Name: Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour quantifier les sidérophores totaux, la pyoverdine et la pyochéline chez Pseudomonas aeruginosa. Ce protocole spectrophotométrique permet d'évaluer les facteurs de virulence bactériens.

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Les auteurs reconnaissent le financement du programme d’enseignement de la biotechnologie (TCD), du programme BUILDER (TCD) et du programme FIST. MR remercie la bourse reçue de SHODH. HP remercie la bourse reçue du CSIR.

Tous les isolats bactériens de P. aeruginosa ont été obtenus dans des laboratoires de microbiologie médicale de Vadodara et de Jaipur, en Inde. Tous les isolats cliniques sélectionnés ont été manipulés dans une enceinte de biosécurité (BSL2) et le plus grand soin a été apporté lors de la manipulation des isolats bactériens pendant les expériences. Les détails commerciaux de tous les réactifs/solutions sont fournis dans le tableau des matériaux.
1. Préparation du colorant et du support de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS)
<ol><li>Préparer le colorant CAS (100 mL) avec la composition suivante :<ol><li>Dissoudre 60 mg de CAS dans 50 mL d’eau distillée (solution 1).</li>
		<li>Dissoudre 2,7 mg de FeCl3·6H2O dans 10 mL de 10 mM HCl (solution 2).</li>
		<li>Dissoudre 73 mg de bromure de cétrimonium (HDTMA) dans 40 mL d’eau distillée (solution 3).</li>
		<li>Mélangez soigneusement la solution 1, la solution 2 et la solution 3. Conservez-le dans une bouteille en verre.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la gélose CAS en suivant les étapes ci-dessous :<ol><li>Ajouter 100 mL de solution saline MM9 à 750 mL d’eau distillée.</li>
		<li>Dissoudre 32,24 g d’acide libre pipérazine-N,N'-bis(acide 2-éthanesulfonique) (PIPES).</li>
		<li>Ajouter 15 g d’agar-agar. Autoclaver et laisser refroidir.</li>
		<li>Ajouter 30 mL de solution stérile d’acides Casamino et 10 mL de solution stérile de glucose à 20 % au mélange.</li>
		<li>Ajoutez 100 ml de colorant CAS, mélangez et versez dans des conditions aseptiques. REMARQUE : La préparation du milieu MM9, de la solution d’acide Casamino et de la 8-hydroxyquinoléine est fournie dans le fichier supplémentaire 1. Le tampon PIPES est sensible au pH. Il ne se dissoudra pas tant que le pH n’aura pas atteint 5,6. Assurez-vous que le pH est constamment surveillé, car lorsque PIPES commence à se dissoudre dans l’eau, il abaisse encore le pH. Extraire l’acide Casamino avec le même volume de 3% de 8-hydroxyquinoléine dissous dans du chloroforme. Laissez la solution non miscible à 4 °C pendant environ 20 min et collectez soigneusement la phase supérieure de la solution sans perturber la phase inférieure.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse qualitative de la production de sidérophores
<ol><li>Réglez le diamètre extérieurde 600 nm sur 0,2 pour les cultures cultivées de P. aeruginosa pendant 24 h.</li>
	<li>À l’aide d’une boucle de fil stérile, étalez la culture bactérienne sur une plaque de gélose CAS.</li>
	<li>Incuber à 30 °C pendant 24 h. REMARQUE : Un milieu aqueux de peptone ou une solution saline normale à 0,8 % peuvent être utilisés pour diluer la culture bactérienne. Si aucune croissance bactérienne n’est observée à 24 h, incuber les plaques CAS pendant 48 à 72 h.</li>
</ol>3. Estimation quantitative des sidérophores totaux
<ol><li>Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu aqueux de Peptone après avoir ajusté la DOde 600 nm à 0,25, et incuber à 30 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Après 48 h, centrifuger la culture bactérienne à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Après centrifugation, ajouter 100 μL de surnageant acellulaire à une plaque de microtitration à 96 puits et y ajouter 100 μL de colorant CAS.</li>
	<li>Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Après incubation, prendre des mesures spectrophotométriques à 630 nm.</li>
	<li>Calculer les résultats obtenus pour la quantification des sidérophores totaux en pourcentage d’unités sidérophores (PSU). REMARQUE : Le bloc d’alimentation peut être calculé comme suit : [(Ar - As)/Ar] x 100 où, Ar = absorbance de la référence à 630 nm, As = absorbance du surnageant acellulaire de l’échantillon. Pour référence, le colorant CAS doit être ajouté à un milieu d’eau à base de peptone non inoculé. Remplissez toute la verrerie, comme les tubes à essai, les flacons, etc., avec 6 M HCl pendant 2 h et rincez-les deux fois à l’eau distillée pour éliminer toute trace de fer dessus.</li>
</ol>4. Estimation quantitative de la pyoverdine
<ol><li>Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu aqueux de Peptone après avoir ajusté la DDOde 600 nm à 0,25 et incuber à 30 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Après 48 h, mesurer le diamètre extérieurde 600 nm de la croissance bactérienne avant de continuer.</li>
	<li>Centrifuger la culture bactérienne à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Après centrifugation, ajouter 100 μL de surnageant acellulaire dans une plaque de microtitration à 96 puits et y ajouter 100 μL de Tris-HCl à 50 mM (pH 8,0).</li>
	<li>Prenez des mesures spectrophotométriques àOD 405 nm.</li>
</ol>5. Extraction de la pyochéline et spectrophotométrie
<ol><li>Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu King B (Fichier supplémentaire 1) après avoir ajusté la D.O.de 600 nm à 0,25 et incuber à 30 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Après 24 h, prélever 100 mL de culture et centrifuger à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Après centrifugation, ajouter 5 mL d’acide citrique 1 M au surnageant. Extraire deux fois avec 50 mL d’acétate d’éthyle.</li>
	<li>Filtrez la phase organique avec du sulfate de magnésium à travers un filtre à seringue. Conserver la phase organique filtrée à -20 °C.</li>
	<li>Prenez des mesures spectrophotométriques à 320 nm. REMARQUE : Comme la pyochéline est un composé très instable à température ambiante, effectuez le processus d’extraction sur de la glace. Utilisez une seringue stérile de 50 ml pour séparer le filtre. Placez le coton à l’extrémité de la seringue et ajoutez 1 g de sulfate de magnésium dessus. Fixez un filtre de seringue stérile à l’extrémité de la seringue et collectez le filtrat dans un tube stérile.</li>
</ol>

Évaluation de la production de sidérophores à partir d’isolats de Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier les sidérophores totaux et deux sidérophores différents de P. aeruginosa, à savoir la pyoverdine et la pyochéline, à partir du surnageant bactérien acellulaire. Dans le test des plaques de gélose CAS, le colorant CAS et les ions Fe3+ forment un complexe. Lorsque les bactéries produisent des sidérophores, elles éteignent les ions Fe3+ du complexe CAS-Fe3+, ce qui entraîne un changement de couleur autour de la croissance bactérienne. Ce changement se traduit par un halo orange clair autour de la croissance bactérienne14,15. Bien que les bactéries puissent être directement striées sur les plaques de gélose CAS, les résultats globaux peuvent être affectés. La striure d’un grand nombre de cellules bactériennes peut créer un large halo orange autour de la croissance bactérienne, tandis que l’utilisation de moins de cellules bactériennes peut entraîner une zone claire étroite. Pour remédier à ce problème, nous avons strié un nombre uniforme de cellules bactériennes en ajustant le diamètre extérieur600. Les bactéries fastidieuses peuvent montrer des résultats en 24 heures, tandis que les bactéries à croissance lente peuvent prendre plus de 72 heures pour démontrer la production de sidérophore.
Pour la détermination quantitative des sidérophores totaux, la spectroscopie classique a d’abord été utilisée, ce qui nécessite un volume important de surnageant pour la détection des sidérophores, ce qui la rend peu pratique. La quantification des sidérophores totaux est maintenant effectuée à l’aide d’une plaque à 96 puits avec un test CAS modifié. Cette approche a permis de réduire l’utilisation de réactifs, de surnageant bactérien, de temps et d’augmenter la précision par rapport aux méthodes spectroscopiques traditionnelles16. D’autres études ont également fait état de l’utilisation de plaques de microtitration comme méthode plus rapide et plus efficace17. La quantification des sidérophores totaux à l’aide d’une plaque de microtitration s’est avérée être une approche efficace. Dans cette étude, des cultures bactériennes vieilles de 48 heures cultivées dans des milieux sans fer ont été sélectionnées pour examen. Une étude comparative a également été menée pour évaluer la production de sidérophores dans différents milieux de culture, tels que le bouillon Luria, le bouillon Luria (extrait avec 3 % de 8-hydroxyquinoléine), le milieu King’s B (extrait avec 3 % de 8-hydroxyquinoléine) et le milieu aqueux Peptone (extrait avec 3 % de 8-hydroxyquinoléine). Il a été observé que le milieu d’eau Peptone présentait la plus grande quantité de production de sidérophores, et il a donc été sélectionné pour d’autres expériences. Un graphique illustrant la production de sidérophores dans différents milieux de culture est inclus dans la figure supplémentaire 1.
La pyoverdine peut être détectée et quantifiée à l’aide de lectures spectrofluorimétriques, mais seule la pyoverdine est connue pour présenter une fluorescence. La pyoverdine en complexe avec des ions Fe3+ ne présente pas de fluorescence18,19. Pour la détection et la quantification de la pyoverdine, des cultures bactériennes vieilles de 48 h ont été sélectionnées pour l’étude. P. aeruginosa est connu pour produire de la pyochéline dans des conditions initiales de carence en fer et passe à la production de pyoverdine après une exposition à des conditions de stress ferique sévère. Il a été démontré que la pyoverdine peut chélater d’autres cations métalliques, tels que l’aluminium, le gallium, le manganèse et le chrome, mais seul le fer est transporté avec succès vers la membrane cellulaire19.
Comme pour les sidérophores totaux et la pyoverdine, la pyochéline ne peut pas être directement quantifiée à partir d’un surnageant acellulaire et doit être extraite à l’aide de dichlorométhane20. Le dichlorométhane est non miscible avec le surnageant acellulaire et forme une couche séparée au fond. Dans cette étude, divers milieux nutritifs ont été testés, y compris le bouillon Luria, l’eau de Peptone et les milieux d’acides Casamino, mais une quantité importante de pyochéline a été obtenue à partir des milieux de King’s B. Alors que Hoegy et al. avaient utilisé des milieux CAA dans leur protocole, nous l’avons modifié avec des milieux B de King, car les milieux CAA ne supportaient pas la croissance bactérienne21. La méthode a été modifiée en extrayant le milieu nutritif avec de la 8-hydroxyquinoléine pour éliminer tout résidu de fer du milieu, créant ainsi un milieu déficient en fer. De plus, il a été constaté que le temps d’incubation affectait de manière significative la production de pyochéline. Dumas et al. ont démontré que P. aeruginosa passe de la production de pyochéline à la production de pyoverdine dans des conditions sévères limitant le fer12. Dans cette étude, l’extraction et la détection de la pyochéline ont été effectuées à partir de cultures bactériennes âgées de 24 heures, car la pyochéline n’a pas été détectée dans les cultures de 48 heures. Le volume du surnageant affecte également la détection de la pyochéline, et par conséquent, 100 mL de surnageant acellulaire ont été utilisés pour l’extraction. De plus, la production de pyochéline était significativement plus élevée dans les isolats MR1, TL7 et J3, peut-être en raison de souches bactériennes incapables de produire de la pyoverdine malgré de puissants chélateurs du fer22.
Ji et al. ont introduit une approche nouvelle et sensible pour la quantification de la pyochéline, en la validant à l’aide de LC/MS/MS. Cependant, cette méthode ne s’appliquait qu’aux isolats de P. aeruginosa provenant des expectorations des patients atteints de mucoviscidose. LC/MS/MS, étant une installation coûteuse, peut ne pas être abordable pour la plupart des laboratoires23. Visaggio et al. ont mis au point un biocapteur bioluminescent à base de cellules entières, qui permet une quantification rapide, sensible et en une seule étape de la pyochéline. Néanmoins, cette méthode ne permet pas de quantifier les sidérophores totaux et la pyoverdine24.
Les systèmes d’absorption du fer sidérophore pourraient avoir une application antimicrobienne dans l’administration de médicaments pour les bactéries multirésistantes, car elles jouent un rôle crucial dans la survie et la virulence des bactéries. Cette approche pourrait offrir une nouvelle façon de lutter contre les bactéries multirésistantes25. Les médicaments qui ne peuvent pas pénétrer la membrane cellulaire bactérienne peuvent être liés à un sidérophore, et le complexe Fe-sidérophore résultant peut être transporté à l’intérieur de la membrane bactérienne26.

Les organismes ont besoin de fer pour remplir diverses fonctions vitales, telles que le transport d’électrons et la réplication de l’ADN1. Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène opportuniste à Gram négatif, est connu pour posséder une variété de facteurs de virulence pour établir l’infection chez l’hôte, dont l’un des mécanismes est la formation de sidérophores2. Dans des conditions d’appauvrissement en fer, P. aeruginosa libère des molécules spécialisées appelées sidérophores, qui éteignent le fer de l’environnement environnant. Les sidérophores chélatent le fer de manière extracellulaire, et le complexe ferric-sidérophore qui en résulte est activement transporté vers la cellule3.
P. aeruginosa est connu pour produire deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline. La pyoverdine est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus élevée (1 :1), tandis que la pyochéline est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus faible (2 :1)4. La pyochéline est également appelée sidérophore secondaire car elle a uneaffinité chélatrice de fer 5 plus faible. La production et la régulation des sidérophores sont activement contrôlées par les systèmes de détection de quorum (QS) chez P. aeruginosa6.
Outre la trempe du fer, les sidérophores sont également impliqués dans la régulation des facteurs de virulence et jouent un rôle actif dans la formation du biofilm7. Les sidérophores jouent d’autres rôles cruciaux, notamment l’implication dans la signalisation cellulaire, la défense contre le stress oxydatif et la facilitation des interactions entre les communautés microbiennes8. Les sidérophores sont généralement classés en fonction des groupes fonctionnels spécifiques à travers lesquels ils chélatent le fer. Les trois principaux ligands bidentates de cette classification sont le catécholate, l’hydroxamate et le α-hydroxycarboxylate3. Les pyoverdines sont des caractéristiques d’espèces fluorescentes de Pseudomonas telles que P. aeruginosa et P. fluorescens5. Ils sont constitués d’un chromophore fluorescent vert mixte couplé à un oligopeptide contenant 6 à 12 acides aminés. Plusieurs peptides synthétases non ribosomales (PNR) sont impliquées dans leur synthèse9. Quatre gènes impliqués dans la production et la régulation de la pyoverdine sont pvdL, pvdI, pvdJ et pvdD10. La pyoverdine est également responsable de l’infection et de la virulence chez les mammifères11. P. aeruginosa est connu pour produire de la pyochéline dans des conditions modérées de limitation du fer, tandis que la pyoverdine est produite dans des environnements sévères limitant le fer12. Deux opérons impliqués dans la production de pyochéline sont pchDCBA et pchEFGHI13. Il est à noter qu’en présence de pyocyanine, la pyochéline (catécholate) induit des dommages oxydatifs et une inflammation et génère des radicaux hydroxyles, qui sont nocifs pour les tissus de l’hôte11.
Le test du sulfonate de chrome-azurol (CAS) est largement adopté en raison de son exhaustivité, de sa grande sensibilité et de sa plus grande commodité par rapport aux tests microbiologiques, qui, bien que sensibles, peuvent être trop spécifiques14. Le test CAS peut être effectué sur des surfaces gélosées ou dans une solution. Il s’appuie sur le changement de couleur qui se produit lorsque l’ion ferrique passe de son complexe bleu intense à l’orange. Le test colorimétrique CAS quantifie l’épuisement du fer d’un complexe ternaire tensioactif Fe-CAS. Ce complexe particulier, composé de métal, de colorant organique et de tensioactif, a une couleur bleue et présente un pic d’absorption à 630 nm.
Ce rapport présente une méthode de détection qualitative de la production de sidérophores, où l’on peut détecter la production de sidérophores sur une plaque de gélose. Une méthode d’estimation quantitative de la production totale de sidérophores dans une plaque de microtitration et la détection et l’analyse quantitative de deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline, de P. aeruginosa, sont également fournies.

<table><tbody><tr><td>Agar Agar, Type I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-Hydroxyquinoléine</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Acide aminochimique</td><td>SRL Chemicals</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>Chrome azurol sulfonate</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose monohydraté</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure ferrique hexahydraté</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td> Flacons en verre Borosil 5100021 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes à essai en verre</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King’s medium B base</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Minimal Medium Salts</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium&nbsp ;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO Spectrophotomètre UV</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Peptone Type I, Bactériologique</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES acide libre</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis Shimadzu</td><td></td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est connu pour sa production d’un large éventail de facteurs de virulence pour établir des infections chez l’hôte. L’un de ces mécanismes est le piégeage du fer par la production de sidérophores. P. aeruginosa produit deux sidérophores différents : la pyochéline, qui a une affinité plus faible pour chélateur du fer, et la pyoverdine, qui a une affinité plus élevée pour la chélation du fer. Ce rapport démontre que la pyoverdine peut être directement quantifiée à partir de surnageants bactériens, tandis que la pyochéline doit être extraite des surnageants avant d’être quantifiée.
La principale méthode d’analyse qualitative de la production de sidérophores est le dosage sur plaque de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS). Dans ce test, la libération du colorant CAS du complexe Fe3+-Dye conduit à un changement de couleur du bleu à l’orange, indiquant une production de sidérophore. Pour la quantification des sidérophores totaux, les surnageants bactériens ont été mélangés en proportions égales avec le colorant CAS dans une plaque de microtitration, suivis d’une analyse spectrophotométrique à 630 nm. La pyoverdine a été directement quantifiée à partir du surnageant bactérien en la mélangeant dans des proportions égales avec 50 mM de Tris-HCl, suivie d’une analyse spectrophotométrique. Un pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine. En ce qui concerne la pyochéline, la quantification directe à partir du surnageant bactérien n’était pas possible, il a donc fallu d’abord l’extraire. L’analyse spectrophotométrique ultérieure a révélé la présence de pyochéline, avec un pic à 313 nm.

Avant la quantification des sidérophores à partir d’isolats cliniques, un criblage qualitatif de la production de sidérophores a été effectué pour assurer la production de sidérophores. La détection qualitative des sidérophores à partir d’isolats cliniques a été observée en striant des bactéries sur des plaques de gélose CAS. Trois isolats cliniques, à savoir MR1, TL7, J3, ainsi que PAO1 (la souche de référence), ont été sélectionnés pour l’étude. Les trois isolats cliniques et PAO1 ont montré des résultats positifs pour la production de sidérophores, où un halo orange clair autour de la croissance bactérienne à la surface de la gélose bleue indiquait une production positive de sidérophores (Figure 1). La formation d’un halo sur la gélose CAS (Figure 1) a donné une estimation approximative de la production de sidérophores par les isolats cliniques. Par conséquent, une estimation quantitative de la production de sidérophores à l’aide d’un réactif CAS et d’un milieu liquide a été réalisée.
La quantification du sidérophore total a été réalisée directement à partir du surnageant acellulaire. Après l’incubation, un changement de couleur a été observé où la couleur jaune indiquait l’élimination du colorant CAS du complexe Fe. Ici, le colorant CAS avec un milieu de croissance non inoculé a été utilisé comme témoin, qui a été pris pour le calcul des sidérophores. Il n’y avait pas de différence significative dans la production totale de sidérophores dans les isolats MR1 et TL7, alors qu’il y avait une production totale significative de sidérophores dans J3 par rapport à PAO1 (Figure 2).
Ensuite, la quantification de la pyoverdine a été effectuée directement à partir de surnageants acellulaires. Les pyoverdines sont libérées dans les environnements cellulaires, de sorte que le surnageant acellulaire a été utilisé pour la quantification de la pyoverdine. Un balayage de la gamme UV par le spectrophotomètre a également été effectué, où le pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine (Figure 3A). Les lectures spectrophotométriques ont été prises à 405 nm, et les résultats ont été interprétés comme OD405/OD600 nm. Tous les isolats ont montré une production de pyoverdine, où les isolats MR1 et J3 ont montré une production significativement plus faible de pyoverdine par rapport à PAO1, tandis qu’aucune différence significative n’a été observée pour TL7 (Figure 3B).
La pyochéline ne peut pas être directement quantifiée à partir du surnageant acellulaire. Il n’a pas été possible d’extraire la pyochéline de 1 mL de surnageant acellulaire, elle a donc été extraite de 100 mL de surnageant acellulaire. Il a été acidifié avec 1 M d’acide citrique. La pyochéline étant un composé très instable, le processus d’extraction a été effectué sur de la glace. La détection de la pyochéline a été réalisée en effectuant un balayage de la gamme UV d’une plage de 300 à 600 nm, où le pic àOD 320 nm a confirmé la présence de pyochéline (Figure 4A). La quantification de la pyochéline a été réalisée en prenant des mesures spectrophotométriques àOD 320 nm. Les calculs ont été effectués en divisant OD320/OD600. Les isolats MR1, TL7 et J3 ont montré une production significativement plus élevée de pyochéline par rapport à l’isolat de référence PAO1 (Figure 4B).
Une comparaison de la production de sidérophores dans divers milieux de croissance bactériens a été effectuée pour vérifier la quantité totale de sidérophores produits dans divers milieux de culture. Quatre milieux différents ont été sélectionnés, où le bouillon Luria, le milieu King’s B et l’eau de Peptone ont été extraits avec 3% de 8-hydroxyquinoléine, et le bouillon Luria non extrait a été sélectionné pour l’étude. Il n’y avait pas de différence significative entre la production de sidérophores dans le bouillon de Luria extrait, le milieu de King’s B et le milieu d’eau de Peptone, tandis qu’une différence significative a été observée pour la production de sidérophores dans le bouillon de Luria non extrait.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Figure 1 : Production de sidérophores sur gélose CAS. La croissance de P. aeruginosa sur des plaques de gélose CAS de cultures cultivées 24 h a été repérée sur des plaques de gélose CAS et incubée à 30 °C pendant 24 h. La présence de sidérophores est indiquée par un halo orange autour de la colonie bactérienne (PAO1, MR1, TL7 et J3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Figure 2 : Production totale de sidérophores. La production totale de sidérophores a été évaluée pour PAO1 et trois isolats cliniques (MR1, TL7 et J3). 100 μL de surnageant acellulaire (de PAO1, MR1, TL7 et J3 cultivés pendant 24 h dans un bouillon d’eau peptone) ont été ajoutés à une plaque de microtitration à 96 puits, puis 100 μL de colorant CAS y ont été ajoutés. Un test ANOVA à un facteur a été effectué pour la signification statistique. Les barres d’erreur représentent ±écart-type (ET) entre trois répétitions biologiques. *correspond à p &lt; 0,05 ; ns correspond à p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Figure 3 : Production de pyoverdine. Production de pyoverdine de la souche PAO1 de P. aeruginosa et d’isolats cliniques (MR1, TL7 et J3) évaluée après 24 h de croissance dans un milieu aqueux peptonique. Les cultures bactériennes ont été centrifugées et 100 μL de surnageant acellulaire ont été ajoutés à une plaque de microtitration à 96 puits. Par la suite, 100 μL de Tris-HCl à 50 mM (pH 8,0) y ont été ajoutés. La détection de la pyoverdine a été effectuée par spectrophotométrie UV avec une plage de 350 nm à 600 nm. Analyse spectrométrique à 380 nm de production de pyoverdine (A). Quantification de la production de pyoverdine (B). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type par rapport à la moyenne des expériences en trois exemplaires. Les barres d’erreur représentent ±écart-type entre trois répétitions biologiques. correspond à p &lt; 0,0001, **correspond à p &lt; 0,01 et ns correspond à p &gt; 0,05 sur la base du test ANOVA à un facteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Figure 4 : Production de pyochéline. Production de pyochéline de PAO1 (utilisé comme référence) et d’isolats cliniques (MR1, TL7 et J3) par extraction avec de l’acétate d’éthyle et du sulfate de magnésium. Analyse spectrophotométrique avec une plage de 230 nm à 400 nm (A). Quantification de la pyochéline (B). Trois expériences indépendantes ont été réalisées pour chaque isolat. Les barres d’erreur représentent ±écart-type entre trois répétitions biologiques. correspond à p &lt; 0,001 sur la base d’un test ANOVA à un facteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Production comparative de sidérophores dans divers milieux de croissance bactérienne. Production totale de sidérophores dans quatre milieux de croissance différents où le milieu King’s B, le milieu aqueux Peptone et le bouillon Luria ont été extraits avec 3% de 8-hydroxyquinoléine pour en éliminer toute trace de fer, et le bouillon Luria (non extrait) a été sélectionné. L’extraction par 3 % de 8-hydroxyquinoléine a été réalisée en ajoutant un volume égal de 3 % de 8-hydroxyquinoléine dans le milieu. Les barres d’erreur représentent ±écart-type entre trois répétitions biologiques. **correspond à p &lt; 0,001 et ns correspond à p &gt; 0,5 sur la base du test ANOVA à un facteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Recettes de médias utilisées pour la présente étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir le fichier.</a>

Ce protocole fournit des analyses qualitatives et quantitatives des sidérophores totaux, de la pyoverdine et de la pyochéline de Pseudomonas aeruginosa.

Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Les sidérophores forment des complexes avec le fer et le transportent dans la cellule dans des conditions limitant le fer. Les sidérophores sont de puissants facteurs de virulence qui aident à établir une infection grave chez l’hôte et sont connus pour jouer un rôle dans la régulation de la détection du quorum chez Pseudomonas aeruginosa. Notre recherche vise à estimer quantitativement la production de sidérophores chez Pseudomonas.Les sidérophores sont des molécules extracellulaires, de sorte que les sidérophores totaux, ainsi que la pyoverdine et la pyochéline sont quantifiés à l’aide d’un surnageant acellulaire. Comme la pyochéline n’est pas détectée en petit volume, l’extraction est effectuée à partir d’un grand volume de surnageant acellulaire. Récemment, des LCMS et des biocapteurs ont été développés pour la quantification de la pyochéline.Le LCMS est une installation coûteuse pour les petits laboratoires, alors que les biocapteurs ne sont capables que de quantifier la pyochéline. Ce protocole simple et illustré utilise un minimum de réactifs et d’instruments de laboratoire, et permet l’estimation du sidérophore à partir d’un surnageant acellulaire en moins de temps.

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