Name: Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Apprenez à construire une chambre de flux pour la microscopie à temps réel en utilisant du parafilm et une lamelle couvre-objet. Cette méthode permet d'étudier le démontage de l'actine avec précision.

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<ol><li> Construire une chambre d&#39;écoulement comme le montre la vidéo. Assurez-vous que le sceau du parafilm est serré et l&#39;utilisation des lamelles lavées. </li><li> Incuber actine agent liant dans la chambre pour &#39;5-10. </li><li> Bloc non spécifiques des sites de liaison sur la lamelle de verre avec une protéine bloquant. </li><li> Actine polymérise intérieur de la chambre par l&#39;écoulement de G-actine à polymériser tampon. </li><li> Délavage polymérisés actine en s&#39;écoulant dans l&#39;excès de tampon. </li></ol>

surveillance actine démontage time-lapse microscopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie

Très bien, ce que je souhaite faire aujourd'hui est de vous montrer comment construire une chambre d'écoulement, une chambre de fusion pour l'imagerie sur un microscope droit. Ensuite, je crée deux espaces à l'aide d'un film. Pour cela, je prends du film parafiné, que je découpe en petites bandes.Ensuite, je vais procéder à la formation des canaux pour les parois, puis je les sèche avec un flux d'air incliné. Je place la lame couvre-objet sur le dessus du para, et voici le produit fini. Puis, je chauffe l'ensemble sur un bloc chauffant afin de faire fondre le para et créer essentiellement une étanchéité.Ce que nous avons ici, c'est le verre de couverture, puis au-dessus du verre de couverture se trouvent deux couches de PhIM, comme vous pouvez le voir ici. Et par-dessus cela, il y a à nouveau un lamelle de 22 par 22 millimètres. Celui-ci, que j'ai appuyé contre le param pour former le scellement.Très bien, le liquide pénètre dans un sens ici, et je peux l'aspirer à l'aide d'un papier filtre dans ce sens. Je vais vous montrer comment procéder un peu plus tard. Ce que j'aime faire, c'est le placer dans une enceinte humidifiée, ce qui est très simple.Prenez deux types de bandes surélevées et placez un filtre en papier en dessous. Pour maintenir une certaine turbulence pendant que je travaille, je mets le couvercle, la lamelle, sur la chambre d'écoulement. Pour introduire une solution dans la chambre, il suffit de placer la pointe de pipette à l'entrée de la chambre et de déposer délicatement le liquide.Maintenant, ce que je fais, c'est que j'incube la chambre avec le couvercle fermé pendant 10 minutes. Ce que je fais habituellement pour aspirer le liquide de l'autre côté consiste à utiliser du papier filtre que je découpe en fines bandes comme celle-ci. Je prends alors une de ces bandes fines et j'applique simultanément la solution à l'entrée tout en plaçant le papier filtre à la sortie pour aspirer le milieu, la solution.Vous verrez donc le liquide circuler dans la solution. Ensuite, j'attends cinq minutes pour la fermeture intermédiaire. Maintenant que je suis prêt, je dois effectivement introduire l'actine, que je dois polymériser ; je réalise cette polymérisation à l'intérieur de la chambre d'écoulement, selon exactement les mêmes procédures qu'auparavant.Donc, comme ceci, et maintenant que l’action est polymérisée, je lave tout l’excès d’action non polymérisée à l’aide d’un grand volume de tampon. Ici, j’ai environ cent microlitres, ce qui correspond à plusieurs volumes de la chambre de réaction de tampon. Simplement, vous savez, lorsque le papier filtre est saturé, je dois changer de direction. D’accord ?Et donc je suis prêt à effectuer l'imagerie avec ceci. Ainsi, la chambre de perfusion avec l'actine qui y est attachée. Maintenant, je prends la lame, je la monte sous le microscope, et comme j'effectue l'imagerie avec un objectif à immersion huileuse, je vais déposer un peu d'huile d'immersion sur la surface supérieure du coverslip, en veillant à ce que celle-ci entre en contact avec la solution, la protéine ou tout autre élément présent sur l'actine à l'intérieur.Ce que je fais, c'est que je peux effectivement changer la solution pendant que j'effectue l'imagerie en laps de temps. Ainsi.

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