Name: Automatisation du criblage par cryo-microscopie électronique sur plusieurs grilles à l’aide de Smart Leginon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Découvrez l'automatisation du criblage cryo-microscopie électronique multi-grilles avec Smart Leginon. Cette méthode réduit considérablement le temps d'analyse et optimise les flux de travail en microscopie électronique.

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Une partie de ce travail a été réalisée au Simons Electron Microscopy Center du New York Structural Biology Center, avec le soutien de la Simons Foundation (SF349247), du NIH (U24 GM129539) et de l’Assemblée de l’État de New York.

Accélération de l’analyse structurelle macromoléculaire à l’aide de Smart Leginon Autoscreen

<ol><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+optimization+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid optimization for membrane proteins.</a> iScience. 24 (3), 102139(2021).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+collection+of+high-resolution+cryo-EM+datasets+using+200+KV+transmission+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 181, 63519(2022).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+multi-grid+cryoEM+screening+using+Smart+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon.</a> IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).</li>
<li>Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+automate+cryo-electron+microscopy+data+collection+with+Ptolemy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy.</a> IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+data+collection+for+CryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Smart data collection for CryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).</li>
<li>Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+systematic+evaluation+of+cryo-EM+specimens+with+SmartScope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope.</a> eLife. 11, e80047(2022).</li>
<li>Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+Getting+Intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA Getting Intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).</li>
<li>Fan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoRL%3A+Reinforcement+learning+enables+efficient+cryo-EM+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection.</a> arXiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+path+planning+surpasses+human+efficiency+in+cryo-EM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging.</a> bioRxiv. Biophysics. , (2022).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li>
<li>Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+seeing+molecules+in+cells%2C+CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%22%5BJournal%5D)">The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop.</a> CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopic+grid+preparation+for+time-resolved+studies+using+a+novel+robotic+system%2C+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.</a> Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).</li>
<li>Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+a+paradigm+shift+in+CryoEM+sample+preparation+with+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans ce protocole, nous décrivons le pipeline de Smart Leginon Autoscreen, ainsi que l’utilisation de base de Leginon pour ceux qui découvrent le logiciel de collecte. La cryoEM à particule unique est en passe de devenir la technique de résolution de la structure protéique tridimensionnelle (3D) la plus productive d’ici la fin de 202417. Le pipeline cryoEM à particules uniques se compose de plusieurs étapes qui sont constamment optimisées pour augmenter la qualité et le débit des données. La figure 2 montre les étapes les plus courantes (préparation des échantillons, préparation de la grille, temps et efforts de criblage, temps de collecte haute résolution, traitement en direct et post-traitement complet) ainsi que d’autres composants du pipeline qui peuvent être améliorés (accès au microscope de criblage, vitesse et précision de la platine, vitesse de la caméra et accès au microscope haute résolution). Les résultats de la plupart des étapes deviennent des boucles de rétroaction dans les étapes précédentes (flèches bleues dans la figure 2), ce qui rend l’ensemble du pipeline hautement interdépendant. Chaque étape de la figure 2 est colorée pour se rapprocher du goulot d’étranglement par rapport aux autres. Smart Leginon Autoscreen réduit considérablement le temps et les efforts de l’opérateur pour le criblage de 12 grilles de 6 h à moins de 10 min, soulageant ainsi ce goulot d’étranglement et permettant un retour plus rapide sur la préparation des échantillons/grilles (Figure 3).
Le protocole comporte plusieurs étapes critiques, illustrées à la figure 1. Il est essentiel que la grille utilisée pour créer la session de modèle soit représentative des grilles restantes à filtrer. Il est important de noter que Leginon se souvient de tous les paramètres de l’ensemble du processus de configuration pour créer une session de modèle (étapes bleues dans la figure 1), ce qui permet de configurer des sessions de modèle récurrentes plus rapidement à chaque fois. Lors de la création d’une session de modèle, l’étape la plus critique consiste à configurer le ciblage à tous les grossissements afin que les paramètres et les seuils reflètent la variation attendue sur les grilles à cribler. Les différents boutons « Test » permettent d’être efficace dans ce processus de configuration. Lors d’une session Autoscreen, il est essentiel de surveiller les premières grilles d’Appion pour détecter rapidement tout problème et le résoudre dans Leginon dès que possible.
Le flux de travail typique du SEMC consiste à alimenter les données Autoscreen dans CryoSPARC Live18 et à utiliser ces informations supplémentaires pour informer les boucles de rétroaction dans la préparation des échantillons/grilles. Pendant les journées intensives d’optimisation cryoEM des chercheurs-opérateurs, les informations sur les conditions de l’échantillon et de la grille sont réinjectées dans la préparation de l’échantillon et de la grille pendant qu’Autoscreen continue de cribler les grilles. Cela permet de geler et de cribler plusieurs dizaines de grilles par semaine8.
Smart Leginon Autoscreen fonctionne pour la majorité (80 % à 90 %) des grilles et des conditions trouées observées au SEMC. Les 10 à 20 % restants des grilles comprennent celles qui ne fonctionnent parfois pas bien - des grilles avec une différence de contraste minimale entre les trous et le substrat ; grilles avec des trous et un espacement plus petits (par exemple, 0,6/0,8) - et des grilles où le ciblage sur plusieurs grilles est souvent peu pratique - Spotiton/Chameleon19,20 grilles qui consistent en des bandes d’échantillon à travers la grille ; Grilles en dentelle. Notez que la collection de grilles inclinées avec Autoscreen est en cours de développement mais n’est pas encore disponible. Il peut être possible de modifier le protocole pour qu’il fonctionne avec des grilles Spotiton/Chameleon en imageant d’abord manuellement les zones de la bande pour déterminer des seuils de paramètres étroits, puis en essayant de regrouper des carrés plus grands et plus petits, respectivement, à l’étape 2.1.7.4, puis en sélectionnant des cibles dans le groupe avec de la glace. L’objectif de cette modification est de faire en sorte que Smart Leginon sépare les cases vides et non vides en deux groupes. Si des paramètres sont trouvés, ils peuvent ne pas bien s’étendre aux grilles restantes à cribler. Il peut également être possible de modifier le protocole pour qu’il fonctionne avec des grilles en dentelle en supprimant le script hl_finding.sh à l’étape 2.1.9.1 et en configurant les paramètres pour cibler les zones plus claires/plus sombres comme vous le souhaitez. Le taux de réussite de cette modification peut varier d’une grille à l’autre en fonction de l’épaisseur de la glace et du matériau de la grille.
Le dépannage pendant une session Autoscreen est possible et parfois approprié. Des modifications des paramètres prédéfinis (par exemple, défocalisation) et de ciblage (par exemple, les seuils de ciblage des trous) peuvent être apportées lors de la collecte automatisée. Pendant la collecte d’une session Autoscreen, une session de grille ne peut pas être annulée car elle se terminera autoscreen.py. Cependant, les boutons Abandonner dans les nœuds de ciblage peuvent être utilisés pour ignorer n’importe quelle partie d’une grille ou une grille entière. Parfois, autoscreen.py peut utiliser trop de mémoire et se figer, offrant deux options : « forcer à quitter » ou « attendre ». Si l’option « forcer l’arrêt » est sélectionnée, l’ensemble du script se termine, ce qui oblige l’utilisateur à réexécuter le script à appliquer aux grilles restantes pour le filtrage. Si 'attendre' est sélectionné, le script continuera et les paramètres peuvent être modifiés pour éviter un gel futur, par exemple, en désactivant l’affichage de l’image dans le nœud Exposition, en diminuant la taille des pixels dans l’atlas ou en exécutant un script d’effacement de la mémoire. Si le programme se bloque sans offrir les deux options, les erreurs de mémoire peuvent ne pas se résoudre d’elles-mêmes, ce qui entraîne une interruption de l’acquisition. L’option « forcer à quitter » peut être utile dans ce cas.
Smart Leginon Autoscreen est utilisé régulièrement chez SEMC. Alors que les goulots d’étranglement dans le pipeline cryoEM à particule unique continuent d’être réduits, l’adoption de cryoEM continuera d’augmenter pour aider à répondre aux questions biologiques. Ce protocole est un pas dans la direction de l’optimisation de l’ensemble du pipeline en fournissant une voie claire pour réduire considérablement les boucles de rétroaction.

La cryo-microscopie électronique à particule unique (cryoEM) permet de déterminer la structure à résolution quasi atomique des complexes macromoléculaires purifiés. Une expérience de cryoEM à particules uniques ne nécessite qu’une ou deux grilles bien choisies sélectionnées dans un ensemble beaucoup plus large de grilles avec des conditions d’échantillon et de grille variables. Le criblage au microscope pour examiner ces grilles implique l’imagerie de chaque grille à plusieurs grossissements pour déterminer quelle grille répond à la plupart des exigences clés pour la collecte de données à haute résolution, y compris l’épaisseur de la glace, des zones suffisantes pour la collecte complète des données, la pureté des protéines, la concentration des protéines, la stabilité des protéines et les problèmes d’orientation préférés minimaux1. L’optimisation pour ces exigences clés implique souvent un retour d’information entre le criblage au microscope et les conditions de préparation telles que la production de protéines, la sélection du tampon, les détergents potentiels et le typede grille 2,3,4 (Figure 1). Le criblage de grille conventionnel est effectué manuellement ou semi-manuellement avec des logiciels tels que Leginon5, SerialEM6 et EPU7. Le criblage conventionnel oblige l’opérateur du microscope à passer des heures au microscope pour cribler plusieurs grilles, ce qui crée un goulot d’étranglement important dans le flux de travail haute résolution à particules uniques en occupant l’opérateur avec des opérations par cœur plutôt qu’avec l’optimisation de l’échantillon/de la grille.
Auparavant, Smart Leginon Autoscreen et le logiciel d’apprentissage automatique sous-jacent, Ptolemy, ont été introduits, et leurs méthodes et algorithmes sous-jacents ainsi que des exemples ont été décrits 8,9. Plusieurs autres progiciels sont capables de réaliser un criblage multi-grilles entièrement automatisé10, notamment SmartScope11, Smart EPU12 et CryoRL13,14. Pour résoudre le goulot d’étranglement du criblage, Smart Leginon permet à l’utilisateur de configurer d’abord les paramètres de criblage dans une session de microscope modèle, puis d’utiliser les paramètres de cette session de modèle comme modèle pour filtrer la cassette complète de grilles dans le chargeur automatique de microscope. Tout travail manuel pendant le criblage de la cassette est éliminé, ce qui permet à la boucle de rétroaction d’optimisation de se dérouler beaucoup plus efficacement.
Dans ce protocole, le flux de travail complet de Smart Leginon Autoscreen est décrit afin que le lecteur puisse effectuer un criblage cryoEM multi-grilles entièrement automatisé de manière indépendante. Pour ceux qui découvrent Leginon, la première section du protocole décrit l’utilisation conventionnelle de Leginon. Ces connaissances sont composées de plusieurs années d’expérience sur plusieurs microscopes à chargement automatique, qui sont ensuite développées dans la section Smart Leginon suivante du protocole. D’autres vidéos tutorielles peuvent être trouvées sur https://memc.nysbc.org.

<table><tbody><tr><td>Glacios cryoTEM&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>GLACIOSTEM</td><td>FEG, 200 keV, caméra Falcon 3EC&nbsp ;</td></tr><tr><td>Krios cryoTEM&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>KRIOSG4TEM</td><td>XFEG, 300 keV, &nbsp ; Filtre d’énergie Gatan BioQuantum, caméra Gatan K3</td></tr><tr><td>Leginon&nbsp ;</td><td>Centre de Microscopie Electronique Simons&nbsp ;</td><td></td><td>http ://leginon.org&nbsp ; (en anglais seulement)</td></tr><tr><td>Ptolémée&nbsp ;</td><td>Centre d’apprentissage automatique Simons&nbsp ;</td><td></td><td>https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

automatisation du criblage par cryo-microscopie électronique sur plusieurs grilles à l’aide de smart leginon

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Les progrès des techniques de cryo-microscopie électronique (cryoEM) au cours de la dernière décennie ont permis aux biologistes structuraux de résoudre régulièrement des complexes de protéines macromoléculaires à une résolution proche de l’atome. Le flux de travail général de l’ensemble du pipeline cryoEM implique l’itération entre la préparation des échantillons, la préparation de la grille cryoEM et le criblage des échantillons/grilles avant de passer à la collecte de données haute résolution. L’itération entre la préparation de l’échantillon/de la grille et le criblage est généralement un goulot d’étranglement majeur pour les chercheurs, car chaque expérience itérative doit optimiser la concentration de l’échantillon, les conditions tampons, le matériau de la grille, la taille du trou de la grille, l’épaisseur de la glace et le comportement des particules de protéines dans la glace, entre autres variables. De plus, une fois ces variables déterminées de manière satisfaisante, les grilles préparées dans des conditions identiques varient considérablement quant à leur capacité à être collectées ou non, de sorte qu’il est recommandé de procéder à des séances de sélection supplémentaires avant de sélectionner les grilles optimales pour la collecte de données à haute résolution. Ce processus de préparation et de criblage des échantillons/grilles consomme souvent plusieurs dizaines de grilles et plusieurs jours de temps d’opérateur au microscope. De plus, le processus de dépistage est limité à la disponibilité de l’opérateur/microscope et à l’accessibilité du microscope. Nous montrons ici comment utiliser Leginon et Smart Leginon Autoscreen pour automatiser la majorité du criblage de la grille cryoEM. Autoscreen combine l’apprentissage automatique, les algorithmes de vision par ordinateur et les algorithmes de manipulation du microscope pour éliminer le besoin d’une intervention manuelle constante de l’opérateur. Autoscreen peut charger et imager de manière autonome des grilles avec une imagerie multi-échelle à l’aide d’un système automatisé de cassettes d’échange d’échantillons, ce qui permet un criblage de grille sans surveillance pour une cassette entière. En conséquence, le temps de l’opérateur pour le criblage de 12 grilles peut être réduit à ~10 min avec Autoscreen contre ~6 h avec les méthodes précédentes qui sont entravées par leur incapacité à tenir compte de la grande variabilité entre les grilles. Ce protocole présente d’abord la configuration et les fonctionnalités de base de Leginon, puis démontre la fonctionnalité Autoscreen étape par étape, de la création d’une session modèle à la fin d’une session de criblage automatisé à 12 grilles.

En suivant le protocole, les séances de dépistage cryoEM peuvent être exécutées automatiquement et avec succès pour la majorité (80 % à 90 %) des grilles et des conditions trouées. Plusieurs exemples et expériences ont été présentés précédemment 8,9 pour démontrer les résultats attendus de sessions Smart Leginon Autoscreen réussies. Une session Autoscreen réussie commence par ~10 min de configuration et aboutit généralement à une cassette complète de 12 grilles criblées automatiquement après environ 6 h (30 min par grille) où 3 à 5 carrés de tailles différentes et 3 à 5 trous par carré sont imagés à fort grossissement, permettant à l’utilisateur de déterminer rapidement les caractéristiques de l’échantillon sur chaque grille et d’itérer rapidement dans les conditions échantillon/grille (Figure 3). Parfois, les sessions échouent, généralement parce qu’Autoscreen cible les carrés cassés, n’interprète pas correctement les grands gradients d’épaisseur de glace sur la grille ou sur les carrés, ou ne parvient pas à identifier correctement les trous sur les grilles de carbone. De plus, les fuites de mémoire potentielles peuvent provoquer un plantage de Leginon en raison d’une utilisation excessive de la mémoire, qui peut être résolu en libérant de la RAM, ou en redémarrant l’ordinateur, ou amélioré en ajoutant plus de RAM à l’ordinateur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig01.jpg"> Figure 1 : flux de travail Smart Leginon Autoscreen. Un aperçu de haut niveau du flux de travail Smart Leginon Autoscreen. Tout d’abord, une session de modèle est créée en sélectionnant les paramètres d’une grille représentative dans le lot de grilles à filtrer. La configuration de Leginon et la création d’une session de modèle prennent moins de 45 minutes. Deuxièmement, Autoscreen est configuré pour utiliser les paramètres de session de modèle pour filtrer toutes les grilles de la cassette. La configuration d’Autoscreen prend moins de 10 minutes. Enfin, Autoscreen met fin à la séance de projection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig02.jpg"> Figure 2 : Pipeline cryoEM conventionnel à particule unique avant le criblage automatisé. Les étapes les plus courantes du pipeline cryoEM conventionnel à particules uniques avant le criblage automatisé, ainsi que les composants qui peuvent être améliorés. Chaque étape est colorée pour se rapprocher du goulot d’étranglement par rapport aux autres. La flèche circulaire bleue représente plusieurs boucles de rétroaction entre la plupart des étapes. Le débit à plusieurs étapes dépend fortement de l’échantillon, du financement et de l’emplacement du chercheur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig03.jpg"> Figure 3 : Résultats représentatifs de Smart Leginon Autoscreen. Images multi-échelles représentatives suivant le protocole Smart Leginon Autoscreen collectées sur un cryoTEM TFS Krios avec un filtre d’énergie BioQuantum et une caméra K3. (A) Une image composite de l’atlas montrant une vue d’ensemble d’une grille cryoEM. (B-F) Images multi-échelles des emplacements indiqués dans l’atlas quadrillé. Les images à faible grossissement dans la première rangée, les images à grossissement moyen dans la deuxième rangée et les images à fort grossissement dans la troisième rangée ont chacune été sélectionnées automatiquement pour obtenir des informations sur l’échantillon des carrés de glace minces à épais. L’épaisseur de la glace estimée par Leginon est indiquée sur le fond. Les barres d’échelle sont de 500 μm en (A) et 10 μm pour la première rangée, de 5 μm pour la deuxième rangée et de 100 nm pour la troisième rangée pour (B-F). Cette figure a été modifiée avec la permission de Cheng et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr : Grille</td>
			<td>sq : Carré</td>
			<td>hln : Trou</td>
			<td>ventilateur : Mise au point automatique</td>
			<td>fcn : Focus central</td>
			<td>enn : Exposition </td>
		</tr><tr><td>Grossissement</td>
			<td>210</td>
			<td>2600</td>
			<td>6700</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
			<td>120000</td>
		</tr><tr><td>Defocus</td>
			<td>-0.0002</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-0.00015</td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2,5 x 10-06 </td>
		</tr><tr><td>Taille du spot</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Intensité</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.83</td>
			<td>0.65</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.45</td>
		</tr><tr><td>Dimension </td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>4096 x 4096</td>
		</tr><tr><td>Compenser</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>512, 512</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>Binning</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>2 x 2</td>
			<td>1 x 1</td>
		</tr><tr><td>Temps d’exposition (ms)</td>
			<td>200</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>Pré-exposition (s)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Dose (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>36.5</td>
			<td>36.5</td>
			<td>64.7</td>
		</tr><tr><td>Enregistrer des images brutes</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Oui</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Paramètres prédéfinis pour le criblage de la grille cryoEM au Simons Electron Microscopy Center (SEMC) à l’aide d’un cryoTEM Glacios avec une caméra Falcon 3EC. Les paramètres de chaque préréglage couramment utilisé sur un cryoTEM Glacios avec une caméra Falcon 3EC au SEMC sont affichés. Différents microscopes auront des grossissements variables disponibles et différentes expériences utiliseront des paramètres variables tels que la défocalisation et le temps d’exposition.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr : Grille</td>
			<td>sq : Carré</td>
			<td>hln : Trou</td>
			<td>ventilateur : Mise au point automatique</td>
			<td>fcn : Focus central</td>
			<td>enn : Exposition </td>
		</tr><tr><td>Grossissement</td>
			<td>64</td>
			<td>1700</td>
			<td>2850</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
			<td>75000</td>
		</tr><tr><td>Defocus</td>
			<td>0</td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-1 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
		</tr><tr><td>Taille du spot</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>Intensité</td>
			<td>0.001</td>
			<td>1,65 x 10-05 </td>
			<td>1,5 x 10-05 </td>
			<td>4,3 x 10-07 </td>
			<td>4,3 x 10-07 </td>
			<td>5,5 x 10-07 </td>
		</tr><tr><td>Largeur du filtre d’énergie</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Dimension</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>2048 x 2048</td>
			<td>4096 x 4096</td>
		</tr><tr><td>Compenser</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>Binning </td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>2 x 2</td>
			<td>1 x 1</td>
		</tr><tr><td>Temps d’exposition (ms)</td>
			<td>500</td>
			<td>2000</td>
			<td>1000</td>
			<td>500</td>
			<td>300</td>
			<td>8700</td>
		</tr><tr><td>Pré-exposition (s)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Dose (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>47.4</td>
		</tr><tr><td>Enregistrer des images brutes</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Oui</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Paramètres prédéfinis pour le criblage de la grille cryoEM au SEMC à l’aide d’un cryoTEM Krios avec une caméra Selectris X et Falcon 4i. Les paramètres de chaque préréglage couramment utilisé sur un Krios avec un filtre d’énergie Selectris X et une caméra Falcon 4i au SEMC sont affichés. Différents microscopes auront des grossissements variables disponibles et différentes expériences utiliseront des paramètres variables tels que la défocalisation et le temps d’exposition.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>gr : Grille</td>
			<td>sq : Carré</td>
			<td>hln : Trou</td>
			<td>ventilateur : Mise au point automatique</td>
			<td>fcn : Focus central</td>
			<td>enn : Exposition </td>
		</tr><tr><td>Grossissement</td>
			<td>1550</td>
			<td>940</td>
			<td>2250</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
			<td>81000</td>
		</tr><tr><td>Defocus</td>
			<td>0</td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-1 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
		</tr><tr><td>Taille du spot</td>
			<td>4</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Intensité</td>
			<td>0.0015</td>
			<td>0.00017</td>
			<td>7,3 x 10-05 </td>
			<td>1,3 x 10-06 </td>
			<td>1,3 x 10-06 </td>
			<td>9,2 x 10-07 </td>
		</tr><tr><td>Largeur du filtre d’énergie</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>50</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Dimension</td>
			<td>1024 x 1024</td>
			<td>1440 x 1024</td>
			<td>1440 x 1024</td>
			<td>1440 x 1024</td>
			<td>1008 x 1008</td>
			<td>5760 x 4092</td>
		</tr><tr><td>Compenser </td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>0, 0</td>
			<td>936, 519</td>
			<td>0, 0</td>
		</tr><tr><td>Binning</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>8 x 8</td>
			<td>8 x 8</td>
			<td>8 x 8</td>
			<td>4 x 4</td>
			<td>2 x 2</td>
		</tr><tr><td>Temps d’exposition (ms)</td>
			<td>250</td>
			<td>600</td>
			<td>600</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>2100</td>
		</tr><tr><td>Pré-exposition (s)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Dose (e/Å2)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>51</td>
		</tr><tr><td>Enregistrer des images brutes</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Oui</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Paramètres prédéfinis pour le criblage de la grille cryoEM au SEMC à l’aide d’un cryoTEM Krios avec une caméra BioQuantum et K3. Les paramètres de chaque préréglage couramment utilisé sur un Krios avec un filtre d’énergie BioQuantum et une caméra K3 au SEMC sont affichés. Différents microscopes auront des grossissements variables disponibles et différentes expériences utiliseront des paramètres variables tels que la défocalisation et le temps d’exposition.
Figure supplémentaire 1 : Paramètres de ciblage carré et paramètres de carré pour Smart Leginon. (A) Paramètres de ciblage Square. (B) Paramètres carrés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(1).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Paramètres de ciblage des trous et Paramètres des trous pour Smart Leginon. (A) Paramètres de ciblage des trous. (B) Paramètres de trous. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(2).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Paramètres de ciblage de l’exposition et paramètres d’exposition pour Smart Leginon. (A) Paramètres de ciblage de l’exposition. (B) Paramètres d’exposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(3).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4 : Paramètres de mise au point et paramètres de séquence de mise au point pour Smart Leginon. (A) Paramètres de mise au point. (B) Paramètres de la séquence de mise au point (Défocalisation1). (C) Paramètres de la séquence de mise au point (Défocalisation2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(4).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Paramètres de Z_Focus et paramètres de séquence Z_Focus pour Smart Leginon. (A) Z_Focus paramètres. (B) Z_Focus réglages de séquence (Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus Paramètres de séquence (Stage_Tilt_Fine). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(5).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 6 : Un exemple d’atlas après la configuration des paramètres de Square_Targeting Smart Leginon. Les cercles bleus sont des taches, les signes plus verts sont des lieux d’acquisition et le « x » brun est l’emplacement actuel de la scène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(6).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 7 : Un exemple d’atlas après la configuration des paramètres de Hole_Targeting Smart Leginon. Les signes plus violets sont des emplacements en treillis, les signes plus verts avec des boîtes sont des emplacements d’acquisition et le signe plus bleu est l’emplacement principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(7).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 8 : Un exemple d’atlas après la configuration des paramètres de Exposure_Targeting Smart Leginon. Les cercles bleus sont des taches, les signes plus verts sont des emplacements d’acquisition et le signe plus bleu est l’emplacement du focus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(8).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 9 : Configuration du terminal Smart Leginon Autoscreen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(9).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 10 : Configuration de l’interface graphique de Smart Leginon Autoscreen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(10).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le criblage multi-grilles par cryo-microscopie électronique (cryoEM) est souvent un processus fastidieux qui demande des heures d’attention. Ce protocole montre comment configurer une collection Leginon standard et Smart Leginon Autoscreen pour automatiser ce processus. Ce protocole peut être appliqué à la majorité des grilles de feuilles de trous cryoEM.

Automatisation du criblage par cryo-microscopie électronique sur plusieurs grilles à l’aide de Smart Leginon

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Au Centre de microscopie électronique Simons, nous visons à fournir de superbes services, une expertise et une formation en microscopie électronique aux chercheurs locaux et nationaux, et à développer des méthodes innovantes pour optimiser les flux de travail. Notre champ d’action couvre les services, le développement, l’apprentissage automatique et la recherche biomédicale. Nous essayons de répondre à la question suivante : comment pouvons-nous mieux optimiser nos services ?L’apprentissage automatique change le domaine de la microscopie électronique. La collecte de données s’automatise. Les outils d’analyse de données deviennent rapidement plus performants.Cela comprend le débruitage des images, la sélection des particules, l’analyse de flexibilité 3G et la construction de modèles. Nous mettons régulièrement à jour les logiciels pour tenir compte de différentes situations, telles que différents trous de grille, une collecte inclinée ou des bogues identifiés par un logiciel de test bêta dans notre environnement de production. Nous intégrons également les commentaires de nos utilisateurs, de sorte que nous fournissons en permanence des fonctionnalités qui leur sont utiles.Smart Leginon s’occupe des tâches fastidieuses et laborieuses de criblage d’une ou plusieurs grilles sur un cryoTEM. Il permet aux opérateurs et aux chercheurs de passer au crible et d’analyser plus rapidement les grilles, tout en libérant du temps pour optimiser les conditions de la grille et de l’échantillon en parallèle. Cela réduit également le temps et le coût du microscope.L’écran automatique Smart Leginon offre un criblage multi-grilles entièrement sans surveillance, qui prend environ 10 minutes pour configurer le criblage pour 12 grilles. Par rapport au dépistage manuel, notre protocole permet de gagner plusieurs heures par jour. Depuis l’introduction de Smart Leginon, d’autres logiciels gratuits et commerciaux ont été développés pour une automatisation similaire.

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Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique

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