Name: Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Apprenez la dissociation mécanique de tissus pour l'analyse de cellules uniques en immunologie et recherche biomédicale. Cette méthode semi-automatisée améliore l'accessibilité et la fiabilité des protocoles de laboratoire.

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Le financement a été reçu du département de bio-ingénierie Fischell (KM), du T32 GM080201 (MA), de la bourse d’été Vogel (MA), de la Fondation LAM (KM) et de l’American Lung Association (KM). Les auteurs tiennent à remercier Michele Kaluzienski pour son aide à l’édition.

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’UMD (IACUC). Des tissus de souris C57BL/6J femelles âgées de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour ces études. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).
1. Dissociation manuelle
NOTE : Cette étape est adaptée de Maisel K. et al.7.
<ol><li>Retirez le tissu disséqué et placez-le dans un milieu de culture cellulaire froid avec 5 % de sérum de veau fœtal (FBS).</li>
	<li>Hachez le tissu à l’aide de ciseaux de dissection tranchants jusqu’à ce que les fragments soient inférieurs à 1 mm dans n’importe quelle dimension.</li>
	<li>Transférer le mouchoir haché dans un tube conique de 15 mL et ajouter 5 mL de milieu.</li>
	<li>Ajoutez des enzymes de digestion en fonction des types de tissus et de cellules isolés. Pour les expériences présentées, utilisez la collagénase 4 (1 mg/mL), la collagénase D (1 mg/mL) et la DNase (40 μg/mL).</li>
	<li>Incuber sur un agitateur ou une bascule pendant 1 h à 37 °C en agitant doucement tout au long de l’incubation. Pipeter l’échantillon de haut en bas 100 fois.</li>
	<li>Ajouter de l’EDTA pour obtenir un volume d’échantillon avec une concentration de 5 mM. Pipeter l’échantillon de haut en bas 100 fois, puis pipeter vigoureusement l’échantillon de haut en bas 100 fois.</li>
	<li>Passer l’échantillon dans une crépine de 70 μm et le prélever dans un tube de 50 ml ou 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 1 min à température ambiante.</li>
	<li>Neutraliser le tampon de lyse en ajoutant 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X froide.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez les cellules en suspension dans le tampon ou le milieu souhaité.</li>
</ol>2. Dissociation mécanique semi-automatisée
<ol><li>Placer le tissu disséqué dans un milieu de culture à cellules froides avec 5 % de sérum fœtal bovin (FBS). REMARQUE : Ce protocole est destiné à l’isolement cellulaire des tissus solides.</li>
	<li>Hachez le tissu à l’aide de ciseaux de dissection tranchants jusqu’à ce que les fragments de tissu mesurent environ 5 mm dans n’importe quelle dimension. Transférer le tissu haché dans un tube C et ajouter 1 mL de milieu.</li>
	<li>Chargez le tube C sur l’appareil. Placez la plaque porte-tube (Figure supplémentaire 1A) sur le fond du tube en forme de D.</li>
	<li>Fixez les tubes à la plaque du moteur en verrouillant les bras de tension dans la plaque acrylique (Figure supplémentaire 3).</li>
	<li>Définir un programme personnalisé : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 4 fois.<ol><li>Choisissez le mode personnalisé dans le menu principal en appuyant sur le bouton bleu .</li>
		<li>Dans le premier menu du mode personnalisé, spécifiez la durée de la rotation vers l’avant à 30 s en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 30 s. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et passer à l’écran de menu suivant.</li>
		<li>Dans le deuxième menu du mode personnalisé, spécifiez la durée de la rotation inverse à 10 s en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 10 s. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et passer à l’écran de menu suivant.</li>
		<li>Dans le troisième menu du mode personnalisé, spécifiez le nombre de fois qu’il faut répéter les sélections définies aux étapes 2.5.2-2.5.3 en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 4X. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et démarrer le programme. REMARQUE : Les programmes personnalisés ne sont pas stockés dans la mémoire de l’appareil mais peuvent être programmés comme l’un des programmes prédéfinis pour un fonctionnement plus rapide (les instructions de programmation de l’appareil sont fournies dans le fichier supplémentaire 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez le programme personnalisé à 200 tr/min en ajustant la molette de commande de tension (Figure supplémentaire 3) jusqu’à ce que la valeur de régime calculée dans le coin inférieur droit de l’écran LCD indique 200 (Figure supplémentaire 4).</li>
	<li>Ajouter les enzymes de digestion dans un milieu de 4 mL selon les types de tissus et de cellules isolés. REMARQUE : Pour les expériences présentées, utiliser la collagénase 4 (1 mg/mL), la collagénase D (1 mg/mL) et la DNase (40 μg/mL).</li>
	<li>Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 200 tr/min : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 4 fois.</li>
	<li>Transférez l’appareil avec les tubes encore chargés dans un incubateur à 37 °C pendant 45 min.</li>
	<li>Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 50 tr/min : Avant, 270 s ; revers, 30 s ; Boucle, 9 fois.</li>
	<li>Ajouter de l’EDTA pour obtenir une concentration de 5 mM dans l’échantillon.</li>
	<li>Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 100 tr/min : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 2 fois.</li>
	<li>Poussez l’échantillon à travers une crépine de 70 μm et prélevez-le dans un tube de 50 ml ou 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 1 min à température ambiante.</li>
	<li>Neutraliser le tampon de lyse avec 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez les cellules en suspension dans le tampon ou le milieu souhaité.</li>
</ol>3. Analyse des données
<ol><li>Analyser les données à l’aide d’un logiciel de graphiques et d’analyses statistiques (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Utilisez des tests t de Welch non appariés pour comparer des paires d’échantillons ou de groupes, avec des tailles d’échantillon n > 4 souris représentant 2 expériences répétées. REMARQUE : Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.</li>
</ol>

Dissociation mécano-enzymatique semi-automatisée pour l’analyse de cellules uniques

<ol><li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).</li>
<li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeiskirchen%2C+S+%22Fibrosis%3A+Methods+and+Protocols%22">Fibrosis: Methods and Protocols</a>. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).</li>
<li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+CIRP%22%5BJournal%5D)">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li>
<li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).</li>
<li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li>
<li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Hematology+and+Blood+Transfusion%22%5BJournal%5D)">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carpal+tunnel+syndrome%3A+a+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333(2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce dispositif a été conçu pour être facilement assemblé dans le cadre de la recherche afin de fournir des suspensions unicellulaires à partir de tissus entiers pour une analyse ultérieure sur cellule unique. Les fonctionnalités, bien que basiques, sont suffisantes pour répondre aux besoins des chercheurs en milieu universitaire et au-delà. L’un des principaux avantages de l’utilisation de ce dispositif est son potentiel d’amélioration de la préparation des suspensions unicellulaires en réduisant la variabilité. De plus, ...

L’analyse de cellules uniques est rapidement devenue cruciale pour les nouvelles découvertes biomédicales, que ce soit pour des applications telles que la cytométrie en flux, l’identification de différents types de cellules, le séquençage de cellules uniques ou pour l’identification de variations génomiques ou transcriptomiques entre les cellules1. Pour effectuer de tels isolements cellulaires à partir de tissus d’intérêt, il faut hacher des tissus disséqués et les pousser à travers une fine passoire cellulaire pour filtrer le tissu conjonctif des cellules souhaitées (Figure 1A). L’isolement des types de cellules adhérentes, telles que les cellules dendritiques ou les macrophages, ou les cellules de tissus particulièrement fibreux, nécessite des étapes de séparation mécaniques ou enzymatiques supplémentaires 2,3,4. Ce processus est généralement effectué manuellement, ce qui le rend très long et sujet à la variabilité de l’utilisateur lors de l’évaluation des rendements cellulaires et de la viabilité des échantillons. Par conséquent, il est crucial d’introduire des options personnalisables pour la dissociation tissulaire automatisée. Bien que certaines tentatives aient été faites pour concevoir de tels systèmes, les options existantes ne sont pas toujours facilement accessibles, en particulier dans les laboratoires universitaires et les milieux à faibles ressources, en grande partie en raison de la nature prohibitive de ces dispositifs5. De plus, ces appareils ne sont pas toujours personnalisables en fonction des besoins individuels d’un groupe de recherche6.
Ici, un dispositif de dissociation tissulaire a été conçu pour automatiser la digestion de tissus entiers ou de morceaux de tissus en suspensions unicellulaires à l’aide d’enzymes digestives et de perturbations mécaniques. Cet appareil peut être facilement assemblé en laboratoire, placé dans des chambres de chauffage ou de refroidissement pour la régulation de la température, personnalisé pour le nombre requis de tissus à dissocier et programmé avec les protocoles de dissociation souhaités. L’utilisation généralisée de ce dispositif pourrait améliorer considérablement la reproductibilité des protocoles d’extraction cellulaire et fournir une alternative rapide à la dissociation manuelle.
La conception permet la digestion simultanée de jusqu’à 12 tissus grâce à un processus automatisé. L’appareil est composé de 12 moteurs individuels câblés en parallèle et alimentés par une prise murale standard via un adaptateur AC/DC avec un cadran de tension réglable pour contrôler la rotation/vitesse des moteurs. Les moteurs font tourner un boulon hexagonal qui s’insère parfaitement dans le haut des tubes en C. Les tubes C sont maintenus en place par une tension vers le bas sur une plaque acrylique qui se verrouille de chaque côté à la plaque supérieure où les moteurs sont fixés (Figure 1B). Parce que les moteurs sont câblés en parallèle, leur vitesse à une tension donnée ne devrait pas varier beaucoup, mais la charge (le nombre de tubes C montés sur l’appareil) affectera la vitesse même lorsque la tension est maintenue constante. Pour mesurer les rotations par minute (tr/min), un tachymètre a été incorporé à l’aide d’un capteur à effet Hall et d’un aimant fixe sur l’un des arbres du moteur (Figure supplémentaire 1). Les fichiers CAO pour la construction de réseaux de moteurs sont fournis dans le fichier de codage supplémentaire 1. Un interrupteur programmable est également inclus pour inverser le sens de rotation en inversant les charges positives/négatives délivrées aux moteurs. Toutes ces fonctionnalités sont intégrées à l’aide d’un logiciel codé (logiciel Arduino IDE, voir Table des matériaux) sur un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). À l’aide de boutons connectés et d’un écran LCD (Figure supplémentaire 2), il est possible de créer et d’exécuter des protocoles enregistrés et personnalisés, d’inverser automatiquement le sens de rotation à des moments spécifiés d’un protocole, d’ajuster la vitesse à l’aide de la tension (Figure supplémentaire 3) et d’afficher la vitesse actuelle du moteur et le temps restant pour terminer un protocole programmé (Figure supplémentaire 4).
Pour la présente étude, des suspensions unicellulaires ont été préparées en utilisant à la fois la dissociation tissulaire mécanique-enzymatique avec ce dispositif et la dissociation tissulaire-enzymatique manuelle pour déterminer les différences, le cas échéant, dans les cellules récupérées pour des applications en aval. Les préparations cellulaires ont été évaluées en fonction du rendement total des cellules par tissu et du pourcentage de viabilité cellulaire. La cytométrie en flux a été utilisée pour comparer les différences potentielles dans l’expression des marqueurs de surface. Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel de graphisme et d’analyse statistique. Des tests t de Welch non appariés ont été utilisés pour comparer des paires d’échantillons ou de groupes, avec des tailles d’échantillon n > 4 souris représentant 2 expériences répétées. Des instructions détaillées pour la fabrication et l’assemblage de cet appareil se trouvent dans le dossier supplémentaire 1. Le matériel nécessaire à ce protocole est indiqué dans le tableau des matériaux.

<table><tbody><tr><td>&frac14 ; feuille acrylique po&nbsp ; 12 » x 24"</td><td>Acrylique Mega Store</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&frac12 ; feuille acrylique 12 » x 12"</td><td>SimbaLux</td><td>SL-AS13-12x12</td><td></td></tr><tr><td>12 G Fil d’acier inoxydable (pour bras de tension)</td><td>Everbilt</td><td>1000847413</td><td></td></tr><tr><td>16 G fil électrique (toronné)</td><td>Meilleures connexions</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2 aimants de 3 mm&nbsp ; &nbsp ;</td><td>SU-CRO0587</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Carte de relais à 2 canaux (pour inverser la polarité du courant vers les moteurs)</td><td>AEDIKO</td><td>AE06233</td><td></td></tr><tr><td>Moteurs à courant continu de 37 mm de diamètre (12 V, 200 tr/min) x 12</td><td>Greartisan</td><td>N/A</td><td>Couple nominal : 2,2 Kg.cm Rapport de réduction : 1:22 Courant nominal : 0,1 A en forme de D Taille de l’arbre de sortie : 6 x 14 mm (0,24 » x 0,55 ») (P x L) Taille de la boîte de vitesses : 37 x 25 mm (1,46 » x 0,98 ») (P x L)< > Taille du moteur : 36,2 x 33,3 mm (1,43 » x 1,31 ») (P x L) Taille du trou de montage : M3 (non inclus)</td></tr><tr><td>Adaptateur d’alimentation CA/C avec contrôleur de tension variable&nbsp ; &nbsp ; (5 ampères, 3-12 volts)</td><td>Mo-gu</td><td>J19091-2-MG-US</td><td></td></tr><tr><td>AC-DC 5 V 1 A Convertisseur abaisseur de précision Transformateur abaisseur</td><td>Walfront</td><td>1A</td><td>(adaptateur d’alimentation pour l’alimentation d’Arduino Nano)</td></tr><tr><td>Arduino Nano&nbsp ; &nbsp ; (Lafvin)</td><td>LAFVIN</td><td>8541582500</td><td></td></tr><tr><td>Boutons&nbsp ;</td><td>Awpeye</td><td>Bouton-poussoir</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J souris&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 4</td><td>Worthington</td><td>CLS4 LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Ruban mousse double face</td><td>SANKA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Circuit imprimé de prototypage double face</td><td>deyue</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fer à souder et à souder électrique</td><td>LDK</td><td>1002P</td><td></td></tr><tr><td>Ruban électrique</td><td>3M</td><td>03429NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sérum de bovin fœtal)</td><td>Gibco</td><td>16140089</td><td></td></tr><tr><td>douxMACS C Tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad, La Jolla, CA</td><td></td><td>Logiciel de graphisme et d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Capteur à effet Hall Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 pouces</td><td>SunFounder</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>Coupleur hexagonal 6 mm Alésage Moteur Laiton x 2 x 12</td><td>Uxcell</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Boulons à tête hexagonale (M4-.70 X 12 Vis d’assemblage à tête hexagonale) x 12</td><td>FAS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fils de liaison (pour Arduino Nano)</td><td>ELEGOO</td><td>EL-CP-004</td><td></td></tr><tr><td>Ecran LCD</td><td>JANSANE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>M3 Vis d’assemblage à tête hexagonale x 12</td><td>Shenzhen Baishichuangyou Technology co. Ltd</td><td>310luosditaozhuang</td><td></td></tr><tr><td>M3 Acier inoxydableVis à métaux Vis à tête plate Vis d’assemblage hexagonales à six pans plongeants (30 mm) x 36</td><td>Still Awake</td><td>a52400001</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs de borne à déconnexion rapide</td><td>IEUYO</td><td>22010064</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges (10x)</td>Signalisation cellulaire <td>46232</td><td></td> <td>Blindage</td></tr><tr><td>de l’adaptateur de terminal Carte d’extension pour Arduino Nano&nbsp ; 12 » x 24 »</td><td>Shenzhen Weiyapuhua Technologie</td><td>60-026-3</td><td></td></tr></tbody></table>

dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Être capable d’isoler et de préparer des cellules uniques pour l’analyse d’échantillons de tissus est rapidement devenu crucial pour les nouvelles découvertes et recherches biomédicales. Les protocoles manuels pour les isolements de cellules uniques prennent beaucoup de temps et sont sujets à la variabilité de l’utilisateur. Les protocoles mécaniques automatisés sont capables de réduire le temps de traitement et la variabilité des échantillons, mais ne sont pas facilement accessibles ou rentables dans les milieux de recherche à faibles ressources. Le dispositif décrit ici a été conçu pour la dissociation semi-automatisée des tissus en utilisant des matériaux disponibles dans le commerce comme alternative peu coûteuse pour les laboratoires universitaires. Des instructions pour fabriquer, assembler et utiliser la conception de l’appareil ont été fournies. Le protocole de dissociation produit de manière fiable des suspensions unicellulaires avec des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables à ceux des préparations manuelles sur plusieurs tissus de souris. Le protocole offre la possibilité de traiter jusqu’à 12 échantillons de tissus simultanément par dispositif, ce qui facilite la gestion des études nécessitant des échantillons de grande taille. Le logiciel qui l’accompagne permet également de personnaliser le protocole du dispositif pour s’adapter à divers tissus et contraintes expérimentales.

Ce protocole mécanique semi-automatisé peut reproduire les résultats d’expériences dans lesquelles les cellules ont été traitées manuellement. Les suspensions cellulaires préparées à l’aide de ce dispositif et par dissociation manuelle montrent des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables dans les tissus pulmonaires, rénaux et cardiaques de souris (Figure 2A,B). Les populations de cellules immunitaires, telles que les lymphocytes T et les cellules de...

Un protocole général pour la dissociation mécanique enzymatique et semi-automatisée combinée des tissus afin de générer des suspensions unicellulaires pour des analyses en aval, telles que la cytométrie en flux, est fourni. Des instructions pour la fabrication, l’assemblage et le fonctionnement du dispositif mécanique à faible coût développé pour ce protocole sont incluses.

Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Notre laboratoire développe des nanoparticules comme outils pour étudier les barrières biologiques et surmonter ces barrières à la surface des muqueuses afin d’améliorer l’administration de médicaments et l’immunothérapie. L’un des développements les plus notables est celui des vaccins COVID-19 de Pfizer, BioNTech et Moderna qui utilisent des formulations de nanoparticules lipidiques pour délivrer de l’ARNm pour la vaccination. De nombreux efforts sont en cours pour améliorer les immunothérapies telles que les vaccins et les traitements contre le cancer utilisant des nanoparticules, car ces formulations pourraient améliorer l’administration de la cible aux cellules immunitaires et réduire les effets secondaires systémiques des immunothérapies.L’analyse de cellules uniques est une composante essentielle de l’immunologie dans la recherche biomédicale, l’une des techniques les plus courantes étant la cytométrie en flux. La réalisation de tels isolements cellulaires à partir de tissus d’intérêt nécessite une dissociation tissulaire fiable. Rendre la recherche en laboratoire plus accessible sans compromettre la qualité et la précision peut être un défi.L’automatisation des processus facilite l’apprentissage des étapes techniques et laborieuses et permet aux stagiaires d’acquérir de l’expérience en effectuant des analyses plus sophistiquées sans affecter la fiabilité des résultats. Le principal avantage de ce protocole et de la conception de l’appareil qui l’accompagne est sa personnalisation et sa rentabilité. La possibilité de traiter jusqu’à 12 tissus simultanément réduit les temps de traitement.Cette alternative peu coûteuse rend cette technologie plus accessible dans les milieux de recherche à faibles ressources.

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Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

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Ce protocole décrit la dissociation rapide non enzymatique de fragments de tissus humains frais pour l’évaluation qualitative et quantitative des cellules CD45+ (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins. De plus, le surnageant obtenu à partir de l’homogénat de tissu primaire peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation plus approfondie.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

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Cet article fournit un protocole simplifié pour la dissection et la dissociation de l’épithélium olfactif murin à des fins de séquençage de l’ARN à noyau unique.

Dissection rapide et dissociation de l’épithélium olfactif de souris pour des suspensions à noyau unique

Apprenez la dissociation mécanique de tissus pour l'analyse de cellules uniques en immunologie et recherche biomédicale. Cette méthode semi-automatisée améliore l'accessibilité et la fiabilité des protocoles de laboratoire.

Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

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