Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

La recherche sur les troubles qui touchent principalement les personnes de sexe féminin est sous-étudiée et sous-financée. Le prolapsus des organes pelviens est le trouble fortement associé au sexe féminin. Cela se produit lorsque les muscles et les ligaments s’affaiblissent et font descendre les organes pelviens plus bas dans le bassin, créant un renflement dans le vagin.

On sait peu de choses sur les interactions cellulaires dans le contexte de cette physiopathologie, ni sur l’impact des facteurs au niveau tissulaire sur le succès des interventions chirurgicales. L’isolement des fibroblastes primaires du vagin humain peut être utile pour étudier les mécanismes biologiques sous-jacents au prolapsus des organes pelviens. Le prolapsus des organes pelviens affecte généralement les personnes âgées ou ménopausées.

L’étude de l’isolement et de la prolifération des fibroblastes primaires de cette maladie est difficile en raison de la réduction des populations cellulaires et de la capacité clonogénique des donneurs plus âgés. La plupart des articles utilisant des échantillons vaginaux humains utilisent des tissus de personnes préménopausées avec prolapsus des organes pelviens. Bien que quelques articles aient rapporté l’utilisation d’échantillons provenant de personnes préménopausées et ménopausées, ils n’ont pas décrit suffisamment en détail le protocole utilisé pour isoler avec succès les fibroblastes de donneurs plus âgés ou ménopausés.

L’isolement et la modélisation de la maladie à l’aide de fibroblastes provenant de tissus postménopausiques peuvent être essentiels pour comprendre la physiopathologie cellulaire du prolapsus des organes pelviens, car cette affection a la prévalence la plus élevée chez les individus au cours de la décennie suivant la ménopause. Cet article décrit un protocole fiable sur la façon d’acquérir des fibroblastes vaginaux humains postménopausiques ou vieillissants. Les tissus prélevés ont été analysés histologiquement pour valider le protocole.

Mesurez et coupez le tissu à la taille d’environ un centimètre carré. Assurer une mesure précise de la taille de la biopsie. Préparez deux à trois biopsies vaginales supplémentaires, mesurant un centimètre carré chacune d’un seul donneur, et mettez les biopsies de côté.

Après avoir placé la biopsie vaginale dans une boîte de Pétri de culture cellulaire, coupez le tissu vaginal en petits fragments, à l’aide de deux scalpels stériles. Assurez-vous que les extrémités des lames sont perpendiculaires à la surface du tissu. Appliquez une pression égale et constante sur la surface du tissu, à l’aide de deux scalpels.

Effectuez une action de traction alternée pour couper les tissus en très petits morceaux. Répétez cette technique de hachage, à l’aide de deux scalpels, jusqu’à ce que l’échantillon ait une consistance uniforme avec des morceaux d’un à deux millimètres. Ajoutez deux à trois millilitres de milieu de culture cellulaire sans sérum dans la plaque, en suspendant le tissu haché.

Pipetez la solution contenant des fragments de tissu de haut en bas pour briser les amas Transférez la solution contenant des fragments de tissu dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez du milieu de culture cellulaire sans sérum supplémentaire jusqu’à ce que le volume total atteigne 10 millilitres.

Conservez Liberase dans des aliquotes de 230 microlitres pour l’utiliser. Ajoutez 230 microlitres de Liberace dans le tube. Incuber les tubes pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec une agitation vigoureuse constante, à l’aide d’un mélangeur d’échantillons.

Maintenez une agitation constante. Agiter les tubes à 30 minutes d’intervalle pendant l’incubation. Centrifuger les échantillons pendant cinq minutes À 3000 G.Retirer et jeter le surnageant.

Remettre la pastille en suspension dans un à deux millilitres de milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum de veau fœtal pour diluer la Liberase. Pipetez vigoureusement jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Filtrez la suspension d’enzymes tissulaires en pipetant doucement la solution sur la crépine cellulaire.

Tirez ensemble des suspensions cellulaires de plusieurs biopsies tissulaires du même donneur. À l’aide du piston d’une seringue stérile de cinq millilitres, presser la suspension d’enzymes tissulaires sur la passoire. Répétez cette étape jusqu’à ce que les fragments de tissu restants semblent être complètement enfoncés.

Suspension cellulaire prélevée sur plaque de plusieurs biopsies vaginales du même donneur sur une seule boîte de Pétri. Après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius, observez les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Assurez-vous que la mise au point du microscope se trouve au bas de la plaque.

Un petit nombre de fibroblastes seront attachés au fond. Voici une représentation schématique du protocole, mettant en évidence les étapes clés. La figure deux montre une image en contraste de phase des cellules suspendues au jour zéro.

La figure 3 est une image en contraste de phase de fibroblastes primaires vaginaux au 14e jour de la culture à un grossissement de 100X à partir d’une suspension tirée de trois biopsies de tissus d’un centimètre carré. Le tableau 1 montre les résultats de l’utilisation d’autres protocoles pour tenter d’isoler les fibroblastes vaginaux dans cette étude. Les fibroblastes ont été identifiés par coloration positive du menton.

L’analyse d’immunofluorescence a été effectuée sur les tissus vaginaux préménopausiques et postménopausiques montrés ici. Les images ont été prises à un grossissement de 200X. Des fibroblastes isolés ont également été colorés avec de l’actine musculaire lisse alpha et de l’actine F dans des échantillons de tissus préménopausiques et postménopausiques.

Nous avons développé un protocole optimisé et fiable pour l’isolement des fibroblastes primaires de la muqueuse vaginale chez les donneurs âgés. L’utilisation de protocoles précédemment publiés pour les tissus animaux et humains pour la dissociation des cellules primaires n’a pas permis d’extraire de fibroblastes d’échantillons vaginaux humains dans cette étude. Nous émettons l’hypothèse de deux raisons probables pour expliquer les défis de la dissociation cellulaire du tissu vaginal humain.

L’épaisseur dermique de la muqueuse est plus grande chez les donneurs âgés et, par rapport à celle du tissu non muqueux, et les fibroblastes de densité peuvent être nettement réduits chez les personnes âgées. Quelques étapes critiques ne doivent pas être modifiées. La mise en œuvre d’une digestion mécanique très rigoureuse, à l’aide de la technique des deux scalpels, et le regroupement des suspensions cellulaires de trois à quatre biopsies de pleine épaisseur d’un seul donneur.

Notre protocole présente un avantage certain. La digestion mécanique et enzymatique permet d’obtenir de meilleurs rendements pour le tissu postménopausique, mais n’a pas d’impact négatif sur les échantillons de préménopause. Nous reconnaissons plusieurs limites à notre protocole.

L’accès aux tissus vaginaux humains peut être difficile dans les situations où la chirurgie du prolapsus vaginal n’est pas pratiquée, et la nécessité de prélever des suspensions cellulaires de plusieurs échantillons de biopsie tissulaire peut également être une limitation. Ce protocole pour exiger des fibroblastes vaginaux humains sera un outil utile pour les recherches futures sur les troubles du plancher pelvien, en particulier chez les personnes ménopausées, ainsi qu’un ajout important à la recherche sur la santé des femmes.