Name: Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 15 s
Description: Apprenez une méthode efficace d'enrichissement de la microglie de la moelle épinière de souris. Ce protocole de digestion somatique et centrifugation sur gradient de densité permet d'atteindre une pureté de 99% avec moins de contamination par les astrocytes.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la bourse accordée par le Conseil national de la science et de la technologie (CONACYT) (702361). Les auteurs reconnaissent le programme de doctorat en sciences biologiques et chimiques de l’École nationale des sciences biologiques de l’Institut national polytechnique.

L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpital pour enfants de Mexico, où elles ont été élevées dans des conditions isolées dans des racks ventilés, conformément aux directives institutionnelles en matière de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation des matériaux et des réactifs
<ol><li>Préchauffer le PBS sans Ca 2+ et Mg2+ ainsi que la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C.</li>
	<li>Compléter la solution HBSS avec 100 μg/mL de Liberase et 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Assurez-vous que la solution maintient un pH physiologique de 7,4. REMARQUE : 1 mL de solution de travail par moelle épinière sera nécessaire.</li>
	<li>Préparez une solution isotonique à 90 % pour la centrifugation à gradient de densité (disponible dans le commerce, voir le tableau des matériaux) et préchauffez-la à 37 °C.</li>
	<li>Préparez le tampon de coloration en combinant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 % avec du PBS et conservez le mélange sur de la glace.</li>
	<li>Préchauffer le Modified Eagle’s de Dulbecco à une glycémie moyennement élevée (1 g/L) (DMEM) à 37 °C.</li>
	<li>Complétez le milieu DMEM avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 200 U/mL de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine et 500 pg/mL d’amphotéricine B (voir le tableau des matériaux) pour préparer le DMEM-S.</li>
</ol>2. Dissection et préparation de la moelle épinière
<ol><li>Euthanasier la souris avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital à une dose de 150 mg / kg. Stérilisez le thorax et le dos de la souris avec de l’éthanol à 70 %. REMARQUE : Confirmer que l’euthanasie a réussi avant de procéder à la dissection chez la souris.</li>
	<li>Rasez la région thoraco-lombaire et fixez les extrémités à la planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel, faites une incision soigneuse le long de la ligne médiane dorsale, de la région occipitale à la région sacrée (figure 2).</li>
	<li>À l’aide d’un microscope chirurgical stéréoscopique, disséquer en couches jusqu’à atteindre la colonne lombaire et identifier la dernière arcade costale. REMARQUE : Les 13 arcs costaux sont articulés dans les vertèbres thoraciques ; lorsqu’elles sont disséquées, elles deviennent visibles supérieures à la vertèbre L12.</li>
	<li>Déterminez la dernière vertèbre cervicale et le sacrum, puis faites une incision pour séparer la colonne vertébrale (Figure 2).</li>
	<li>À l’aide d’une pince à disséquer, effectuer une laminectomie dorsale des vertèbres pour extraire la moelle épinière (figure 3A-D). REMARQUE : À l’exception des deux premières vertèbres cervicales (atlas et axe), toutes les vertèbres mobiles partagent une conception morphologique commune dans diverses régions (cervicale, thoracique ou lombaire). Chaque vertèbre mobile typique présente un corps vertébral cylindrique à son extrémité antérieure. Attaché à l’arrière du corps se trouve un arc osseux connu sous le nom d’arc vertébral (arc neural), composé de lames et d’apophyses épineuses. Entre ces structures se trouve le foramen vertébral15.</li>
	<li>Enlever les nerfs émergeant à travers les foramens (racines dorsale et ventrale) qui constituent le système nerveux périphérique et peuvent contenir des macrophages infiltrés (Figure 3D). REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever la pie-mère ou les méninges car le milieu de gradient de densité élimine efficacement les astrocytes contaminants. De plus, la conservation des méninges réduit le temps de purification et améliore la viabilité.</li>
</ol>3. Digestion tissulaire et isolement de la microglie
<ol><li>Placez la moelle épinière sur la planche à disséquer et, à l’aide de ciseaux Vannas, coupez la moelle épinière en morceaux de 2 mm, ce qui donne une moyenne de 10 morceaux.</li>
	<li>Transférez les sections de la moelle épinière dans un microtube à fond plat de 2 ml (figures 3E et F).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la solution de travail HBSS-LD (étape 1.2). Incuber à 37 °C pendant 25 min, en vortex vigoureusement toutes les 5 min.</li>
	<li>Passer le contenu de chaque digestion dans une passoire de 40 μm, puis ajouter 7 mL d’HBSS avec 2 % de FBS pour neutraliser la digestion.</li>
	<li>Écraser le reste du tissu à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml. Centrifuger la suspension dans un tube conique de 50 mL pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette de 1 mL et remettre le pastille en suspension dans 2 mL d’HBSS avec 2 % de FBS dans un tube conique de 15 mL. Mélanger avec 2 mL de milieu à gradient de densité isotonique à 90 %. Centrifuger pendant 25 min à 160 x g, 18 °C. REMARQUE : Utilisez une accélération lente et évitez d’utiliser le frein.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert, récupérer l’interface et la transférer dans un tube conique de 15 mL. Laver les cellules avec 10 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans DMEM-S (étape 1.6) et les conserver sur de la glace.</li>
</ol>4. Détermination de la pureté et de la viabilité
<ol><li>Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre, utilisez une coloration au bleu trypan à 0,4 % (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : En moyenne, une seule souris fournit 4 à 6 millions de cellules.</li>
	<li>Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’un cytomètre en flux, utilisez un colorant fluorescent réactif aux amines disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Transférez 1 million de cellules dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond (FACS). Diluer le colorant fluorescent avec du PBS dans un rapport de 1 :1000 (pour créer la solution de travail de viabilité).</li>
		<li>Incuber les échantillons avec la solution de viabilité dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration (étape 1.4).</li>
		<li>Bloquer les cellules avec de l’anti-FcRIII/I 2.4G2 (voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration glacé pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Formuler le cocktail de coloration des anticorps en ajoutant les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence CD45-PerCP et CD11b-eFluor 450 au tampon de coloration (à une dilution de 1 :300) (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Bien que les deux techniques soient disponibles, choisissez celle qui correspond le mieux au protocole suivant.</li>
		<li>Incuber les échantillons avec le cocktail de coloration d’anticorps dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez deux fois les cellules avec un tampon de coloration glacé. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration.</li>
		<li>Acquérir 250 000 événements sur un cytomètre en flux, comme indiqué dans la stratégie de déclenchement à l’étape 6 (Figure 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloration immunofluorescente
<ol><li>Placez une lamelle prétraitée dans un puits d’une plaque à 6 puits. REMARQUE : Pour traiter les lamelles, les placer dans une boîte de Pétri avec 500 μL de solution de L-polylysine (0,01 mg/mL, voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée et laissez-les sécher.</li>
	<li>Ensemencer 200 000 cellules sur la lamelle traitée à l’aide de 500 μL de solution DMEM-S. Incuber pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez les lamelles et fixez les cellules à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 % pendant 20 min à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.</li>
	<li>Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec du PBS froid. Bloquer les cellules avec 0,2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Diluer les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence (à une dilution de 1 :300, voir tableau des matériaux) dans la solution bloquante et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.</li>
	<li>Appliquez un support de montage contenant du DAPI sur la lame, puis scellez-la avec une lamelle. REMARQUE : Les lames peuvent être immédiatement analysées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal, ou elles peuvent être stockées jusqu’à 3 mois à -20°C.</li>
</ol>6. Stratégie de déclenchement pour la microglie de la moelle épinière
<ol><li>Générez un diagramme à points et établissez une porte pour isoler les cellules viables en fonction de la coloration de la viabilité et d’un canal fluorescent vide16. Exclure les cellules non viables.</li>
	<li>Produire un autre tracé en utilisant les paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés pour éliminer les débris16.</li>
	<li>Développer un diagramme à points supplémentaire et analyser l’expression de CD11b et CD45 pour différencier la microglie.</li>
</ol>

Extraction et purification enzymatique de la microglie de la moelle épinière de souris

<ol><li>Schröder,, Moser,, Huggenberger, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchr%C3%B6der%2C+H+%22Neuroanatomy+of+the+Mouse%22">Neuroanatomy of the Mouse</a>. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).</li>
<li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+%28P4%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li>
<li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBab%2C+I+%22Microtomographic+atlas+of+the+mouse+skeleton%22">Microtomographic atlas of the mouse skeleton</a>. VIII, First ed, Springer. 205(2007).</li>
<li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+biology%3A+one+century+of+evolving+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li>
<li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).</li>
<li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+IL-36%CE%B3%2FIL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li>
<li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li>
<li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mo.+Sci%22%5BJournal%5D)">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li>
<li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+vertebral+column%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li>
<li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme%3A+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+%CE%B1-+and+%CE%B2-cells%2C+cellular+survival%2C+and+intrainsular+cross+talk%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals17. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes13,14. Ces techniques impliquent une digestion enzymatique à l’aid...

La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière1. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales 2,3. La longueur de la moelle épinière est similaire à celle de la colonne vertébrale et le filum terminal est une structure non nerveuse qui ancre la moelle épinière au sacrum. De plus, les fibres nerveuses sortent par le foramen intervertébral1.
Le développement et le bon fonctionnement du système nerveux central chez les mammifères dépendent de manière critique de l’activité des macrophages résidents du système nerveux, appelés microglie4. Bien que les microglies aient été initialement décrites comme des phagocytes résidents du cerveau, des recherches récentes ont attribué de nombreuses fonctions dynamiques à ces cellules 5,6. La taille de la microglie varie de 7 à 10 μm en homéostasie ; Elles sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme et peuvent s’adapter morphologiquement et fonctionnellement à leur environnement en constante évolution7. Ces cellules présentent une forte hétérogénéité au stade embryonnaire et au stade adulte8,9, tandis qu’au stade adulte, elles présentent également une hétérogénéité fonctionnelle complexe en fonction de leur contexte spatio-temporel10. L’hétérogénéité et les multiples fonctions de la microglie permettent une expression et un comportement différentiels des gènes dans la moelle épinière et le cerveau. Il a été démontré que l’expression de CD11b, CD45, CD86 et CCR9 est plus élevée dans la moelle épinière que dans le cerveau 8,9.
Il existe plusieurs protocoles pour l’isolement de la microglie cérébrale11,12 ; cependant, il n’en existe que quelques-uns pour la microglie de la moelle épinière13,14. L’optimisation d’une méthode de purification de la microglie de la moelle épinière facilite le développement de multiples études axées sur la découverte de la physiologie de la microglie. Ce protocole vise à décrire une extraction simple et hautement reproductible de la moelle épinière de souris et la purification de la microglie (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Tubes de collecte de 15 mL</td><td>Corning, États-Unis</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes de 2 mL</td><td>Axygen,</td><td>États-Unis MCT-200-G</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 anti-FcR</td><td>BioLegend, États-Unis</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de collecte de 50 mL</td><td>Corning, États-Unis</td><td>430829 d’éthanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>à 70 %</td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique (pénicilline, streptomycine, amphotéricine b)</td><td>Gibco, États-Unis</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD11b eFluor 450 anti-souris</td><td>eBioscience,</td><td>États-Unis 48-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD45 PerCP anti-souris&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BioLegend, USA</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée (PBS) sans calcium et sans magnésium</td><td>Corning, USA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr> Blue <tr><td>Cell Strainer 40 &mu ; m</td><td>Corning, États-Unis</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 puits clair non traité&nbsp ;</td><td>Corning, États-Unis</td><td>CLS3736</td><td></td></tr><tr><td>lamelles</td><td></td><td></td><td></td>de protection</tr><tr><td>numérique Chauffage Secouant Drybath&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, États-Unis</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection pour la microchirurgie</td><td>FT de DUMONT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche, États-Unis</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute ; s Aigle modifié&acute ; s Glycémie moyenne-élevée (DMEM)&nbsp ;</td><td>Merck, USA</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir</td><td></td><td></td><td></td>électrique</tr><tr><td>Tube FACS</td><td>Thermo, USA</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>PAN Biotech, Alemania</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Cytoflex&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' solution saline équilibrée</td><td>Merck, États-Unis</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning, États-Unis&nbsp ;</td><td></td><td></td>15393631</tr><tr><td>Liberase TM&nbsp ;</td><td>Roche, États-Unis</td><td>5401119001</td><td></td></tr><tr><td>Chambre Neubauer Chambres de comptage Chine</td><td></td><td>1103</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp ;</td><td>Merck, États-Unis</td><td>17089101</td><td>centrifugation par gradient de densité&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine&nbsp ;</td><td>Scalpel Merck, USA</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>n° 25</td><td>HERGOM, Mexique</td><td>H23</td><td></td></tr><tr><td>Snaplock Microcentrifugeuse Tubes 2 mL</td><td>Axygen, USA</td><td>10011-680</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Velab, Mexique</td><td>HG927831</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux droits (10 cm)</td><td>HERGOM, Mexique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas droits</td><td>HERGOM, Mexique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan Tache 0,4 %&nbsp ;</td><td>Merck, États-Unis</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>DLAB, Chine</td><td>8031102000</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend, États-Unis</td><td>423102</td><td>coloration par colorant fluorescent réactif aux amines&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.

En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface ont ensuite été colorées avec des a...

Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Nos recherches se concentrent sur l’hétérogénéité de la microglie, qui peut présenter à la fois des comportements pro et anti-inflammatoires dans différentes pathologies et régions comme le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est de permettre une compréhension plus approfondie du comportement de la microglie de la moelle épinière dans divers scénarios. L’hétérogénéité des microglies a rendu difficile leur classification.Cette année, une nouvelle et large classification a été proposée qui va au-delà d’un simple statut pro ou anti-inflammatoire. À l’heure actuelle, l’obtention d’une grande pureté et d’un gel dans l’isolement de la microglie de la moelle épinière à partir de modèles animaux de pathologies neurologiques est une expérience et un défi importants. Nous avons identifié une nouvelle voie de signalisation des cytokines dans la microglie de la moelle épinière au cours de la douleur chronique.Notre protocole permet une digestion plus contrôlée et somatique, suivie d’un gradient de densité. Les deux entraînent moins de contamination par les astrocytes par rapport aux techniques actuellement utilisées pour la purification de la microglie de la moelle épinière, du cerveau ou des embryons.

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Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules CD11b, y compris la microglie, du cerveau des petits de souris en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement. Les tissus cérébraux sont homogénéisés pour obtenir des suspensions unicellulaires, qui sont incubées avec des microbilles enrobées d’anticorps anti-CD11b, suivies d’une séparation sur colonne magnétique pour purifier la population de cellules CD11b+.

Isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau d’un bébé souris

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules gliales primaires mixtes à partir de tissus de moelle épinière de souris adultes. Le protocole implique une digestion enzymatique du tissu, suivie de l’élimination des membranes cellulaires brisées et des débris de myéline pour obtenir une population unicellulaire. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu optimisé pour la croissance de cellules gliales mixtes.

Etablissement de cultures primaires de cellules gliales mixtes à partir d’une moelle épinière de souris

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Le développement de la douleur neuropathique implique des changements pathologiques des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale. Un système de culture gliale fiable provenant d' un tissu de la moelle épinière adulte et conçu pour l' étude de ces cellules in vitro est absente. Par conséquent, nous montrons ici comment établir cultures primaires gliales mixtes de souris adultes tissu de la moelle épinière.

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Il est difficile d’identifier les microglies (MG) et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) dans les moelles épinières lésées. Dans ce protocole, la cytométrie en flux (FCM) a été utilisée pour identifier respectivement la MG de type M1, la MG de type M2, la Mø de type M1 et la Mø de type M2. Cette technologie peut également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux central pour comprendre le rôle de la MG et de la Mø.

Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

Apprenez une méthode efficace d'enrichissement de la microglie de la moelle épinière de souris. Ce protocole de digestion somatique et centrifugation sur gradient de densité permet d'atteindre une pureté de 99% avec moins de contamination par les astrocytes.

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

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