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Article de méthode
Ce protocole décrit la création d’un schéma de transfection aléatoire à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé, d’un protocole d’isolement du protoplaste pour les feuilles de maïs étiolées et d’une procédure de transfection à 96 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide.
Le domaine de la biotechnologie végétale a connu des progrès remarquables ces dernières années, révolutionnant la capacité de manipuler et d’organiser des plantes à diverses fins. Cependant, à mesure que la recherche dans ce domaine gagne en diversité et devient de plus en plus sophistiquée, le besoin de solutions de dépistage transitoire précoces, efficaces, fiables et à haut débit pour affiner les stratégies menant à une transformation stable est plus évident. Une méthode qui a réapparu ces dernières années est l’utilisation du protoplaste végétal, pour lequel des méthodes d’isolement et de transfection sont disponibles dans de nombreuses espèces, tissus et stades de développement. Ce travail décrit un protocole automatisé simple pour la préparation aléatoire d’un plasmide dans une plaque de 96 puits, une méthode pour l’isolement du protoplaste de feuille de maïs étiolée et une procédure de transfection automatisée. L’adoption de solutions automatisées en biotechnologie végétale, illustrée par ces nouveaux protocoles de manipulation des liquides pour la transfection des protoplastes végétaux, représente une avancée significative par rapport aux méthodes manuelles. En tirant parti de l’automatisation, les chercheurs peuvent facilement surmonter les limites des méthodes traditionnelles, améliorer l’efficacité et accélérer les progrès scientifiques.
La transfection de protoplastes végétaux, l’introduction de matériel génétique étranger dans des cellules végétales dépourvues de parois cellulaires, est une technique essentielle et, au cours du dernier demi-siècle, elle a englobé de nombreuses espèces à l’appui de la recherche en biotechnologie végétale. Cependant, l’utilisation de ces méthodes peut être douloureuse et de portée limitée, même avec des millions de protoplastes produits par isolement. Les méthodes traditionnelles de transfection de protoplastes végétaux sont souvent laborieuses, longues, sujettes à la variabilité et techniquement exigeantes, ce qui conduit à des systè....
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1. Création de plaques de transfection
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Pour obtenir des données d’observation soutenant que les effets de bord peuvent affecter les mesures de réponse ; Une étude pilote a été menée pour confirmer ces soupçons. Pour cette étude, les méthodes ci-dessus ont été appliquées à trois plaques répétées de 96 puits avec un seul niveau de traitement ; tous les protoplastes ont été transfectés à l’aide de pSYN1125019, un plasmide qui exprime constitutivement ZsGreen, dans le but de montrer qu’il existe des différences systématiques de niveau de r.......
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Ce manuscrit décrit un protocole permettant d’automatiser la création de plaques de transfection et l’isolement des protoplastes de feuilles de maïs étiolées avec une transfection automatisée. Pour mener à bien la partie du protocole consacrée à la création de plaques de transfection, il faut un robot automatisé de manipulation de liquides équipé d’une nacelle à 8 canaux. Pour le protocole de transfection, une nacelle de 96 puits est recommandée pour une transfection complète et uniforme.......
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Tous les auteurs sont employés par Syngenta, une société internationale de biotechnologie agricole, qui utilise régulièrement des technologies de transformation pour la génération de produits à caractères transgéniques (GM).
Les auteurs tiennent à remercier les nombreux scientifiques de Syngenta qui soutiennent ce travail et notre équipe au quotidien. Une reconnaissance particulière doit être accordée à la famille et aux amis dont le soutien, souvent invisible, est essentiel au succès continu de l’équipe d’analyse transitoire.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| (2)&bêta ;-mercaptoéthanol ; | Sigma | M6250 | |
| Acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique (MES) monohydraté | Sigma | 69892 | |
| Tubes à centrifuger 50mL avec capuchon plat | stérile Fisher | 22-010-064 | |
| 96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Noir avec couvercle Culture cellulaire Stérile PS .4mL Well | Fisher | 12-566-70 | |
| Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non stérile, Wide Bore | Fisher | 14-222-096 | |
| Axygen Robotic Tips Filtre 30uL, stérile, en rack | Fisher | 14-222-103 | |
| Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Dessiccateurs sous vide de style rond | Fisher | 08-648-10 | |
| Bemis 2 PO. x 250 pieds Rouleau de laboratoire Parafilm ; | Fisher | 13-374-16 | |
| Biomek FXP | Beckman Coulter | 902508 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Sigma | C5080 | |
| Chemglass Life Sciences Hémocytomètre jetable ; | Fisher | 50-131-1352 | |
| Clorox Agent de Javel germicide, concentré | Fisher | NC1871274 | |
| Corning Ruban d’étanchéité en aluminium pour microplaques ; | Fisher | 07-200-684 | |
| Blocs d’analyse Corning à 96 puits, 2 ml, étalon à 96 puits | Fisher | 07-200-701 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| D-Mannitol ; | Sigma | M9546 | |
| Fisherbrand Seringue en plastique 60 ml | Fisher | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Passoire à cellules stériles 40um | Fisher | 22-363-547 | |
| Fisherbrand Boîtes de Pétri avec couvercle transparent, empilables, 100 mm x 25 mm, Caisse de 325 | Fisher | FB0875711 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma | M2670 | |
| Millex Unité de filtration à seringue Stérile 33mm PES .22um | Fisher | SLGPR33RS | |
| Millex Unité de filtration à seringue Stérile 33mm PVDF.45um | Fisher | SLHAR33SS | |
| MillliporeSigma Steriflip Unités de filtration stériles à usage unique 50mL PES | Fisher | SCGP00525 | |
| Poly(éthylène glycol) 4000 ; | Sigma | 81240 | |
| Redi-Earth Plug & Mélange de semis ; | Wyatt Quarles | GP92747 | |
| Regular Duty Single Edge Razor Lames dos acier .009RD | Fisher | 12-640 | |
| Research Products International Corp Cellulase RS | Fisher | 50-213-232 | |
| Research Products International Corp Macerozyme R-10 | Fisher | 50-213-444 | |
| Chlorure de sodium | Sigma | S7653 | |
| Insert de plateau - 36 cellules - 6x6 imbriqué ; | Hummert | 11635000 | |
| Tween-20 ; | Sigma | P1379 | |
| VACUUBRAND ME1 Pompe à vide, 100-120V, 50/60 Hz, prise US | VWR | 97058-164 |
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