou génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats phénotypiques avec les mécanismes de mort cellulaire programmée pertinents pour la maladie.
- Assure la continuité depuis la découverte génétique jusqu'à la validation préclinique dans des modèles végétaux.
- Permet la progression ajustée au risque des caractères de résistance ou des éditions géniques dans les voies d'amélioration des cultures.
- Offre des connaissances mécanistiques pour le développement translationnel de biomarqueurs dans la recherche sur la défense des plantes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de microscopie numérique s'intègre à la continuité découverte-précoce à validation, permettant un test rapide d'hypothèses et une évaluation fonctionnelle de gènes candidats ou de traitements dans les systèmes végétaux.
- Découverte en biologie : Permet de tester l'hypothèse nulle concernant la fonction des gènes dans l'initiation de la mort cellulaire.
- Criblage : Fournit des données reproductibles et quantitatives sur le moment d'apparition et l'expansion des lésions, prêtes à être utilisées dans les tests.
- Analyse : Offre des mesures résolues dans le temps pour comparer des conditions génétiques ou des traitements.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes fondamentales à leur validation préclinique dans des modèles végétaux pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un flux de travail d'imagerie souple et rentable, adaptable à plusieurs pathosystèmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats d'imagerie standardisés, évolutifs et reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et d'avancer efficacement le portefeuille avec un usage optimal du capital.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des interventions génétiques ou moléculaires en recherche et développement végétal.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de tissus végétaux et en utilisation de la microscopie numérique.
- Suppose un accès à des chambres de croissance contrôlées et à une infrastructure d'imagerie en temps réel.
- Exige une standardisation inter-équipes des intervalles d'acquisition d'images et des paramètres d'analyse.
- Adaptable à diverses espèces végétales et systèmes pathosystèmes moyennant de légers ajustements du protocole.
- Dépend de conditions environnementales constantes pour des résultats reproductibles.
