Name: Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Découvrez l'analyse de progéniteurs myogéniques par cytométrie de masse unicellulaire dans les muscles squelettiques lésés de souris. Cette méthode révèle les signatures moléculaires et les transitions d'état cellulaire essentielles à la régénération musculaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse CyTOF unicellulaire des progéniteurs myogéniques dans la régénération musculaire

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de 20 g</td><td>KDM</td><td>KD-fine 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 g, seringue d’insuline de 0,5 mL.</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G, seringue à insuline de 0,3 mL</td><td>Seringues BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>3 mL</td><td>Terumo medical</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; Crêtres à cellules m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522 tubes en</td><td></td></tr><tr><td>polypropylène de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>tubes à essai en polystyrène de 5 mL avec 35 & micro ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>seringues de 5 mL</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>tube à centrifuger de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-iodo-2-désoxyuridine (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD104 FITC (clone : 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>Stock = 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD11b APC-Cy7 (clone : M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101226</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD31 APC-Cy7 (clone : 390)</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Cy7 (clone : 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD9 APC (clone : KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone : D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>d’anti-&alpha ; 7 intégrine PE (clone : R2F2))</td><td>UBC AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>Stock = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 laser) instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561 et 633 nm laser</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine 0,3 mg/mL</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (clone : 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>Dy162 ; </td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1 conjugué en interne (clone : 429 MVCAM. a)</td><td>Biolegend</td><td>105701</td><td>Er170 ; </td></tr><tr><td>CD11b conjugué maison (Clone : M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148 ; </td></tr><tr><td>CD29/Integrine &bêta conjugués en interne ; 1 (clone : 9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169 ; CD31 conjugué maison</td></tr><tr><td>(Clone : MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154 ; CD34 conjugué interne</td></tr><tr><td>(Clone : RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175 ; CD44 conjugué interne</td></tr><tr><td>(clone : IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171 ; CD45 conjugué maison</td></tr><tr><td>(Clone : MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147 ; CD9 conjugué maison</td></tr><tr><td>(Clone : KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174 ; Conjugué interne</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 (Clone : 30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144 ; CD98 conjugué maison</td></tr><tr><td>(Clone : H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141 ; Solution d’acquisition cellulaire conjuguée interne</td></tr><tr><td>/Maxpar CAS-buffer</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Intercalateur Cell-ID-Iridium</td><td>Standard Biotools</td><td>201192B</td><td>Intercalateur d’acide nucléique cationique</td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatine (dichlorure de cis-diammineplatinum(II)</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Transparent 1,5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase, Type II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td><td>Merck</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (Clone : 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158 ; DAPI conjugué maison</td></tr><tr><td>(1 mg/mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Dark 1,5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dissection</td><td>Ciseaux Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (faible teneur en glucose, avec pyruvate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique)</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments (billes EQ)</td><td>Standard Biotools</td><td>201078</td><td>Perles d’étalonnage</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié, origine Brésil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5SF</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Helios CyTOF system</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sérum pour cheval, inactivé par la chaleur, origine Nouvelle-Zélande</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>Iridium-Intercalator</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>Isoflurane/Attane Vet</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (Clone : C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173 ; MyoD conjugué interne</td></tr><tr><td>(Clone : 5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164 ; MyoG conjugué maison</td></tr><tr><td>(Clone : F5D)</td><td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160 ; Conjugué maison</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Stérile Flacon jetable Top 0.20 &mu ; M PES Filtres</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>Remettre en suspension à 50 &micro ; g/ml dans le PBS stérile. Conservez des stocks (par exemple 50 & micro ; l) à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Mélange de nutriments F-10 (Ham’s)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt (Clone : D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (Clone : PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153 ; </td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine conjuguée maison (10 000 U/mL) (Pen/Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration PES 0,20 &mu ; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>PES Filtre à seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16 % EM grade</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique,&nbsp ; anhydre (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb (Clone : J112-906)</td><td>Standard Biosciences</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6 kinase (Clone : N7-548)</td><td>Standard Biotools</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1 (Clone : E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142 ; Azoture de sodium conjugué</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium, dibasique, heptahydraté (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline stérile 0,9</td><td> %Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>et alpha ; 7 intégrine (clone : 3C12)</td><td>MBL international</td><td>K0046-3</td><td>Ho165 ; Conjugué maison</td></tr></tbody></table>

identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Nous présentons ici un aperçu du dispositif expérimental d’utilisation de cette approche combinée, qui comprend : (i) l’analyse CyTOF de haute dimension de l’évolution temporelle d’une lésion aiguë par injection de notexine pour étudier la dynamique cellulaire et moléculaire des cellules souches et progénitrices dans le muscle squelettique (Figure 1, schéma du haut) ; et (ii) FACS de cellules souches et progénitrices à l’aide de deux marqueurs de surface cellulaire, CD9 et CD104, pour isoler...

Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

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Biology

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Méthode pour la dissociation enzymatique, l'étiquetage de surface et de la purification par cytométrie en flux de fibro / adipogéniques et les progéniteurs myogéniques du muscle squelettique murin.

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Les principaux types de cellules adhérentes dérivées du muscle humain sont les cellules myogéniques et les fibroblastes. Ici, les populations cellulaires sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme basé sur l’antigène CD56. L’immunomarquage ultérieur avec des anticorps spécifiques et l’utilisation de techniques d’analyse d’images permettent de quantifier les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires dans les cellules individuelles.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour induire régénération du muscle squelettique aiguë chez la souris adulte et manipulations ultérieures des muscles, comme la dissection, le gel, la coupe, coloration de routine, et myofibre analyse de surface en coupe transversale.

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

L'autophagie active est associée à la régénération musculaire productive, ce qui est essentiel pour l'activation des cellules souches musculaires (MuSC). Ici, nous fournissons un protocole pour la détection in situ de LC3, un marqueur autophagique dans les muSCs MyoD-positives de sections de tissu musculaire à partir de souris témoins et blessées.

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Ici, nous décrivons une méthodologie pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'un tissu musculaire adulte. Ces cellules sont utilisées pour étudier la différenciation in vitro des muscles squelettiques et, en particulier, pour étudier les protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ .

L&#39;isolement des myoblastes humains, l&#39;évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l&#39;entrée de calcium par magasin

Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.

Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique.  les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

Nous décrivons une méthode in vivo pour étudier la perte fonctionnelle d'un gène spécifique dans les cellules satellites en utilisant une combinaison de la blessure médiée par cardiotoxine du muscle squelettique et l'injection d'un siRNA auto-livrant.

Analyse de la fonction des cellules satellitaires pendant la régénération musculaire squelettique par des lésions cardiotoxines et l'injection de siRNA In Vivo

Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

Dans ce protocole, une méthode de culture in vitro et d’analyse fonctionnelle des cellules souches musculaires est décrite, qui préserve la plupart de leurs interactions avec leur niche endogène.

Essai de culture de myofibère unique pour l’évaluation de la fonctionnalité des cellules souches musculaires adultes Ex Vivo

L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.

FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés

Découvrez l'analyse de progéniteurs myogéniques par cytométrie de masse unicellulaire dans les muscles squelettiques lésés de souris. Cette méthode révèle les signatures moléculaires et les transitions d'état cellulaire essentielles à la régénération musculaire.

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