Name: Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez un protocole optimisé pour isoler des fibroblastes primaires à partir de tissu vaginal humain postménopausé. Cette méthode combine digestion mécanique et enzymatique pour améliorer le rendement cellulaire et étudier la physiopathologie du prolapsus des organes pelviens.

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<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Bio Techne</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire (100 &mu ; m)</td><td>Tubes</td> à centrifuger coniques <td>22363549</td><td></td>ThermoFisher</tr><tr>Scientific<td>(15 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 ThermoFisher</td><td>Scientific</td> Scalpel <td>jetable à plumes 11320033</td><td></td></tr><tr><td>n° 15</td><td>Socorex</td><td>FB.15</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC1983075</td><td></td></tr><tr><td>tubes à centrifuger coniques haute clarté (50 ml)</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Mélangeur d’échantillons</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine humaine DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070063 boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri, polystyrène (100 mm x 20 mm)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (10 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Seringues stériles (5 mL)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

Des tissus vaginaux ont été prélevés sur 10 donneurs indépendants subissant une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. En utilisant le protocole décrit, des cellules ont été isolées de tissu vaginal humain. Les populations cellulaires avaient un aspect caractéristique allongé, plat et fusiforme. Comme d’autres études, nous avons observé des capacités de doublement cellulaire significativement plus lentes et une capacité clonogénique réduite des fibroblastes avec l’augmentation de l’âge du donneur. Ces différences ont été marquées lorsque l’on compare les fibroblastes isolés d’individus plus âgés (75-78 ans) à ceux isolés d’individus jeunes (35-47 ans). Les cellules de donneurs d’âge moyen présentaient un profil intermédiaire (56-61 ans). Les taux de prolifération cellulaire ont d’abord été estimés par visualisation directe à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec la même densité d’ensemencement connue.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 1 montre une représentation schématique du protocole de dissociation et d’isolement. Suite à ces étapes, ce protocole a donné un taux de réussite de 90 % de l’isolement primaire des fibroblastes chez neuf donneurs sur dix dans un nombre suffisant de cellules pour permettre la sous-culture de cellules. L’âge médian des donneurs était de 59 ans.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Protocole (Auteur, année)</td>
			<td>Tissu de donneur du protocole original</td>
			<td>Nombre de donateurs</td>
			<td>Âge du donneur en années</td>
			<td>Fibroblastes obtenus</td>
			<td>Morphologie</td>
		</tr><tr><td>Ruiz-Zapata et al., 2013</td>
			<td>Vagin humain</td>
			<td>3</td>
			<td>56-78</td>
			<td>Non</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Khan et coll., 2016</td>
			<td>Oreille et queue de souris</td>
			<td>2</td>
			<td>48-65</td>
			<td>Non</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Waise et al., 2019</td>
			<td>Tissus humains</td>
			<td>3</td>
			<td>56-75</td>
			<td>Non</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Nadalutti et al., 2020</td>
			<td>Prépuce humain</td>
			<td>1</td>
			<td>65</td>
			<td>Non</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Courant</td>
			<td>Vagin humain</td>
			<td>10</td>
			<td>35-79</td>
			<td>Oui</td>
			<td>En forme de fuseau</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Comparaison des protocoles pour l’isolement réussi des fibroblastes vaginaux humains. Comparaison de différents protocoles existants avec le nôtre et mise en évidence par des résultats morphologiques.
Le tableau 1 montre les résultats de l’utilisation d’autres protocoles pour tenter d’isoler les fibroblastes vaginaux dans cette étude. Nous avons développé un protocole standard pour l’isolement des fibroblastes primaires de la muqueuse vaginale et des donneurs âgés5.
Nous avons testé plusieurs protocoles établis, y compris ceux énumérés dans le tableau 1, et n’avons observé aucun succès dans l’isolement cellulaire à l’aide de ces protocoles dans notre étude. Nous proposons les raisons suivantes pour expliquer leurs limites.
Le protocole publié par Ruiz et al.3 consiste à gratter le fascia et à couper le tissu en petits morceaux. D’après notre expérience, il est difficile de distinguer les fascias, et les tentatives de grattage peuvent entraîner une réduction significative du rendement cellulaire. Bien que cette méthode soit simple, elle manque de détails essentiels, ce qui limite sa généralisabilité. De plus, la digestion mécanique dans ce protocole semble insuffisante pour le tissu post-ménopausique, qui a tendance à être plus dense.
Les protocoles publiés par Khan et al.9 et Waise et al.13 utilisent des ciseaux pour le hachage des tissus, qui n’introduisent pas de forces de cisaillement multidirectionnelles significatives par rapport à la technique du scalpel. D’après notre expérience, la méthode des ciseaux n’a pas non plus fonctionné efficacement.
Enfin, le protocole de Nadalutti et al.14 , qui utilisait la méthode de l’explantation, n’a pas réussi à produire des fibroblastes entre nos mains. Cette méthode peut être moins efficace en raison de la nature du tissu postménopausique, qui peut nécessiter un traitement mécanique et enzymatique plus agressif pour dissocier les fibroblastes avec succès.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg"> Figure 2 : Image en contraste de phase des cellules suspendues le jour 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 2 montre les cellules suspendues le jour 0 à l’aide de notre protocole.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg"> Figure 3 : Image en contraste de phase de fibroblastes primaires vaginaux au 14e jour de la culture à un grossissement de 100x à partir d’une suspension cellulaire groupée de trois biopsies tissulaires de 1 cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 3 montre des fibroblastes primaires à un grossissement de 100x à partir d’une suspension cellulaire groupée de 3 biopsies tissulaires de 1 cm² de dimensions.
L’identité des fibroblastes a été étudiée par des techniques d’immunofluorescence comme décrit précédemment, avec des modifications mineures. Pour vérifier l’origine cellulaire des cellules vaginales primaires, nous avons utilisé des biomarqueurs spécifiques d’origine fibroblastique via coloration immunofluorescente. Les cellules ont été identifiées comme des fibroblastes sur la base d’une coloration positive de la vimentine (Figure 4), de l’actine F et de la α-SMA à partir d’échantillons de tissus préménopausiques et postménopausiques (Figure 5). Les fibroblastes ont été cultivés jusqu’à l’expansion avec une viabilité élevée (&gt;90 %) pour être utilisés dans des expériences.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg"> Figure 4 : Coloration positive de la vimentine des fibroblastes vaginaux. Les fibroblastes primaires isolés des tissus préménopausiques et postménopausiques ont été soumis à une analyse FI et les images ont été prises à un grossissement de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg"> Figure 5 : Coloration positive de l’actine F et de l’α-SMA des fibroblastes vaginaux. Les résultats de l’expression des protéines par rapport au contrôle des IgG. Les images ont été collectées à un grossissement de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

Pelvic organ prolapse is a disorder that seriously impacts the quality of life of women. It occurs when muscles and ligaments weaken and cause pelvic ...

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Biology

Biologie

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Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

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