Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique
27 octobre 2023
Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.
Nous travaillons sur la découverte de biomarqueurs à base de vésicules extracellulaires. Une étape importante consiste à les isoler efficacement et de manière sélective. EVtrap, qui est basé sur la séparation à base de billes magnétiques, peut vraiment nous aider en fournissant un débit élevé, facile à utiliser, en particulier, facile pour les applications cliniques.
Nous avons utilisé ce protocole pour la découverte de protéines et de biomarqueurs phosphoprotéiques pour différentes maladies telles que le cancer du sein, les cancers du rein et la maladie de Parkinson. Ce biomarqueur est dérivé d’un biofluide. Les VE peuvent potentiellement être utilisés pour les biopsies liquides, ce qui peut encore améliorer le diagnostic clinique et le traitement.
À l’heure actuelle, l’approche la plus couramment utilisée pour l’isolement des vésicules extracellulaires est l’ultracentrifugation et la précipitation, mais ces méthodes se limitent à la co-isolation des contaminants et sont également peu efficaces. Ainsi, notre méthode EVtrap fournira un moyen plus efficace d’isoler les VE, ce qui permettra une méthode plus reproductible et plus sensible et bénéficiera également à l’analyse en aval. Nous travaillons sur deux choses.
Tout d’abord, nous poursuivons le développement de méthodes et de protocoles pour l’isolation des véhicules électriques et une analyse en aval, en particulier une analyse basée sur la sauvegarde de masse. Deuxièmement, nous explorons différentes applications dans le domaine clinique en raison de l’avantage de l’EVtrap.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires (EVs) à l'aide de billes magnétiques fonctionnalisées. Il détaille également les analyses ultérieures telles que le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique, essentielles pour la découverte de biomarqueurs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Découverte de biomarqueurs
- Vésicules extracellulaires
Contexte
- Les vésicules extracellulaires sont importantes pour les biopsies liquides.
- Elles peuvent fournir des informations sur diverses maladies.
- Une isolation efficace est cruciale pour les applications cliniques.
- Les protéines et les phosphoprotéines provenant de liquides biologiques sont des biomarqueurs potentiels.
Objectif de l'étude
- Accélérer la découverte de biomarqueurs.
- Isoler sélectivement et efficacement les VES.
- Améliorer le diagnostic et le traitement cliniques.
Méthodes utilisées
- Isolation de vésicules extracellulaires urinaires à l'aide de billes magnétiques.
- Immunotransfert Western pour l'analyse protéique.
- Protéomique et phosphoprotéomique pour l'identification de biomarqueurs.
- Méthodes à haut débit pour les applications cliniques.
Résultats principaux
- Isolation réussie des vésicules extracellulaires à partir de liquides biologiques.
- Identification de protéines et de phosphoprotéines associées à des maladies.
- Potentiel démontré pour les applications de biopsie liquide.
- Facilitation de la découverte de biomarqueurs pour les cancers et la maladie de Parkinson.
Conclusions
- Le protocole améliore l'efficacité de l'isolement des VEs.
- Il favorise la découverte de biomarqueurs cliniquement pertinents.
- Potentiel pour améliorer les stratégies diagnostiques et thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'isolement efficace et sélectif des vésicules extracellulaires (EVs) à partir de biofluides constitue un point critique pour la découverte de biomarqueurs guidée par la protéomique dans la recherche et le développement en biopharmacie. Ce protocole fondé sur l'affinité chimique utilisant des billes magnétiques permet un isolement reproductible des EVs avec un rendement élevé, soutenant directement des analyses protéomiques et phosphoprotéomiques quantitatives essentielles à la détection précoce des maladies et à la validation des cibles. La méthode améliore la fiabilité prédictive des pipelines de biomarqueurs translationnels et favorise l'avancement des portefeuilles ajusté au risque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une analyse rigoureuse de signatures protéiques et de phosphoprotéines pertinentes pour la maladie à partir de biofluides provenant de patients.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles en fournissant une cargaison de vésicules extracellulaires de haute qualité pour des études mécanistiques en aval.
- Permet une détection biologique des risques grâce à un profilage moléculaire reproductible et quantitatif.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des préparations standardisées d'EV de haute pureté, adaptées aux protocoles de spectrométrie de masse quantitative.
- Améliore la reproductibilité et la sensibilité des tests en minimisant les contaminants et en maximisant le rendement en EV.
- Permet une préparation évolutive d'échantillons d'EV pour le criblage à haut débit et la réutilisation de la plateforme.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies biomarqueurs translationnelles en capturant des instantanés moléculaires en temps réel à partir de biofluides cliniques.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en facilitant une analyse cohérente du protéome et du phosphoprotéome des vésicules extracellulaires (EV).
- Offre une détection mécanistique des risques pour les biomarqueurs candidats avant leur développement clinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'isolement des VES s'intègre à l'interface entre la découverte précoce et la recherche translationnelle, en reliant la préparation des échantillons à l'analyse protéomique et phosphoprotéomique quantitative.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant l'accès à la charge moléculaire dérivée des vésicules extracellulaires (EV).
- Écrantage : Fournit des échantillons reproductibles et quantitatifs de vésicules extracellulaires pour le développement d'essais ultérieurs et l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure haut débit et statistiquement robuste de l'abondance des protéines et des phosphoprotéines selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Permet l'alignement et la continuité des biomarqueurs depuis les échantillons de patients jusqu'aux modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité standardisée et évolutive d'isolement des vésicules extracellulaires pour divers programmes de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la découverte de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Permet une isolation normalisée, reproductible et évolutible des vésicules extracellulaires (EV) dans les protocoles de protéomique.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions « aller/arrêt » et l'efficacité du capital en permettant un profilage moléculaire robuste.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des candidats biomarqueurs et thérapeutiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en protéomique, en phosphoprotéomique et en biologie des vésicules extracellulaires pour une exécution optimale et une interprétation correcte des données.
- Exige un accès à des systèmes de séparation basés sur des billes magnétiques et à des plateformes de spectrométrie de masse à haute résolution.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de manipulation des échantillons et des analyses afin d'assurer la reproductibilité.
- Adaptable à divers types de biofluides, mais peut nécessiter une optimisation selon les matrices.
- La reproductibilité quantitative et la sensibilité dépendent d'un strict respect du protocole et d'un étalonnage analytique rigoureux.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
