Cristallisation ABCG5/G8 dans un environnement bicellaire lipidique pour la cristallographie aux rayons X
25 août 2023
Ce protocole décrit une configuration pour la cristallisation du transporteur de stérols ABCG5/G8. ABCG5/G8 est reconstitué en bicelles pour la cristallisation en gouttes suspendues. Le protocole ne nécessite pas de matériaux ou de substrats spécialisés, ce qui le rend accessible et facile à adapter dans n’importe quel laboratoire pour déterminer la structure de la protéine par cristallographie aux rayons X.
Bonjour, mon équipe étudie le type de perte de protéines à travers la membrane cellulaire, et nous examinons la relation avec la médecine et la biologie. Plus précisément, nous examinons une protéine particulière qui nécessiterait de l’ATP pour piloter sa fonction, puis le nom est appelé transporteur de cassette de liaison à l’ATP. En particulier, nous examinons leur relation structure-fonction fondamentale, puis nous l’utilisons pour comprendre un grand nombre de maladies chroniques, en particulier les maladies cardiovasculaires.
En raison de la complexité de la purification des protéines membranaires et de leur stabilité à des températures natives, l’obtention de cristaux de protéines 3D est le principal défi dans le domaine, et cela limite également les applications de découverte de médicaments. Notre équipe a mis au point des méthodes de cryo-EM et de cristallographie aux rayons X pour l’étude structurale des protéines transporteuses membranaires. Et auparavant, notre laboratoire avait également résolu la structure cristalline du premier hétérodimère obligatoire ABCG5/G8 humain, à la fois dans les états apo et liés au cholestérol.
Nos résultats peuvent constituer une percée dans la découverte de médicaments à petites molécules ou dans la réaffectation de médicaments. L’obtention de cristaux de protéines 3D peut également permettre des expériences de trempage pour la cocristallisation de complexes protéiques et ligands. Notre laboratoire vise à déterminer les bases moléculaires de la reconnaissance et de la translocation des lipides par les protéines transporteuses lipidiques dépendantes de l’ATP.
Et nous visons également à établir de nouvelles méthodes dans le développement de médicaments pour étudier la dynamique moléculaire et les aspects structurels des transporteurs ABC.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de cristallisation du transporteur de stérols ABCG5/G8, utilisant des bicelles pour la cristallisation en goutte suspendue. L'approche est conçue pour être simple et adaptable à divers environnements de laboratoire, facilitant la détermination de la structure protéique par cristallographie aux rayons X.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie structurale
- Protéines de transport membranaires
Contexte
- ABCG5/G8 est un transporteur de la famille des cassette de liaison à l'ATP impliqué dans le transport des lipides.
- Comprendre sa structure est essentiel pour obtenir des informations sur les maladies chroniques, en particulier les affections cardiovasculaires.
- Les difficultés liées à la purification des protéines membranaires entravent les efforts de découverte de médicaments.
- Des études antérieures ont élucidé la structure cristalline d'ABCG5/G8 dans divers états.
Objectif de l'étude
- Étudier les bases structurales de la reconnaissance et de la translocation des lipides par les transporteurs ABC.
- Développer de nouvelles méthodologies pour la découverte de médicaments liées aux protéines membranaires de transport.
- Permettre des expériences de cocristallisation pour l'étude des interactions protéine-ligand.
Méthodes utilisées
- Modification chimique de fractions protéiques par méthylation réductrice.
- Utilisation de colonnes au nickel NTA pour la purification des protéines.
- Préparation d'une solution mère de lymphocytes B pour la cristallisation.
- Méthode de diffusion de vapeur en goutte suspendue pour le montage de la cristallisation.
Résultats principaux
- Une cristallisation réussie de ABCG5/G8 observée en une à deux semaines.
- Les cristaux adaptés à la collecte de données mesuraient typiquement 50 microns sur 100 microns sur 2 microns.
- La méthodologie permet des études supplémentaires sur les interactions lipidiques et le développement de médicaments.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la relation structure-fonction des transporteurs ABC.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour étudier la structure de ABCG5/G8.
- Les résultats pourraient faciliter des progrès dans la découverte de médicaments pour les maladies associées.
- Les travaux futurs porteront sur l'exploration des dynamiques des mécanismes de transport des lipides.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La détermination de la structure à haute résolution de ABCG5/G8 dans un environnement de bicelle lipidique permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans la découverte de médicaments ciblant les protéines membranaires. Cette approche améliore la confiance prédictive dans la validation des cibles et soutient la réduction des risques mécanistiques pour les portefeuilles axés sur les transporteurs. Une cristallisation fiable des transporteurs ABC permet une conception de ligands guidée par la structure et accélère les décisions de criblage en phase précoce.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'étude des mécanismes des transporteurs lipidiques dépendants de l'ATP à une résolution atomique.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles en préservant la conformation native des protéines dans des environnements de bicelles.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques pour les cibles transporteurs impliquées dans les maladies chroniques.
- Fournit des modèles structuraux pour le triage orienté par hypothèses des portefeuilles de projets.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des cristaux protéiques validés, adaptés aux études de trempage de ligands et de co-cristallisation.
- Standardise la préparation des protéines membranaires pour des protocoles de criblage reproductibles en aval.
- Permet une évaluation quantitative des interactions protéine-ligand par cristallographie aux rayons X.
- Facilite le développement d'essais évolutifs pour des bibliothèques de composés ciblant les transporteurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Associe les données structurales à la fonction des transporteurs pertinents pour les maladies dans la recherche cardiovasculaire.
- Assure une continuité entre la découverte moléculaire et la validation préclinique des modulateurs de transporteurs.
- Réduit les risques de translation en alimentant des études biomarqueurs et mécanistiques.
- Permet une conception rationnelle de modèles précliniques fondée sur les relations structure-fonction des transporteurs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de cristallisation basée sur les bicelles s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification des composés candidats et la recherche préclinique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies fonctionnelles des transporteurs ABC.
- Criblage : Fournit des cristaux reproductibles et de haute qualité pour le criblage fondé sur la structure et l'évaluation de ligands.
- Analytique : Permet des lectures structurales quantitatives pour comparer les états liés aux ligands et les états apo.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la structure moléculaire et l'activité des transporteurs pertinents pour les maladies, ainsi que l'alignement avec les biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour la cristallisation de diverses protéines membranaires dans les voies de découverte de médicaments.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles transporteurs.
- Valeur opérationnelle : Normalise la cristallisation des protéines membranaires pour assurer la reproductibilité et l'extensibilité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital dans les programmes centrés sur les transporteurs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles transporteurs et la progression d'actifs guidés par la structure.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les techniques de purification et de cristallisation des protéines membranaires.
- Exige un accès à une infrastructure analytique pour la diffraction des rayons X et la caractérisation des protéines.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des bicelles et de cristallisation.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les familles de transporteurs ou les compositions lipidiques.
- La stabilité et le rendement de la protéine peuvent limiter le débit et la possibilité de passage à l'échelle dans certains systèmes.
