Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique
27 octobre 2023
Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.
Nous travaillons sur la découverte de biomarqueurs à base de vésicules extracellulaires. Une étape importante consiste à les isoler efficacement et de manière sélective. EVtrap, qui est basé sur la séparation à base de billes magnétiques, peut vraiment nous aider en fournissant un débit élevé, facile à utiliser, en particulier, facile pour les applications cliniques.
Nous avons utilisé ce protocole pour la découverte de protéines et de biomarqueurs phosphoprotéiques pour différentes maladies telles que le cancer du sein, les cancers du rein et la maladie de Parkinson. Ce biomarqueur est dérivé d’un biofluide. Les VE peuvent potentiellement être utilisés pour les biopsies liquides, ce qui peut encore améliorer le diagnostic clinique et le traitement.
À l’heure actuelle, l’approche la plus couramment utilisée pour l’isolement des vésicules extracellulaires est l’ultracentrifugation et la précipitation, mais ces méthodes se limitent à la co-isolation des contaminants et sont également peu efficaces. Ainsi, notre méthode EVtrap fournira un moyen plus efficace d’isoler les VE, ce qui permettra une méthode plus reproductible et plus sensible et bénéficiera également à l’analyse en aval. Nous travaillons sur deux choses.
Tout d’abord, nous poursuivons le développement de méthodes et de protocoles pour l’isolation des véhicules électriques et une analyse en aval, en particulier une analyse basée sur la sauvegarde de masse. Deuxièmement, nous explorons différentes applications dans le domaine clinique en raison de l’avantage de l’EVtrap.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires (EV) à l'aide de billes magnétiques fonctionnalisées. Il détaille également les analyses subséquentes telles que le western blotting, la protéomique et la phosphoprotéomique, qui sont essentielles pour la découverte de biomarqueurs.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Découverte de biomarqueurs
- Vésicules extracellulaires
Contexte
- Les vésicules extracellulaires sont importantes pour les biopsies liquides.
- Elles peuvent fournir des informations sur diverses maladies.
- Un isolement efficace est crucial pour les applications cliniques.
- Les protéines et phosphoprotéines des biofluides sont des biomarqueurs potentiels.
Objectif de l'étude
- Accélérer la découverte de biomarqueurs.
- Isoler les EV efficacement et sélectivement.
- Améliorer le diagnostic et le traitement cliniques.
Méthodes utilisées
- Isolation des vésicules extracellulaires urinaires à l'aide de billes magnétiques.
- Western blotting pour l'analyse des protéines.
- Protéomique et phosphoprotéomique pour l'identification des biomarqueurs.
- Méthodes à haut débit pour les applications cliniques.
Résultats principaux
- Isolation réussie des EV à partir de biofluides.
- Identification de protéines et de phosphoprotéines liées aux maladies.
- Potentiel démontré pour les applications de biopsie liquide.
- Facilitation de la découverte de biomarqueurs pour les cancers et la maladie de Parkinson.
Conclusions
- Le protocole améliore l'efficacité de l'isolement des EV.
- Il soutient la découverte de biomarqueurs cliniquement pertinents.
- Potentiel d'amélioration des stratégies diagnostiques et thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Efficient and selective isolation of extracellular vesicles (EVs) from biofluids is a critical inflection point for proteomics-driven biomarker discovery in biopharma R&D. This chemical affinity-based magnetic bead protocol enables high-yield, reproducible EV isolation, directly supporting quantitative proteomic and phosphoproteomic analyses essential for early disease detection and target validation. The method enhances predictive confidence in translational biomarker pipelines and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of disease-relevant protein and phosphoprotein signatures from patient-derived biofluids.
- Supports functional target validation by providing high-quality EV cargo for downstream mechanistic studies.
- Facilitates biological de-risking through reproducible and quantitative molecular profiling.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-purity EV preparations suitable for quantitative mass spectrometry workflows.
- Improves assay reproducibility and sensitivity by minimizing contaminants and maximizing EV yield.
- Enables scalable preparation of EV samples for high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by capturing real-time molecular snapshots from clinical biofluids.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent EV proteome and phosphoproteome analysis.
- Provides mechanistic de-risking for candidate biomarkers prior to clinical development.
Pipeline & Workflow Integration
This EV isolation protocol integrates at the interface of early discovery and translational research, bridging sample preparation with quantitative proteomics and phosphoproteomics analysis.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling access to EV-derived molecular cargo.
- Screening: Provides reproducible, quantitative EV samples for downstream assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports high-throughput, statistically robust measurement of protein and phosphoprotein abundance across conditions.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity from patient samples to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable EV isolation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable EV isolation for proteomics workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, phosphoproteomics, and EV biology for optimal execution and data interpretation.
- Demands access to magnetic bead-based separation systems and high-resolution mass spectrometry platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptable to various biofluid types but may require optimization for different matrices.
- Quantitative reproducibility and sensitivity are dependent on rigorous protocol adherence and analytical calibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
