Quantification de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps dans un modèle sphéroïde tumoral : application à la découverte de médicaments

L’un des traitements ciblés contre le cancer les plus efficaces est basé sur des anticorps tels que l’anticorps anti-HER2 trastuzumab. L’action anticancéreuse du trastuzumab implique une cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, ADCC, par les cellules tueuses naturelles ou NK. La compréhension des mécanismes régulant la sensibilité des cellules cancéreuses à la thérapie par anticorps anti-récepteurs du facteur de croissance, en particulier à l’ADCC, pourrait être cruciale pour le développement de nouvelles modalités de traitement plus efficaces.

Les modèles 3D tels que les sphéroïdes des cellules cancéreuses se sont avérés supérieurs dans la prédiction des réponses immunitaires des tumeurs à diverses thérapies anticancéreuses. Par conséquent, nous avons mis en place un modèle sphéroïde ADCC en utilisant la lignée cellulaire tueuse naturelle NK92, des cellules de carcinome mammaire JIMT-1 exprimant la GFP et le trastuzumab. Nous avons mis en place le système de dosage ADCC en induisant les cellules de carcinome mammaire JIMT-1 anti-HER2-positives à former des amas tridimensionnels appelés sphéroïdes.

La lignée cellulaire JIMT-1 utilisée dans les expériences exprime de manière stable la protéine fluorescente verte. Nous commençons l’expérience en préparant la plaque à 96 puits pour la formation des sphéroïdes. Afin de créer un fond en forme de U et répulsif pour les cellules, enduisez la plaque à 96 puits d’une solution de 0,5 % d’agarose dans du PBS.

Incuber l’assiette à température ambiante pendant environ 30 à 45 minutes. Dans l’intervalle, la trypsinisation et le comptage des cellules JIMT-1 pour l’ensemencement cellulaire. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS stérile.

Ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA dans le flacon et remettez le flacon dans un incubateur à CO2 pendant 10 minutes. Après l’incubation, tapotez le flacon pour vérifier si les cellules JIMT-1 se sont détachées. Arrêtez la digestion avec deux millilitres de milieu JIMT-1 et collectez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres.

Comptez les cellules avec Trypan Blue dans une chambre de Burker et ajustez le nombre de cellules à 20 000 cellules par ml. Ensemencez les cellules dans la plaque à 96 puits en pipetant une suspension cellulaire de 100 microlitres dans chaque puits pour la formation de sphéroïdes. Laissez les cellules s’agglutiner pendant le temps d’incubation de trois jours à 37 degrés dans un incubateur à CO2.

Vérifiez régulièrement la taille et la forme des sphéroïdes à l’aide d’un microscope inversé. Le troisième jour après l’induction des sphéroïdes, enduire la plaque de criblage à 96 puits à haute teneur avec une solution de Pluronic F-127 dans du DMSO. Le revêtement est crucial pour empêcher la fixation des sphéroïdes JIMT-1 EGFP à la surface du verre ou à la plaque.

Après une période d’incubation de 45 minutes à température ambiante, aspirez la solution d’enrobage et lavez les puits deux fois avec le média sans sérum DMEM F12. Transférez les sphéroïdes sur la plaque de criblage à haute teneur à 96 puits en trois exemplaires à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Ajouter du sunitinib dans les puits à la concentration de 40 micromolaires à raison de 10 microlitres par puits, et pipeter du milieu JIMT-1 frais dans les puits témoins afin d’augmenter le volume.

Incubez la plaque pendant une heure dans un incubateur à CO2 à 37 degrés. Pendant que l’incubation des sphéroïdes prétraités est en cours, prélever les cellules NK92 de la fiole dans un tube de 15 millilitres. Comptez les cellules avec le bleu de trypan dans une chambre de Burker et ajustez le nombre de cellules pour atteindre un rapport effecteur/cible de 20 à 1.

Colorez les cellules NK avec une solution à 10 micromolaires de CellTracker Blue et placez-les dans un incubateur à CO2 pendant une heure à 37 degrés. Pour laver l’excédent de colorant, centrifugez les cellules NK deux fois à 150 RCF pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans un milieu JIMT-1 frais.

Ajouter les cellules NK colorées aux sphéroïdes cibles JIMT-1 EGFP en pipetant 55 microlitres par puits avec l’anticorps anti-HER2 trastuzumab. Diluer le trastuzumab dans le milieu JIMT-1 jusqu’à atteindre une concentration de 10 microgrammes par ml. Ajoutez les 110 microlitres de milieu JIMT-1 frais dans les puits de contrôle et incubez la plaque pendant 24 heures dans un incubateur à CO2 à 37 degrés.

En conséquence, le volume total de traitement ajouté pour l’ADCC est de 110 microlitres, et la concentration finale de sunitinib est de 20 micromoles par litre. Pour détecter et mesurer la mort cellulaire apoptotique après les traitements, colorez les sphéroïdes avec un conjugué Annexin V Alexa Fluor 647 pendant une heure dans un milieu JIMT-1. Une fois les étapes expérimentales terminées, transférez la plaque dans l’appareil d’analyse à haut contenu.

La plaque est imagée 24 heures après l’ajout des facteurs NK aux cellules cibles. Pour l’imagerie, nous utilisons l’analyseur à haut contenu et un logiciel d’analyse d’images. Sélectionnez le type de microplaque dans la liste des plaques à l’aide de l’option Type de plaque.

Utiliser une plaque de criblage à 96 puits à haute teneur. Sélectionnez l’autofocus à deux pics comme les tests effectués sur des plaques avec objectif 10x avec une ouverture numérique de 0,3, en utilisant respectivement les options de mise au point automatique et d’objectif. Choisissez le mode Confocal avec l’option OptiMode, puis appliquez Binning 2 à l’aide de l’option Binning.

Pour l’imagerie des sphéroïdes, sélectionnez les canaux appropriés à l’aide de l’option Sélection des canaux. Pour détecter les cellules JIMT-1 transfusées par EGFP, choisissez l’EGFP avec un temps d’intégration de 200 millisecondes, une puissance laser de 50 %, une hauteur d’empilement de deux micromètres, une excitation de 488 nanomètres et des longueurs d’onde d’émission de 500 à 550 nanomètres. Et pour détecter les cellules apoptotiques, utilisez Alexa 647 avec un temps d’intégration de 100 millisecondes, une puissance laser de 50 %, une hauteur d’empilement de 10 micromètres, une excitation de 640 nanomètres, des longueurs d’onde d’émission de 650 et 760 nanomètres.

Pour visualiser les cellules NK dans les sphéroïdes, choisissez le canal suivant, DAPI avec un temps d’intégration de 100 millisecondes, une puissance laser de 50 %, une hauteur d’empilement de deux micromètres, une excitation de 405 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 435 à 418 nanomètres. Dans l’option Sélection de la disposition, sélectionnez Z empilements, car les cellules des sphéroïdes ont tendance à se trouver sur des plans focaux différents du microscope. 10 plans d’une distance de 10 micromètres suffisent pour couvrir toute la région sphéroïdale.

Définissez les valeurs du premier plan et du dernier plan sur 0 micromètre et 90 micromètres, respectivement. Avant de commencer la mesure, des échantillons d’images peuvent être pris avec la fonction Snapshot afin de vérifier les réglages corrects. Définissez le nombre de puits et de champs pour l’imagerie à l’aide de l’option Mise en page définie.

Identifiez les sphéroïdes par fluorescence EGFP ou les cellules JIMT-1 à l’aide de l’option Région de texture fine et filtrez-les par taille. Supprimez les objets de bordure à l’aide du module Sélectionner une population. Étant donné que les cellules positives à l’annexine apparaissent sur les sphéroïdes périphériques, mesurez l’intensité de l’annexine dans le cycle apoptotique.

Dans le module Sélectionner une région, définissez la bordure extérieure sur moins 90. Exprimez les valeurs d’intensité de l’annexine sous forme d’intensité moyenne. Comme indiqué par la coloration à l’annexine V, l’ajout de cellules NK et de trastuzumab aux cellules JIMT-1 a provoqué la mort cellulaire dans les sphéroïdes tumoraux.

Des cellules apoptotiques positives à l’annexine ont émergé dans la zone périphérique des sphéroïdes. En l’absence de trastuzumab, cependant, les cellules NK n’ont pas déclenché l’apoptose des cellules tumorales. Pour faire la distinction entre les effets directs ou médiés par l’ADCC du trastuzumab, le trastuzumab-Fab2 dépourvu de capacité de liaison à la région FC a été utilisé dans cette étude comme témoin négatif.

Étant donné que le trastuzumab-Fab2 était inefficace dans ce modèle, la mort des cellules tumorales est susceptible d’être médiée par l’ADCC. De plus, le prétraitement par le sunitinib a réduit la coloration de l’annexine V dans les sphéroïdes, confirmant la résistance à l’ADCC induite par le sunitinib et révélant la prévention de la mort cellulaire apoptotique dans les sphéroïdes JIMT-1 co-incubés avec des cellules NK et du trastuzumab. Ces données ont confirmé l’effet cytoprotecteur du sunitinib dans le modèle ADCC et appellent à la prudence quant aux combinaisons potentielles d’immunothérapies à base d’ADCC et de sunitinib.

En résumé, notre test HCS pourrait convenir à l’identification de composés stimulant l’ADCC.