Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension
1 décembre 2023
Le protocole présenté ici permet l’identification et l’analyse de haute dimension des cellules souches musculaires et progénitrices par cytométrie de masse unicellulaire et leur purification par FACS pour des études approfondies de leur fonction. Cette approche peut être appliquée pour étudier la dynamique de régénération dans des modèles de maladies et tester l’efficacité d’interventions pharmacologiques.
Notre recherche porte sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement des cellules souches dans le vieillissement et la maladie. Notre objectif est de comprendre comment les cellules souches et progénitrices musculaires interagissent avec d’autres cellules du microenvironnement musculaire pour obtenir une régénération efficace. Nous étudions également si une communication cellulaire stérile a un impact sur la fonction des cellules souches musculaires dans le vieillissement et la maladie.
L’un des principaux obstacles à l’étude de la communication entre cellules dans le créneau des cellules souches a été le manque de technologies permettant de résoudre une seule cellule. La cytométrie de masse unicellulaire permet une analyse quantitative simultanée à haut débit sur plusieurs types de cellules et phénotypes moléculaires dans des tissus complexes. Notre protocole permet la purification et le profilage en profondeur des cellules souches rares et de la descendance lors de la régénération musculaire à l’aide d’anticorps contre des marqueurs de surface cellulaire et des facteurs de transcription myogéniques.
L’étude de ces cellules nous aide à comprendre comment le destin des cellules souches musculaires est contrôlé et à découvrir les réseaux qui entraînent les transitions d’état cellulaire et la régénération efficace. Mesurer jusqu’à 50 protéines de surface cellulaire et intracellulaires simultanément au niveau d’une seule cellule est une approche précieuse pour étudier la fonction cellulaire dans le tissu musculaire. Cette technique permet d’identifier des signatures moléculaires uniques et de révéler de nouveaux mécanismes de dysfonctionnement des cellules souches musculaires dans le vieillissement et la maladie.
Ce protocole permet d’étudier l’impact de la transition de l’état cellulaire sur la régénération tissulaire en bonne santé et en maladie. La signature des cellules souches activées que nous présentons ici permet d’étudier la quiescence des cellules souches. Ils n’étaient pas possibles auparavant.
Nous pouvons maintenant purifier les cellules souches activées, CD98 High, CD44 High, en nous basant uniquement sur le marqueur de surface cellulaire, et étudier pour la première fois, comment elles retournent à la quiescence.
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Aperçu
Cette recherche étudie les mécanismes moléculaires du dysfonctionnement des cellules souches et progénitrices musculaires au cours du vieillissement et des maladies. Grâce à l'application de la cytométrie de masse unicellulaire et de la FACS, l'étude se concentre sur la manière dont ces cellules interagissent au sein du microenvironnement musculaire et sur leurs rôles dans la dynamique de régénération, fournissant ainsi des informations sur d'éventuelles interventions thérapeutiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie musculaire
- Fonction des cellules souches
- Dynamique de la régénération
Contexte
- Le dysfonctionnement des cellules souches affecte la régénération tissulaire au cours du vieillissement et des maladies.
- Une communication efficace entre les cellules est cruciale au sein du compartiment des cellules souches.
- Les technologies antérieures ne permettaient pas une résolution au niveau de la cellule unique pour une étude détaillée.
Méthodes utilisées
- Cytométrie de masse à cellule unique pour l'analyse en haute dimension.
- Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la purification des cellules.
- Modèles murins in vivo pour les études de régénération.
Résultats principaux
- Identification de signatures moléculaires uniques dans les cellules souches musculaires.
- Compréhension de la quiescence et de la réactivation des cellules souches.
- Caractérisation des transitions d'état cellulaire essentielles à une régénération efficace.
Conclusions
- Cette étude démontre l'utilité des techniques avancées de cytométrie dans la compréhension de la biologie des cellules souches musculaires.
- Les résultats sont pertinents pour le développement de stratégies thérapeutiques contre la dégénérescence musculaire liée à l'âge.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La cytométrie de masse à cellule unique en haute dimension permet une identification précise et un profilage des progéniteurs myogéniques et des cellules souches au cours d'une lésion aiguë du muscle squelettique, comblant ainsi un manque critique dans la compréhension des dynamiques régénératives. Cette capacité renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les portefeuilles de recherche sur les maladies musculaires et la médecine régénérative. L'approche soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données cellulaires quantitatives et reproductibles, pertinentes pour la découverte précoce et la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en résolvant les dynamiques cellulaires et moléculaires durant la régénération musculaire.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles grâce à l'identification des états activés des cellules souches et progénitrices à l'aide de marqueurs multiplexés.
- Facilite la détection mécanistique des risques en révélant les transitions d'état cellulaire et les signatures de dysfonctionnement dans les modèles de maladie.
- Améliore la confiance prédictive pour le tri du portefeuille en quantifiant les populations cellulaires rares et leur état d'activation.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage en aval en isolant des populations définies de cellules souches et progénitrices par tri cellulaire assisté par fluorescence (FACS).
- Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des mesures quantitatives, multidimensionnelles et à résolution unicellulaire des protéines.
- Facilite la préparation à un criblage évolutif en permettant l’analyse simultanée de jusqu’à 50 marqueurs par cellule.
- Fournit des résultats quantitatifs fiables pour l’évaluation de composés dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les modèles pertinents pour la maladie en permettant l'analyse in vivo de la dynamique des cellules souches et progénitrices après une lésion ou une intervention pharmacologique.
- Permet la découverte de biomarqueurs translationnels en reliant les signatures moléculaires aux résultats régénératifs.
- Facilite la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en permettant des études fonctionnelles de populations cellulaires isolées.
- Réduit les risques lors du passage à l'avancement préclinique en fournissant des connaissances mécanistiques sur le dysfonctionnement des cellules souches dans le vieillissement et la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'étend de la phase initiale de découverte jusqu'à l'identification de composés candidats et à la recherche préclinique, en soutenant la vérification d'hypothèses, la clarification des voies biologiques et la réduction des risques biologiques dans les études sur la régénération musculaire.
- Biologie de la découverte : Le profilage quantitatif des cellules souches et progénitrices clarifie les voies régénératrices et les décisions concernant le destin cellulaire.
- Écrantage : L'analyse des marqueurs en haute dimension garantit la préparation et la reproductibilité des tests pour les applications en aval.
- Analytique : Les mesures protéiques multiplexées et les algorithmes de regroupement permettent une comparaison robuste des états et conditions cellulaires.
- Recherche translationnelle : L'application in vivo dans des modèles de maladies soutient l'alignement des biomarqueurs et la continuité translationnelle.
- Réutilisation en entreprise : La plateforme peut être adaptée à diverses études sur les modèles régénératifs et les maladies, favorisant une large réutilisation en recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des analyses standardisées, reproductibles et évolutives au niveau cellulaire unique pour les populations cellulaires rares.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et une gestion efficace du portefeuille en capital en quantifiant la dynamique des cellules régénératrices.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes de régénération et de modification de la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en cellule unique, tri cellulaire par flux (FACS) et analyse de données en haute dimension.
- Exige un accès à un équipement de cytométrie de masse et à une infrastructure informatique avancée.
- Implique une standardisation interéquipes des panels d'anticorps et des stratégies de sélection des événements pour assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à différents modèles de lésion ou de maladie musculaire peut nécessiter une optimisation des panels de marqueurs.
- Le débit et la sensibilité sont limités par la capacité de l'instrument et l'abondance des cellules rares.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
1:59
Induction of Acute Injury by Notexin Injection in the Mouse Skeletal Muscle
3:36
Dissection of the Mouse Skeletal Muscle After Notexin Injury and Cell Dissociation Procedure for Single‐Cell Analysis
5:17
Live/Dead Staining of Skeletal Muscle Cells,Isolated from Notexin‐Injured Mice,with Cisplatin and Paraformaldehyde Fixation
7:38
Skeletal Muscle Cells Preparation for Loading into Mass Cytometer and CyTOF Data Analysis
