Name: Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Apprenez à construire une chambre de flux pour la microscopie à temps réel en utilisant du parafilm et une lamelle couvre-objet. Cette méthode permet d'étudier le démontage de l'actine avec précision.

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<ol><li> Construire une chambre d&#39;écoulement comme le montre la vidéo. Assurez-vous que le sceau du parafilm est serré et l&#39;utilisation des lamelles lavées. </li><li> Incuber actine agent liant dans la chambre pour &#39;5-10. </li><li> Bloc non spécifiques des sites de liaison sur la lamelle de verre avec une protéine bloquant. </li><li> Actine polymérise intérieur de la chambre par l&#39;écoulement de G-actine à polymériser tampon. </li><li> Délavage polymérisés actine en s&#39;écoulant dans l&#39;excès de tampon. </li></ol>

surveillance actine démontage time-lapse microscopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie

Très bien, ce que je souhaite faire aujourd'hui est de vous montrer comment construire une chambre d'écoulement, une chambre de fusion pour l'imagerie sur un microscope droit. Ensuite, je crée deux espaces à l'aide d'un film. Pour cela, je prends du film parafiné, que je découpe en petites bandes.Ensuite, je vais procéder à la formation des canaux pour les parois, puis je les sèche avec un flux d'air incliné. Je place la lame couvre-objet sur le dessus du para, et voici le produit fini. Puis, je chauffe l'ensemble sur un bloc chauffant afin de faire fondre le para et créer essentiellement une étanchéité.Ce que nous avons ici, c'est le verre de couverture, puis au-dessus du verre de couverture se trouvent deux couches de PhIM, comme vous pouvez le voir ici. Et par-dessus cela, il y a à nouveau un lamelle de 22 par 22 millimètres. Celui-ci, que j'ai appuyé contre le param pour former le scellement.Très bien, le liquide pénètre dans un sens ici, et je peux l'aspirer à l'aide d'un papier filtre dans ce sens. Je vais vous montrer comment procéder un peu plus tard. Ce que j'aime faire, c'est le placer dans une enceinte humidifiée, ce qui est très simple.Prenez deux types de bandes suréle

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Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d'actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

Les microtubules sont des polymères intrinsèquement instables, et leur commutation entre la croissance et de raccourcissement est stochastique et difficile à contrôler. Nous décrivons ici les protocoles à l'aide de microtubules segmentés avec des bouchons de stabilisation photoablatable. Dépolymérisation des microtubules segmentées peut être déclenchée avec une résolution temporelle et spatiale, aidant ainsi l'analyse de mouvements avec les extrémités des microtubules démontage.

Préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions Poussé par le démontage microtubules Ends

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.

Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Cet article présente des protocoles pour l’ingénierie et la caractérisation de réseaux composites tridimensionnels accordables de filaments d’actine et de microtubules co-intriqués. Les composites subissent une restructuration active et un mouvement balistique, entraînés par des moteurs de myosine II et de kinésine, et sont réglés par les concentrations relatives d’actine, de microtubules, de protéines motrices et de réticulations passives.

Reconstitution et caractérisation de composites actine-microtubule avec dynamique et mécanique induites par moteur accordable

Dans ce travail, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour étudier la poroélasticité des gels d’actomyosine dans des conditions contrôlées. La dynamique du gel d’actomyosine et du solvant incorporé est quantifiée, grâce à laquelle la poroélasticité du réseau est démontrée. Nous discutons également des défis expérimentaux, des pièges courants et de la pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.

La mécanique des réseaux d’actomyosine contractile (poro-)élastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire

Ici, nous présentons des méthodes pour préparer des assemblages d’actine quasi-bidimensionnels (2D) intriqués, réticulés et à cristaux liquides à partir de protéines purifiées.

Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

Ce protocole décrit un essai de motilité de perles à queue cométaire d'actine ajustable permettant d'étudier quantitativement la manière dont l'activité du moteur myosine influence l'assemblage de l'actine ramifiée et l'architecture du réseau à une interface de type membranaire.

Reconstitution de l'assemblage de l'actine branchée médié par la myosine-I dans un essai de motilité de queues de comètes d'actine basé sur des billes

Apprenez à construire une chambre de flux pour la microscopie à temps réel en utilisant du parafilm et une lamelle couvre-objet. Cette méthode permet d'étudier le démontage de l'actine avec précision.

Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie

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