Name: Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Découvrez l'isolement d'astrocytes et de microglies viables à partir de la moelle épinière de souris adulte par dissociation enzymatique et tri cellulaire. Cette méthode permet des études in vitro des pathologies de la moelle épinière.

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Nous remercions Castle Raley du George Washington University Genomics Core pour les analyses d’ARN et Q2 Lab Solutions pour les analyses de séquençage d’ARN. Ces travaux ont été financés par l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux [numéro de subvention F31NS117085] et le Fonds de dotation de recherche Vivian Gill au Dr Robert H. Miller. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Toutes les procédures expérimentales et de soins aux animaux ont été menées à la suite de l’approbation du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université George Washington (Washington, D.C., États-Unis ; IACUC#2021-004). L’étude a utilisé des souris mâles et femelles de type sauvage (WT) C57BL/6J âgées de 10 semaines à 5 mois, provenant d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux) et hébergées à l’Université George Washington. Une vue d’ensemble du flux de travail du protocole est présentée à la figure 1.
1. Préparation de la moelle épinière
<ol><li>Anesthésier les animaux à l’aide d’Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-tribromoéthanol et 2,5 % de 2-méthyl-2-butanol dans de l’eau stérile) (voir le tableau des matériaux). Confirmez l’absence de réponse aux pincements des orteils et de la queue chez les souris.</li>
	<li>Effectuer une perfusion cardiaque avec 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) pour éliminer les cellules mononucléées du sang périphérique.<ol><li>Placez l’animal sur un plateau peu profond et faites une incision latérale pour exposer la cavité pleurale. Insérez une aiguille de perfusion de 23 G reliée à une pompe péristaltique (voir tableau des matériaux) dans le ventricule gauche et activez la pompe. Une fois que le DPBS froid circule dans le cœur, créez une petite incision dans l’oreillette droite. REMARQUE : Un débit de perfusion plus rapide est préférable dans cette étape pour améliorer la viabilité cellulaire. Le sang doit être évacué en moins de 1 minute. Le dégagement du foie indique une perfusion réussie.</li>
	</ol></li>
	<li>Décapitalisez l’animal à l’aide de grands ciseaux et retirez la colonne vertébrale14. Plongez-le dans 1x DPBS froid avec Ca2+/Mg2+/0,2% de glucose dans une boîte de Pétri sur glace pour le rinçage des tissus.</li>
	<li>À partir de maintenant, assurez-vous que toutes les étapes sont effectuées dans un environnement stérile. Utilisez l’extrusion hydraulique14 pour isoler l’ensemble de la moelle épinière. Utiliser une aiguille de 18 G et une seringue de 10 ml remplie de 1x DPBS froid avec Ca2+/Mg2+/0,2% de glucose. Transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri placée sur des blocs réfrigérants contenant suffisamment de froid 1x DPBS avec Ca2+/Mg2+/0,2% de glucose pour immerger tout le tissu.</li>
	<li>Retirez soigneusement les méninges au microscope à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri vide sur des blocs réfrigérants et, à l’aide d’un scalpel chirurgical à lame n° 10, coupez toute la moelle épinière en sections de 2 à 3 mm.</li>
</ol>2. Dissociation des cellules enzymatiques
<ol><li>Ajouter le mélange enzymatique 1 et le mélange enzymatique 2 de la trousse de dissociation cérébrale pour adultes disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Agitez les enzymes dans le plat plusieurs fois pour assurer un revêtement uniforme de la moelle épinière, puis incubez à 37 °C pendant 30 min. Toutes les 5 minutes, agitez doucement le plat pour éviter l’agglutination des tissus et faciliter la distribution uniforme des réactifs.</li>
	<li>Retirer la boîte de l’incubateur et ajouter 350 μL d’ADN I à 0,46 mg/mL dans un milieu minimal essentiel (MEM) (voir le tableau des matériaux). Mélangez en remuant doucement.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de sérum de veau fœtal (FBS) froid DMEM/0,5 % et mélanger en remuant doucement. Transférez immédiatement tout le contenu dans un tube de 5 ml.</li>
</ol>3. Dissociation mécanique des cellules
<ol><li>À l’aide d’une pipette P1000, triturez doucement le tissu trois fois, en veillant à ce que des morceaux de tissu soient prélevés à chaque fois pour dissocier davantage le tissu. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre de 9 pouces bouchée, triturez doucement cinq fois de plus, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit générée pendant le processus.</li>
	<li>Placez le tube de 5 ml à la verticale et laissez le tissu se déposer au fond pendant 30 s. Une fois que le tissu s’est déposé, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette P1000 et le faire passer à travers un filtre de 30 μm dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Dans le même tube de 5 mL avec le reste du tissu, ajouter 1 mL de DMEM/FBS à 0,5 % froid. À l’aide d’une pipette Pasteur, triturer doucement trois fois.</li>
	<li>Laisser le tissu se déposer au fond pendant 30 s, puis passer le surnageant à travers un filtre de 30 μm et le recueillir dans le même tube de 15 ml qu’auparavant. Répétez les étapes 3.3 et 3.4 une fois de plus.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Retirez et jetez soigneusement le surnageant obtenu à l’aide d’un aspirateur sous vide.</li>
</ol>4. Élimination de la myéline
<ol><li>Retirez la myéline à l’aide de la solution d’élimination des débris (DRS) fournie dans la trousse de dissociation cérébrale pour adultes en suivant le protocole du fabricant. Après l’enlèvement des débris, ajoutez 5 mL de DMEM/FBS à froid à la pastille cellulaire et retournez doucement le tube trois fois. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). REMARQUE : Si les cellules doivent être utilisées pour des études in vitro et restent en culture, du DMEM/FBS préchauffé à 0,5 % doit être utilisé à la place.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DPBS/FBS à 0,5 % (froid pour les études d’ARN et chaud pour les essais in vitro ). Comptez les cellules et évaluez leur viabilité à l’aide de Trypan Blue. REMARQUE : Des suspensions cellulaires provenant de plusieurs animaux peuvent être combinées pour augmenter la concentration cellulaire.</li>
	<li>Lavez les cellules en ajoutant du DPBS/0,5 % FBS jusqu’à un volume total de 5 ml. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
</ol>5. Isolement des microglies et des astrocytes
<ol><li>Étiquetez les cellules avec des microbilles anti-CD11b ou anti-ACSA-2 en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Triez les cellules par sélection positive à l’aide des colonnes MS selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Après le tri, centrifugez les cellules triées à 300 x g pendant 10 min et jetez le surnageant.</li>
</ol>6. Cellules de placage pour essais in vitro
REMARQUE : Si les cellules ne sont pas plaquées et seront utilisées immédiatement pour l’analyse de l’ARN, passez à l’étape 8.
<ol><li>Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/FBS à 0,5 % chaud. Comptez les cellules et évaluez leur viabilité à l’aide d’un hémacytomètre (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Ajustez la concentration cellulaire à 75 000 cellules par 50 μL. Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire à chaque lamelle11 recouverte de poly-L-lysine dans une plaque à 24 puits.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 2 h pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle.</li>
	<li>Ajouter délicatement 450 μL de DMEM/FBS/Pénicilline-Streptomycine chaud (Pen-Streptic, voir le tableau des matériaux) dans chaque puits.</li>
	<li>Au bout de 3 jours, remplacez la moitié du milieu par 250 μL de DMEM/FBS/SPiC chaud/5 % de SPeC. Pour l’entretien, remplacez complètement le milieu par 500 μL de DMEM/FBS/5 % de SPF/Pen-Strep tous les 4 à 5 jours.</li>
</ol>7. Immunohistochimie
REMARQUE : Il est préférable d’effectuer des analyses immunohistochimiques après au moins 3 jours lorsque le milieu a été remplacé au moins une fois. Cela permet de s’assurer que les débris ont été éliminés et que les cellules ont complètement adhéré à la lamelle.
<ol><li>Retirez le milieu et étiquetez les cellules avec du mAb anti-souris O4 (1 :100) (voir le tableau des matériaux) dans du DMEM/5% FBS/10% du sérum de chèvre normal (NGS) chaud pendant 15 min à température ambiante (RT) ou à 37 °C. REMARQUE : Ignorez cette étape et passez à l’étape 7.3 si les cellules ne sont pas étiquetées avec O4.</li>
	<li>Rincez délicatement les lamelles en les trempant trois fois dans du DMEM/FBS 5 % chaud. Ajouter 594 IgM anti-souris de chèvre (1 :300) (voir tableau des matériaux) dans du DMEM chaud/5% FBS/10% NGS et incuber à RT pendant 15 min dans l’obscurité. Rincez délicatement trois fois dans du DMEM/FBS à 5 % chaud.</li>
	<li>Fixez les cellules avec de l’acide acétique/méthanol à froid à 5 % pendant 15 min à 4 °C. Laver trois fois avec 1x PBS, puis étiqueter avec l’anticorps approprié : GFAP anti-lapin (1 :500), GFAP anti-souris (1 :500) ou anti-lapin Iba1 (1 :500) dans 1% Triton-X100/10% NGS dans 1x DPBS (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 1 h à RT. REMARQUE : Gardez les lamelles dans l’obscurité si elles ont déjà été tachées d’O4.</li>
	<li>Rincez délicatement trois fois avec du PBS. Étiqueter avec l’anticorps secondaire approprié : anti-souris 594 IgG (1 :500), anti-lapin 488 IgG (1 :500) (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Rincez délicatement trois fois avec du PBS. Contre-coloration avec DAPI (1 : 1000) pendant 1 min à RT. Rincer trois fois avec du PBS, ajouter du produit de montage (voir le tableau des matériaux) et monter les lamelles sur les lames.</li>
</ol>8. Extraction de l’ARN
REMARQUE : Idéalement, il devrait y avoir au moins 100 000 cellules pour extraire suffisamment d’ARN pour l’analyse. Si nécessaire, des cellules de 2-3 moelles épinières peuvent être combinées.
<ol><li>Extraire l’ARN à l’aide d’une trousse d’isolement de l’ARN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour chaque étape de lavage avec le tampon de lavage RW1 fourni dans le kit, laissez les cellules dans le tampon de lavage pendant 2 minutes supplémentaires.</li>
	<li>Retirez tout ADN génomique restant à l’aide de la DNase I conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Incuber avec DNase à RT pendant 15 min, puis laver avec un tampon RW1.</li>
	<li>Pour augmenter le rendement en ARN, avant l’élution, incuber les échantillons dans de l’eau exempte d’ARNase à RT pendant 10 minutes. Évaluer l’intégrité et la quantité d’ARN à l’aide d’un bioanalyseur15 (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>

Extraction efficace des astrocytes et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
<li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons%3A+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic%2C+infectious%2C+inflammatory%2C+and+autoimmune+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712(2019).</li>
<li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia%3A+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).</li>
<li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration%2C+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).</li>
<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226(2017).</li>
<li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li>
<li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Aucun

L’isolement de cellules primaires pures et viables est primordial pour étudier la structure et la fonction de types cellulaires spécifiques. Chez la souris adulte, en particulier dans la moelle épinière, cette tâche pose des défis importants, car les protocoles existants ne sont souvent pas adaptés à la moelle épinière adulte10,17. Ce protocole présente une méthode efficace et rentable applicable à diverses applications en aval, notamment la culture cellulaire, l...

Les astrocytes et les microglies sont des cellules gliales polyvalentes qui jouent un rôle vital dans le système nerveux central (SNC), englobant des responsabilités telles que la régulation de la fonction neuronale, la contribution au développement du SNC, le maintien de la barrière hémato-encéphalique et la participation à d’autres processus critiques 1,2,3,4 . Outre leur rôle dans le maintien de l’homéostasie, ces cellules gliales jouent également un rôle central dans les mécanismes de blessure et de réparation. Les microglies sont bien connues pour leurs capacités phagocytaires, inflammatoires et migratoires à la suite d’insultes ou de blessures 5,6,7. Les réponses des astrocytes dans la maladie sont tout aussi diverses, englobant des contributions à l’inflammation, à la formation de cicatrices gliales et à la compromission de la barrière hémato-encéphalique 8,9. Bien que notre compréhension des rôles néfastes et réparateurs des microglies et des astrocytes dans le SNC se soit améliorée, l’hétérogénéité inhérente à leur structure et à leur fonction nécessite des outils robustes pour les étudier dans divers contextes.
Pour mieux comprendre le rôle de la microglie et des astrocytes dans la santé et la maladie, il faut une approche combinée d’études in vivo et in vitro . Les techniques in vivo tirent parti de la diaphonie complexe entre les cellules gliales et les neurones au sein du SNC, tandis que les méthodologies in vitro s’avèrent précieuses pour évaluer les fonctions ou les réponses d’une seule cellule sous des stimuli spécifiques. Chaque méthode offre des avantages uniques ; Les études in vitro sont essentielles pour comprendre les rôles spécifiques de ces types de cellules sans apport direct ou indirect des cellules voisines. De plus, les essais in vitro utilisant des lignées cellulaires immortelles présentent certains avantages, notamment la capacité de proliférer indéfiniment, la rentabilité et la facilité d’entretien. Cependant, il est important de noter que les cellules primaires imitent plus étroitement les réponses physiologiques normales que les lignées cellulaires. Cette pertinence physiologique est cruciale dans les tests fonctionnels et les analyses transcriptomiques.
L’un des défis liés à l’obtention de cellules primaires, en particulier à partir de la moelle épinière de souris adultes, réside dans la quantité et la viabilité des échantillons. La moelle épinière adulte, étant plus petite que le cerveau et contenant une quantité importante de myéline, pose des difficultés uniques. Bien qu’il existe plusieurs protocoles publiés détaillant l’isolement de cellules gliales pures et viables provenant d’animaux nouveau-nés ou du cerveau de souris adultes 10,11,12,13, ces méthodologies peuvent ne pas convenir à l’étude des maladies et des lésions spécifiques à la moelle épinière. Dans ce protocole, nous proposons une procédure complète pour isoler efficacement les microglies et les astrocytes purs et viables de la moelle épinière de souris adultes, facilitant ainsi les applications en aval dans les cultures cellulaires et les analyses transcriptomiques. Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler ces cellules de souris adultes âgées de 10 semaines à 5 mois, démontrant son utilité dans divers contextes, y compris des études impliquant des souris knock-out conditionnelles, des réponses aux médicaments, des recherches sur le développement et des modèles liés à l’âge.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoéthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Méthyl-2-butanol, 98 %</td> <td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>45 % solution de glucose</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tubes bouchés de 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation du cerveau adulte</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microbilles anti-ACSA2</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>souris C57BL/6J de type sauvage (WT)</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglie) Microbilles</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 & micro ; m filter</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage (hémacytomètre)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNase pour la purification de l’ARN</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>GFAP (souris)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps GFAP (lapin)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps Iba1 (lapin)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Séparateur MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Système de pompe</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Montage</td><td>Medium Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS Colonnes</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 Anticorps</td><td>R& D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pasteure en verre 9" bouchée</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek Lame de scalpel chirurgical n° 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perfusion veineuse pour petites veines, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Les astrocytes et les microglies jouent un rôle central dans le développement du système nerveux central, les réponses aux blessures et les maladies neurodégénératives. Ces cellules très dynamiques présentent des réponses rapides aux changements environnementaux et présentent une hétérogénéité significative en termes de morphologie, de profils transcriptionnels et de fonctions. Bien que notre compréhension des fonctions des cellules gliales dans la santé et la maladie ait considérablement progressé, il reste nécessaire de procéder à des analyses in vitro spécifiques aux cellules dans le contexte d’agressions ou de blessures afin de caractériser de manière exhaustive des populations cellulaires distinctes. L’isolement des cellules de la souris adulte offre plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires ou aux animaux nouveau-nés, car il permet d’analyser les cellules dans des conditions pathologiques et à des moments précis. De plus, l’accent mis sur l’isolement spécifique de la moelle épinière, à l’exclusion de l’atteinte cérébrale, permet la recherche sur les pathologies de la moelle épinière, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les lésions de la moelle épinière et la sclérose latérale amyotrophique. Ce protocole présente une méthode efficace pour isoler les astrocytes et la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant l’analyse immédiate ou future avec des applications potentielles dans des études fonctionnelles, moléculaires ou protéomiques en aval.

Les méthodes décrites dans ce protocole permettent d’isoler des microglies et des astrocytes purs et viables de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi diverses applications en aval, y compris des tests fonctionnels ou histologiques in vitro et des analyses d’ARN.
Un isolement réussi pour des études in vitro se traduira par une prolifération cellulaire continue sur plusieurs jours. Les cellules adultes présentent un taux de prolifération plus lent que les cellul...

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Notre recherche vise à caractériser des populations cellulaires spécifiques du système nerveux central, en particulier de la moelle épinière, à l’aide de modèles précliniques de maladie. Et nous essayons de déterminer comment ces cellules sont affectées dans des conditions pathologiques et à différents moments. Il peut être difficile d’analyser les cellules, en particulier dans le système nerveux central, car les cellules du cerveau et de la moelle épinière forment une matrice très complexe et tout est très étroitement lié, il peut donc être difficile d’isoler ces cellules sans endommager le système.Notre protocole répond aux limites des méthodes existantes pour étudier les maladies de la moelle épinière en isolant efficacement les astrocytes microgliaux viables de la petite moelle épinière de souris adulte riche en myéline. Cela permet de mener des recherches in vitro sur les maladies liées à la moelle épinière dans le cadre d’une analyse en aval, comblant ainsi une lacune cruciale dans la recherche. Ce protocole présente plusieurs avantages tels que l’analyse des astrocytes et des microglies dans des conditions pathologiques et à des moments précis.Il se concentre également uniquement sur l’isolement des cellules gliales de cette seule moelle épinière adulte, à l’exclusion de l’atteinte cérébrale. Cela permet aux chercheurs d’étudier les pathologies de la moelle épinière au niveau cellulaire.

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Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes à partir de souris nouvellement nées.

Isolement des astrocytes : une méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes corticaux de souris

La vidéo montre une technique permettant d’isoler la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte. Tout d’abord, le cortex subit une segmentation et une homogénéisation pour éliminer les neurones et autres cellules gliales, préservant ainsi la microglie. Ensuite, la suspension cellulaire est exposée à des microbilles magnétiques anti-myéline et à un champ magnétique, séparant efficacement les cellules microgliales et myéloïdes des débris de myéline et des cellules contenant de la myéline.

Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte

Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d'obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Le développement de la douleur neuropathique implique des changements pathologiques des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale. Un système de culture gliale fiable provenant d' un tissu de la moelle épinière adulte et conçu pour l' étude de ces cellules in vitro est absente. Par conséquent, nous montrons ici comment établir cultures primaires gliales mixtes de souris adultes tissu de la moelle épinière.

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour générer des cultures hautement enrichies d’astrocytes dérivés de différentes régions du système nerveux central de souris postnatales et leur conversion directe en neurones fonctionnels par l’expression forcée de facteurs de transcription.

Isolement et reprogrammation neuronale directe des astrocytes de souris

Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Découvrez l'isolement d'astrocytes et de microglies viables à partir de la moelle épinière de souris adulte par dissociation enzymatique et tri cellulaire. Cette méthode permet des études in vitro des pathologies de la moelle épinière.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

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