Name: Le dosage des micronoyaux sur du sang total cryoconservé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Apprenez le dosage des micronoyaux sur sang total cryoconservé pour évaluer les dommages à l'ADN induits par les radiations ionisantes. Cette méthode optimise l'analyse cytogénétique à grande échelle.

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Les auteurs remercient L. Pieters, T. Thiron et G. De Smet pour leur soutien technique. Nous sommes reconnaissants envers tous les bénévoles qui ont donné du sang pour l’étude. Les travaux ont été soutenus financièrement par la Fondation pour la recherche en Flandre (FWO) dans le cadre d’une subvention (T000118N).

Pour cette étude, des échantillons de sang ont été prélevés par ponction veineuse auprès de 30 donneurs sains âgés de 17 à 65 ans. Les données MN de 20 donneurs ont été réutilisées à partir de l’article de Beyls et al.8 Le prélèvement des échantillons de sang est conforme aux directives du Comité d’éthique de l’Hôpital universitaire de Gand (numéro d’enregistrement : 2019/1565), Belgique. Le consentement éclairé écrit de tous les participants a été obtenu. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole.
1. Prélèvement d’échantillons de sang
<ol><li>Avant de commencer, assurez-vous que le consentement éclairé écrit des participants est disponible et que les directives éthiques sont correctement suivies.</li>
	<li>Recueillir le sang dans des tubes Li-Heparine et conserver à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit prêt à être traité pour la cryoconservation.</li>
</ol>2. Cryoconservation du sang total
REMARQUE : Toutes les étapes jusqu’à la récolte des cellules sont effectuées de manière aseptique dans un flux d’air laminaire stérile.
<ol><li>Pour cryoconserver 1 mL de sang, préparez 1 mL de milieu de congélation en mélangeant 800 μL de sérum de veau fœtal (FCS) et 200 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). REMARQUE : Le milieu de congélation est préparé dans un volume égal aux échantillons de sang qui doivent être congelés.</li>
	<li>Pour la cryoconservation du sang total, transférer l’échantillon de sang du tube hépariné dans des tubes à centrifuger de 15 ou 50 ml REMARQUE : La capacité du tube dépend du volume de sang.</li>
	<li>Faire tourbillonner le sang à basse vitesse avec l’ajout continu mais goutte à goutte d’un volume égal de milieu de congélation.</li>
	<li>Transférer 2 mL de mélange de congélation de sang dans des flacons cryogéniques (2 mL) où chaque aliquote contient 1 mL d’échantillon de sang mélangé à 1 mL de mélange de congélation.</li>
	<li>Congélation progressive par étapes<ol><li>Transférez les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique contenant de l’isopropanol et mettez-les au congélateur (-80 °C) pendant la nuit.</li>
		<li>Transférez les flacons cryogéniques à l’azote liquide pour une utilisation à long terme.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Décongélation du sang cryoconservé
REMARQUE : Pour limiter la durée totale du processus de décongélation, un maximum de 8 flacons cryogéniques (2 ml chacun) doivent être manipulés à la fois.
<ol><li>Préparation<ol><li>Préchauffer 200 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C avant de décongeler le sang.</li>
		<li>Préparer une solution de travail du milieu de culture requis dans des conditions stériles. S’assurer que le milieu par culture comprend 1,6 mL de milieu complet : milieu du Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) complété par de la pénicilline/streptomycine (0,5 %), 0,2 mL de FCS, 20 μL de pyruvate de sodium et 2 μL de β-mercaptoéthanol. REMARQUE : Étant donné qu’un nombre important de cellules sanguines peuvent être perdues lors de la décongélation, le sang décongelé est mis en culture dans de petits puits comme des plaques à 24 puits d’un volume total de 2 mL. Une plaque multipuits par dose est utilisée.</li>
		<li>Pour chaque puits de culture, indiquez le code du donneur et A/B sur le couvercle ainsi que la date et la dose, comme suggéré ci-dessous (figure 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig01.jpg"> Figure 1 : Disposition suggérée d’une plaque à 24 puits pour la culture du sang total pour l’analyse du micronoyau. Marquez les puits et indiquez les codes des donneurs aux endroits appropriés sur le couvercle. Pour chaque échantillon de patient, les puits en double doivent être adjacents les uns aux autres. Notez qu’il s’agit d’une disposition suggestive pour un collimateur 10 x 10 et qu’elle peut être modifiée en fonction de la taille du collimateur ou des échantillons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2"><li>Étapes de la décongélation et de la culture du sang total<ol><li>Chauffer le bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Retirez les flacons cryogéniques nécessaires de l’azote liquide (le nombre dépend des besoins, comme le nombre de doses). REMARQUE : Un cryoflacon contient 1 mL de sang et 1 mL de milieu de congélation. Par conséquent, deux cultures peuvent être mises en place avec du sang provenant d’un seul cryoflacon.</li>
		<li>Décongelez partiellement les flacons cryogéniques dans le bain d’eau chaude (jusqu’à ce que de petits cristaux de glace soient encore visibles).</li>
		<li>Sortez les flacons du bain-marie et nettoyez l’extérieur des flacons avec du papier de soie stérile.</li>
		<li>Dans une hotte à flux d’air laminaire stérile, ouvrez les flacons très lentement pour éviter que les bulles d’air formées à l’intérieur des tubes ne se répandent.</li>
		<li>Remettre en suspension le contenu de chaque flacon et le transférer individuellement dans un tube à centrifuger conique de 15 ml (1 tube par flacon).</li>
		<li>Ajouter goutte à goutte 1 mL de PBS chaud (37 °C) dans les tubes respectifs tout en remuant doucement le tube. Remise en suspension à l’aide d’une pipette P1000.</li>
		<li>Pour une dilution et un lavage uniforme, ajouter goutte à goutte 7 mL de PBS préchauffé (37 °C) et remettre en suspension avec une pipette P1000.</li>
		<li>Centrifuger le sang pendant 8 min à 180 × g (avec réglage à l’accélération 1, frein 1) à température ambiante.</li>
		<li>Au cours de cette étape d’attente, remplissez les puits vides (autres que celui où les cellules seront cultivées) avec 500 μL de PBS.</li>
		<li>Replacez les plaques de puits dans l’incubateur pour les préchauffer.</li>
		<li>Une fois la centrifugation terminée, retirez délicatement le surnageant, en laissant environ 1 mL pour éviter de perturber la pastille cellulaire.</li>
		<li>Remettre la pastille en suspension dans le surnageant restant à l’aide d’une pipette P1000.</li>
		<li>Ajouter 8 mL de PBS chaud (37 °C) dans les tubes respectifs tout en remuant doucement les tubes. Ensuite, remettez en suspension avec une pipette P1000.</li>
		<li>Centrifuger le sang remis en suspension pendant 8 min à 180 × g (avec réglage à l’accélération 9, frein 9).</li>
		<li>Au cours de cette étape d’attente, transvaser 200 μL de milieu de culture dans chacun des puits marqués.</li>
		<li>Conservez les plaques dans l’incubateur pour qu’elles restent à 37 °C.</li>
		<li>Après la centrifugation, retirer le surnageant dans un mouvement continu (pour éviter de perturber la pastille de cellules libres), mais laisser environ 80 μL de surnageant.</li>
		<li>Ajouter 280 μL de FCS (température ambiante) à la pastille et remettre en suspension (jusqu’à un volume total de 360 μL).</li>
		<li>Transférer 180 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits et remettre en suspension (= 0,5 mL de « sang »/culture). Le volume total dans chaque puits est maintenant de 380 μL, ce qui donne une couche moyenne de 2 mm.</li>
		<li>Incuber les plaques dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant au moins 10 min avant l’irradiation.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dosage G0 MN
<ol><li>Sortez les plaques de l’incubateur et irradiez la culture cellulaire avec les doses requises telles que des rayons X de 0,5, 1 et 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) à température ambiante. Utiliser des échantillons simulés irradiés comme témoins pour identifier les rendements spontanés de MN.</li>
	<li>Immédiatement après l’irradiation, ajouter 1,62 mL de milieu de culture (37 °C) dans chaque puits.</li>
	<li>Pour stimuler la division cellulaire dans les lymphocytes T, ajoutez 40 μL de phytohémagglutinine (PHA) dans chaque puits et remettez-les en suspension soigneusement.</li>
	<li>Remettez ces plaques dans l’incubateur (5% CO2, 37 °C). REMARQUE : Ce sera l’heure de début de l’essai.</li>
	<li>Bloquer la cytokinèse 23 h après la stimulation en ajoutant 8 μL de cytochalasine B (6 μg/mL) par puits et remettre en suspension correctement.</li>
	<li>Récoltez les cultures cellulaires 70 h après la stimulation/le temps de culture. Remettre les cellules en suspension et les transférer dans un tube de 15 ml. Rincez chaque puits avec 2 mL de PBS et ajoutez ce PBS dans le tube respectif de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes pendant 8 min à 180 × g, à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant, mais laisser environ 500 μL sur la pastille.</li>
	<li>Faire tourbillonner la pastille (à pleine vitesse) et, tout en faisant vortex, ajouter lentement 2 mL de chlorure de potassium froid (KCl, 4 °C).</li>
	<li>Centrifuger immédiatement les cellules à 180 × g pendant 8 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, en laissant environ 500 μL de surnageant.</li>
	<li>Tourbillonnez la pastille (à pleine vitesse) et pendant le vortex, ajoutez lentement 2 mL de fixateur froid 1 (solution méthanol/acide acétique/Ringer dans un rapport de 4 :1 :5).</li>
	<li>Laisser les tubes d’échantillons toute la nuit à 4 °C (minimum 12 h et maximum 96 h).</li>
	<li>Centrifuger pendant 8 min à 180 × g.</li>
	<li>Jeter le surnageant.</li>
	<li>Faire tourbillonner la pastille (à pleine vitesse) et, tout en effectuant le vortex, ajouter lentement 2 mL de fixateur froid 2 (méthanol/acide acétique dans un rapport de 4 :1).</li>
	<li>Centrifuger pendant 8 min à 180 × g.</li>
	<li>Jeter le surnageant.</li>
	<li>Faire vortex la pastille (à pleine vitesse) puis ajouter lentement (goutte à goutte), tout en vortexant, 2 mL de fixateur froid 2 à la pastille.</li>
	<li>Laisser les tubes d’échantillons à 4 °C (minimum 12 h et maximum 96 h).</li>
	<li>Nettoyez les lames avec de l’isopropanol et étiquetez-les correctement. REMARQUE : Utilisez des autocollants imprimés pour étiqueter car l’encre du marqueur s’efface facilement pendant le traitement.</li>
	<li>Centrifuger les tubes d’échantillon pendant 8 min à 180 × g.</li>
	<li>Transférez le surnageant dans un autre tube pour concentrer les cellules en fonction de la taille de la pastille.</li>
	<li>Vortex la pastille.</li>
	<li>Déposez 40 μL des cellules fixes sur une lame sèche et propre.</li>
	<li>Laissez sécher les lames à température ambiante. Conservez immédiatement les lames dans une boîte ou une teinture pour les observer.</li>
</ol>5. Coloration à l’acridine orange (AO)
<ol><li>Plongez les lames dans la teinture AO pendant 1 min, puis lavez-les rapidement dans l’eau distillée, puis placez-les dans un tampon phosphate (pH 6,8) pendant 1 min.</li>
	<li>Retirez les lames de la solution tampon et avec du papier de soie propre, séchez le dos des lames et placez les lames sur un papier de soie propre.</li>
	<li>Déposez 20 μL de tampon phosphate sur le dessus de la lame et couvrez-la délicatement avec une lamelle propre, en évitant les bulles d’air.</li>
	<li>Scellez ces lames avec du ciment silicone. REMARQUE : Étant donné que l’AO est sensible à la lumière et s’estompe avec le temps, pour un contraste et une fluorescence agréables, il est recommandé de marquer les lames dans les 5 jours suivant la coloration. Conservez toujours les lames dans une chambre froide (4 °C), lorsqu’elles ne sont pas examinées.</li>
</ol>6. Marquer les diapositives tachées
<ol><li>Placez votre lame sous un microscope à fluorescence et examinez 1 000 cellules binucléées (BN). Comptez manuellement les MN, qui sont l’un des six biomarqueurs de toxicité. Pour ce faire, demandez à deux correcteurs indépendants d’examiner 500 cellules BN par lame sous le même grossissement. REMARQUE : Voici quelques points saillants des critères de notation, tels que recommandés par Fenech pour noter les diapositives colorées9<ol><li>Sélectionnez une cellule BN en recherchant des cellules bien arrondies avec un cytoplasme intact, avec deux noyaux bien distingués d’environ la même taille, de la même forme régulière et du même motif de coloration. Assurez-vous que le cytoplasme de la cellule BN peut être distingué du cytoplasme de la cellule adjacente.</li>
		<li>Noter un MN, en notant qu’il est morphologiquement identique mais plus petit que les noyaux principaux ; même le plus grand MN ne peut pas dépasser 1/3 du diamètre des noyaux principaux. Ne notez un MN que s’il ne touche pas les noyaux principaux ou si au moins la limite micronucléaire peut être distinguée de la limite des noyaux principaux.</li>
	</ol></li>
</ol>

Examen des rendements en micronoyaux dans des échantillons de sang total irradié

<ol><li>Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+chromosomal+aberrations+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Results+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors.</a> Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).</li>
<li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+the+human+immune+system%3A+a+bioresource+for+autoimmunity+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis.</a> Cell. 161 (2), 387-403 (2015).</li>
<li>Bankoglu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+DNA+damage+and+DNA+repair+activity+in+human+blood+samples+in+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay.</a> Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).</li>
<li>Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+cryopreserved+isolated+lymphocytes+for+the+analysis+of+micronuclei+with+the+cytokinesis-block+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method.</a> Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).</li>
<li>Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+on+human+isolated+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125(2020).</li>
<li>Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserving+whole+blood+for+functional+assays+using+viable+lymphocytes+in+molecular+epidemiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies.</a> Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).</li>
<li>Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+cryopreserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood.</a> International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Ramachandran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+thawing+of+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+use+in+high-throughput+human+immune+monitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies.</a> Cells. 1 (3), 313-324 (2012).</li>
<li>Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).</li>
<li>Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+lymphocyte+subset+analysis+using+material+from+frozen+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+and+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood.</a> Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).</li>
<li>Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+blood+cell+subtype+concentrations+from+frozen+whole+blood+samples+using+TruCount+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).</li>
<li>Braudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+reliable+whole+blood+freezing+method+for+flow+cytometry+immuno-phenotyping+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).</li>
<li>Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+dosimetry+using+the+micronucleus+assay+for+lymphocytes%3A+interindividual+differences+in+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.</a> Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).</li>
<li>Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+assay+as+a+biological+dosimeter+of+in+vivo+ionising+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).</li>
<li>Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+and+G2-phase+assays+for+human+blood+lymphocytes+as+biomarkers+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation%3A+limitations+imposed+by+intraindividual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability.</a> Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).</li>
<li>Pajic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-individual+variability+in+the+response+of+human+peripheral+blood+lymphocytes+to+ionizing+radiation%3A+comparison+of+the+dicentric+and+micronucleus+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes%3A+results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li>
<li>Miszczyk, J., Rawojć, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culturing+technique+on+human+peripheral+blood+lymphocytes+response+to+proton+and+X-ray+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le protocole modifié pour l’application du dosage CBMN est un moyen relativement facile et pratique de stocker des échantillons de sang en vrac. La procédure décrit tous les détails minutieux mais importants qui doivent être pris en compte lors de la cryoconservation et du dosage CBMN. D’autres protocoles de laboratoire utilisent normalement 10 % de DMSO dans le mélange de congélation, tandis que notre mélange de congélation contient 20 % de DMSO et 80 % de FCS7. Comme ce mélange de congélation est ajouté en quantités égales à l’échantillon de sang total, la concentration finale est également de 10 % de DMSO. Pour améliorer le taux de survie cellulaire et stimuler la division cellulaire, nous ajoutons 1 % de pyruvate de sodium et 0,1 % de bêta-mercaptoéthanol au milieu de culture complet (cRPMI). Ceci est conforme au protocole de culture cellulaire établi par notre groupe de recherche 6,8.
Bien que le problème de l’agglutination des cellules lors de la décongélation n’ait pas pu être complètement résolu dans ce protocole, la ségrégation cellulaire était meilleure que les autres protocoles conventionnels. Au lieu d’un ajout constant et brutal de milieux de culture pour récupérer les cellules après décongélation, nous avons obtenu de meilleurs résultats lorsque du PBS préchauffé (37 °C) a été ajouté goutte à goutte pendant les étapes de lavage. Cette amélioration aide à réduire le stress cellulaire et minimise l’agglutination avec une récupération élevée prouvée des cellules. De plus, aucune différence claire dans la viabilité cellulaire n’a pu être observée lorsque le PBS était utilisé sur RPMI. Il a été validé par le groupe que la durée de la période de cryoconservation (jusqu’à 1 an) n’affectera pas les rendements en MN, tant dans les échantillons irradiés que dans les échantillons non irradiés 6,8. Des études suggèrent qu’il est possible d’obtenir une bonne viabilité cellulaire et une bonne prolifération des PBMC par une congélation graduelle à basse température (azote liquide), suivie d’un ajout progressif de milieu préchauffé pendant la décongélation10,11. Les chercheurs ont montré que les sous-populations de lymphocytes T dans le sang total décongelé sont comparables à celles observées dans les PBMC décongelés12. De plus, il est prouvé que les sous-types cellulaires récupérés à partir d’échantillons de sang total cryoconservés sont similaires à ceux observés dans les échantillons de sang total frais13,14.
Si nous examinons les résultats indicatifs obtenus dans le rapport, nous voyons que l’augmentation quadratique linéaire avec la dose (Figure 3) est en accord avec d’autres rapports de la littérature sur les micronoyaux induits par le transfert d’énergie linéaire (LET)15,16. La variabilité des rendements de MN observée dans les échantillons de sang total cryoconservés (tableau 1) est comparable à celle rapportée pour les hémocultures de sang total frais 8,17,18. Le protocole décrit en détail ici a été validé sur du sang total frais et cryoconservé de 20 volontaires sains8. L’indice de division nucléaire (NDI), qui est un paramètre important de la prolifération cellulaire observé dans ce rapport8, était en accord avec celui suggéré pour le sang total frais19,20. Pris ensemble, ce protocole optimisé de cryoconservation du sang total et le test de micronoyau modifié permettent d’obtenir un meilleur rendement cellulaire et, par conséquent, l’adaptation de ce protocole est recommandée pour les évaluations de radiosensibilité. Étant donné que la reproductibilité du protocole a déjà été validée8, il est suggéré de l’appliquer dans des études à grande échelle et multicentriques.

Depuis sa découverte, l’utilisation des rayonnements ionisants (IR) fait débat parmi les chercheurs en raison de ses effets néfastes sur les êtres vivants. L’effet néfaste se manifeste généralement par des dommages à l’ADN tels que des cassures double brin (DSB), et l’incapacité à réparer ces DSB conduit à des aberrations et des mutations chromosomiques, qui sont des caractéristiques importantes du cancer 1,2. De telles aberrations chromosomiques peuvent être examinées par des tests cytogéniques tels que le test du micronoyau à blocs de cytokinèse (CBMN). Les micronoyaux sont des fragments chromosomiques retardés qui ne peuvent pas être incorporés dans les noyaux filles et sont donc laissés pour compte pendant la mitose.
Le CBMN est une technique cytogénétique fiable et couramment utilisée pour évaluer les dommages chromosomiques chez les personnes exposées à des rayonnements ionisants in vivo ou in vitro. Du sang total frais ou des cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) peuvent être utilisés dans le dosage CBMN. Le sang total frais est principalement le matériel biologique de choix, car l’isolement et le traitement des PBMC peuvent prendre beaucoup de temps et s’accompagnent d’une perte de plasma sérique qui agit comme un milieu de soutien pour la survie et la croissance des cellules. Pour obtenir un bon rendement en cellules binucléées, le sang total frais doit être traité immédiatement après le prélèvement. Cependant, la nécessité d’un traitement immédiat peut être un défi logistique lorsque les contraintes de temps sont limitées. De plus, lorsque de nombreux échantillons sont censés être prélevés sur une longue période ou prélevés à des points éloignés des centres de traitement, le stockage d’échantillons de sang frais peut être un facteur limitant 3,4.
De plus, pour permettre une analyse répétée de la MN chez la même personne ou le même patient, la congélation des échantillons de sang serait bénéfique. Une façon de stocker les lymphocytes pour une application ultérieure du dosage CBMN consiste à congeler des PBMC isolés 5,6. Cette technique nécessite toutefois plusieurs étapes de traitement avant que les PBMC puissent être congelés. Par conséquent, la cryoconservation du sang total représenterait une alternative simple et rapide à la cryoconservation des PBMC isolés. Peu d’informations sont disponibles concernant l’utilisation du sang total congelé pour les tests cytogénétiques ou les tests qui nécessitent la prolifération des lymphocytes. Un seul article fait état de l’utilisation de sang total cryoconservé pour l’analyse de la métaphase7.
La cryoconservation du sang total offrant de nombreux avantages dans le domaine de la biosurveillance, de la biodosimétrie et de l’évaluation de la radiosensibilité, notre groupe a optimisé un protocole de cryoconservation du sang total qui permet l’application du dosage CBMN8. Nous avons démontré que les lymphocytes présents dans les hémocultures de sang total cryoconservés conservent leur intégrité génomique et leur capacité de prolifération pendant au moins 1 an. Dans cet article sur les méthodes, nous décrivons en détail la procédure de cryoconservation et le protocole de dosage CBMN, qui ont été optimisés par Beyls et al.8, et rapportons les résultats obtenus pour des échantillons de sang congelé de 30 personnes en bonne santé. Pour le test CBMN, les hémocultures ont été irradiées in vitro avec des doses de 0,5, 1 et 2 Gy afin d’évaluer la réponse MN dans les lymphocytes d’échantillons de sang total cryoconservés.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>plaque de suspension cellulaire à 24 puits&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>734-2779</td><td></td></tr><tr><td>96 % d’alcool</td><td>ChemLab</td><td>CL00.1807.2500</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>8,18,75,52,500</td><td></td></tr><tr><td>Orange acridine</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>235474-5g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>lamelles</td><td>VWR</td><td>631-1365</td><td>22 x 50</td></tr><tr><td>Cryobox (Mr.Frosty)</td><td>Nalgene, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryoflacons 2ml</td><td>Novolab</td><td>A04573</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalsine B&nbsp ;</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>C6762-10</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>D4540-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fixateur 1</td><td></td><td></td><td>Méthanol/acide acétique/bague dans un rapport de 4:1:5</td></tr><tr><td>Fixateur 2</td><td></td><td></td><td>Méthanol/acide acétique dans un rapport de 4:1</td></tr><tr><td>GURR tampon</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10582013</td><td>tampon phosphate (pH 6,8)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>1,04,93,60,250</td><td>75 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck sciences de la vie</td><td>1,04,87,30,250</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de li-héparine</td><td>BD Sciences de la vie</td><td>367526-LH170 I.U.</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher scinetific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO2</td><td>Merck life science</td><td>10,65,80,500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck life science</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’objet</td><td>VWR</td><td>MENZAA00000112E04</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/mL + 10 000 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Phytohémagglutinine (PHA-M)</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>La solution</td><td></td><td></td> Ringer <td>contient du NaCl, du KCl, du CaCl2 dissous dans de l’eau distillée</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>52400041</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber adhesive</td><td>sealent collall</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>PBS stérile chaud (37 &deg ; C)</td><td></td><td></td><td>contient du NaCl,&nbsp ; Na2HPO2, KH2PO4 dissous dans de l’eau distillée</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr></tbody></table>

le dosage des micronoyaux sur du sang total cryoconservé

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

Le test in vitro cytokines-block micronucleus (CBMN) est une technique largement utilisée dans la recherche en radiobiologie, la dosimétrie biologique, les études de génotoxicité et les tests de radiosensibilité in vitro . Cette méthode cytogénétique est basée sur la détection de micronoyaux dans des cellules binucléées résultant de fragments chromosomiques retardés lors de la division cellulaire. Les échantillons de sang total frais sont le type d’échantillon le plus privilégié pour le dosage CBMN. Cependant, les inconvénients de travailler avec des échantillons de sang frais comprennent le traitement immédiat après le prélèvement sanguin et le nombre limité d’analyses répétées qui peuvent être effectuées sans prélèvement sanguin supplémentaire. 
Étant donné que le besoin d’échantillons de sang frais peut être un défi logistique, le dosage CBMN sur des échantillons de sang total cryoconservés serait d’un grand avantage, en particulier dans les études à grande échelle sur les patients. Cet article décrit un protocole de congélation d’échantillons de sang total et d’analyse CBMN sur ces échantillons de sang congelé. Des échantillons de sang de volontaires sains ont été congelés et décongelés à différents moments, puis soumis à un protocole d’analyse des micronoyaux modifié. Les résultats démontrent que cette procédure optimisée permet la performance du dosage CBMN sur des échantillons de sang congelés. Le protocole de cryoconservation décrit peut également être très utile pour d’autres tests cytogénétiques et une variété de tests fonctionnels nécessitant la prolifération des lymphocytes.

Pour valider la reproductibilité du protocole, nous avons réalisé le test MN sur des échantillons de sang cryoconservés de 30 volontaires sains âgés de 17 à 65 ans. L’âge moyen du groupe est de 35 ans. Le temps de cryoconservation variait de 1 semaine à 154 semaines. Après avoir exposé la culture de cellules sanguines entières à différentes doses de rayonnement (0,5, 1 et 2 Gy), le rendement en micronoyaux de 1 000 cellules BN a été examiné au microscope. Des cellules binucléées bien arrondies (comme on peut le voir sur la figure 2) indiquent une récupération réussie de cellules saines viables à partir d’échantillons de sang total cryoconservés. Il convient de noter que la réponse aux rayonnements des lymphocytes est restée stable après un stockage à long terme à des températures ultra-basses (azote liquide). Cette observation est conforme à la réponse attendue à partir d’échantillons de sang frais.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg"> Figure 2 : Micronoyaux observés dans des cellules binucléées prélevées dans un échantillon de sang total congelé qui a été cryoconservé il y a 1 an. (A) Grossissement 200x, (B) Grossissement 400x ; Flèches pointant vers les MN. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Avec l’augmentation des doses de rayonnement (0,5, 1 et 2 Gy), une augmentation linéaire-quadratique du rendement en micronoyaux a été observée (tableau 1 et figure 3). Les rendements MN dans les échantillons témoins irradiés fictifs (0 Gy) représentent les rendements MN de fond qui sont principalement le résultat de chromosomes retardés.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dose (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Moyenne</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr><tr><td>SD</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr><tr><td>CV (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr><tr><td>Gamme</td>
			<td>5-41</td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Plage et coefficient de variation ainsi que le rendement moyen en MN, tels qu’observés dans des échantillons de sang total cryoconservés de 30 donneurs sains, ce qui indique une variabilité interindividuelle. Abréviations : CV = coefficient de variation ; ET = écart-type.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg"> Figure 3 : Rendements en micronoyaux observés dans des échantillons de sang total témoins et cryoconservés irradiés de 30 donneurs. Les périodes de cryoconservation variaient de 1 semaine à 154 semaines. Le nuage de points affiche les valeurs individuelles. Les lignes dans les grappes représentent la moyenne ± écart-type du groupe. Abréviations : MN = micronoyaux ; BN = binucléé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour étudier la variation interindividuelle du rendement MN des personnes, le coefficient de variation (CV) a été calculé (voir tableau 1). Pour la MN radio-induite, un CV &lt; 25 % a été obtenu pour toutes les doses (0,5, 1 et 2 Gy), ce qui indique une bonne reproductibilité du protocole modifié.

Nous présentons ici un protocole optimisé pour le dosage du micronoyau de blocage de la cytokinèse sur des échantillons de sang total cryoconservés. Cette méthode optimisée de cryoconservation du sang total pour l’analyse des micronoyaux est une technique fiable pour les prélèvements à grande échelle et les études multicentriques et peut également être utilisée pour d’autres tests sanguins.

Le dosage des micronoyaux sur du sang total cryoconservé

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, ...

Nos recherches portent principalement sur l’étude de l’impact des rayonnements ionisants sur les tissus sains. Nous étudions la radiosensibilité chromosomique des personnes atteintes de cancer et de celles atteintes de troubles de la réparation de l’ADN. De plus, nous sommes impliqués dans la dissymétrie biologique, où nous évaluons les dommages à l’ADN induits par l’exposition aux rayonnements ionisants.Pour faire avancer la recherche dans notre domaine, nous utilisons des systèmes microscopiques automatisés pour l’analyse à haut débit. Les échantillons de sang total frais sont le type d’échantillon le plus préféré pour le test des micronoyaux, car ils sont faciles à obtenir avec un minimum d’inconfort pour le patient. Cependant, la nécessité d’un traitement immédiat peut être un défi logistique lorsque les contraintes de temps sont limitées.La congélation d’échantillons de sang total permet des analyses répétées sans qu’il soit nécessaire de procéder à des prélèvements supplémentaires. Cette procédure est un moyen simple et rapide de stocker des échantillons de sang dans des études à grande échelle et multicentriques. Le protocole de cryoconservation du sang total offrira non seulement des avantages pour le dosage des micronoyaux, mais aussi pour d’autres tests cytogénétiques ou tests fonctionnels qui nécessitent la prolifération des lymphocytes.

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Recherche sur le cancer

Nous décrivons une méthodologie pour le traitement du sang total afin d’obtenir une variété de composants pour une analyse plus approfondie. Nous avons optimisé un protocole rationalisé qui permet un traitement simultané rapide et à haut débit d’échantillons de sang total dans un cadre non clinique.

Fractionnement rapide et isolement de composants de sang total dans les échantillons obtenus à partir d&#39;un milieu communautaire

L'analyse micronutrique in vitro est une méthode bien établie pour évaluer la génotoxicité et la cytotoxicité, mais la notation de l'essai à l'aide de la microscopie manuelle est laborieuse et souffre de subjectivité et de variabilité inter-scorer. Cet article décrit le protocole développé pour effectuer une version entièrement automatisée de l'essai utilisant la cytométrie multispectrale de flux d'imagerie.

Une méthode automatisée pour effectuer l'essai micronutrique in vitro à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie multispectrale

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Le dosage des micronoyaux sur du sang total cryoconservé

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