Name: Isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique A4F bifurqué (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Découvrez l'isolation de vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides à l'aide d'un dispositif microfluidique A4F. Cette méthode permet un flux continu et l'automatisation pour les applications biomédicales.

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Nous remercions tous les donneurs qui ont participé à cette étude, le personnel de la base de données génomique lettone pour avoir fourni les échantillons. L’Institut de physique des solides de l’Université de Lettonie en tant que centre d’excellence a reçu un financement du programme-cadre Horizon 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 739508, projet CAMART2. Ce travail a été soutenu par le Conseil letton des sciences Projet No. lzp-2019/1-0142 et le projet no : lzp-2022/1-0373.

Dispositif microfluidique pour l’isolement continu de vésicules extracellulaires à partir d’urine humaine

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A.A., G.M. et R.R. sont fondateurs, membres du conseil d’administration et actionnaires de Cellbox Labs, LLC

Le dispositif microfluidique présenté offre une méthode prometteuse pour l’isolement et l’extraction des VE à partir de fluides biologiques, remédiant à certaines des limites critiques des méthodes de référence existantes telles que UC et SEC12. L’UC et le SEC sont connus pour être à forte intensité de main-d’œuvre, de temps et de faible rendement, ce qui les rend moins adaptés aux applications à haut débit où de grandes quantités de VE sont nécessaires21,22. En revanche, le dispositif microfluidique décrit peut traiter en continu un volume substantiel allant jusqu’à 20 ml de fluide biologique avec une intervention minimale de l’utilisateur, ce qui en fait un changement potentiel pour les environnements industriels ou cliniques. L’un des principaux avantages de ce dispositif microfluidique est sa capacité à standardiser l’isolation des VE et à améliorer la reproductibilité par rapport aux méthodes traditionnelles qui impliquent des étapes manuelles. En réduisant la variabilité de la fabrication des dispositifs d’isolation des VE grâce à la fabrication de masse, les performances du dispositif peuvent être mieux contrôlées et cohérentes, ce qui est vital pour des applications telles que les thérapies et les diagnostics basés sur les VE. En outre, la compatibilité du dispositif avec la fabrication en grand volume via le moulage par injection par réaction de substrats appropriés améliore encore son potentiel d’évolutivité et d’adoption plus large.
Pour assurer la reproductibilité et des performances constantes, un protocole étendu et bien défini est nécessaire, à la fois pour produire la puce et pour son utilisation dans les expériences. La puce est conçue dans une optique d’industrialisation. Cependant, lors de la fabrication du dispositif en laboratoire, il faut veiller à éviter la formation de bulles, à assurer une liaison précise et robuste et à effectuer des tests approfondis à des vitesses d’écoulement plus élevées que celles attendues dans les expériences réelles. Cette précaution est particulièrement importante pour les dispositifs COC-OSTE, car ils peuvent être sujets à des fuites en raison d’un collage infructueux, en particulier à des débits plus élevés. De plus, comme l’OSTE est un matériau photosensible, la fabrication de l’appareil doit être effectuée en lumière jaune pour éviter une exposition inutile aux UV. Comme cette technologie en est encore à ses débuts, les chercheurs devraient expérimenter différentes vitesses d’écoulement pour identifier le réglage optimal pour leur application spécifique, car les protocoles standardisés pour cette nouvelle méthode n’ont pas encore été établis et la viscosité du liquide peut clairement affecter l’efficacité de l’isolation des VE sur la base de nos résultats. En suivant ces directives et en relevant les défis de la normalisation, le potentiel de ce dispositif microfluidique pour l’isolation des véhicules électriques peut être pleinement réalisé dans divers domaines de recherche et applications.
La méthode d’isolation des VE à l’aide du dispositif microfluidique permet une modification et un dépannage approfondis pour optimiser les performances. Pour améliorer la séparation des particules, les chercheurs peuvent explorer des canaux plus longs, différentes porosités et densités de pores membranaires, et des dimensions modifiées. S’il y a beaucoup de grosses particules dans la sortie des petites particules, il peut être bénéfique de tester une vitesse d’entrée du tampon plus élevée, tandis que s’il y a beaucoup de petites particules dans la sortie des grosses particules, il est recommandé d’expérimenter avec un canal plus long ou une membrane avec des pores plus larges. La prise en charge de l’absorption des particules peut impliquer d’ajuster les vitesses d’écoulement, les modifications de surface et la composition OSTE ou de modifier le temps d’exposition aux UV. Pour les appareils souffrant d’instabilité et de fuite, la diminution des vitesses d’écoulement et la garantie d’un collage correct sont des étapes cruciales. Pour minimiser les dommages causés par les VE, les chercheurs peuvent réduire les vitesses d’écoulement, laver plus soigneusement avec du PBS après la stérilisation du dispositif et envisager d’utiliser des pores de membrane plus petits ou des techniques et matériaux de conception de moules alternatifs. Grâce à ces ajustements, le dispositif microfluidique peut être affiné, libérant ainsi son potentiel pour diverses applications dans la recherche sur les véhicules électriques et les domaines connexes. De plus, pour optimiser les performances de l’appareil, la caractérisation des échantillons en amont, y compris les mesures de densité et de viscosité, pourrait être intégrée pour ajuster les paramètres d’écoulement. En outre, une attention particulière doit être accordée à la nature de l’échantillon, compte tenu de la non-stérilité établie des biofluides23. Par conséquent, la stérilisation des échantillons avant leur administration dans des applications cliniques doit être dûment envisagée.
Malgré ces défis, le dispositif microfluidique recèle un immense potentiel dans divers domaines de recherche. Sa capacité à isoler en continu les VE à partir de grands volumes d’échantillons très hétérogènes ouvre la porte à l’automatisation, facilitant les applications à haut débit et permettant une analyse plus approfondie des VE provenant de diverses sources. L’intégration de ce module microfluidique dans différents dispositifs, tels que des cartouches de bioréacteur à cellules creuses ou des cytomètres en flux à haute résolution, pourrait rendre les applications de VE plus conviviales pour l’industrie et stimuler l’innovation dans des domaines tels que l’administration de médicaments, le diagnostic et les cosmétiques4. Dans l’ensemble, ce dispositif microfluidique représente une avancée significative dans le domaine de la recherche sur les VE, offrant une méthode efficace et standardisée pour l’isolation des VE avec des applications prometteuses dans un large éventail de contextes de recherche et industriels.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membranaires dérivées de cellules comprenant deux types principaux : les exosomes (30-200 nm) et les microvésicules (200-1000 nm)1. Les exosomes se forment par bourgeonnement vers l’intérieur de la membrane endosomale dans un corps multivésiculaire (MVB), libérant des vésicules intraluminales (ILV) dans l’espace extracellulaire lors de la fusion avec la membrane plasmique1. En revanche, les microvésicules sont générées par le bourgeonnement vers l’extérieur et la fission de la membrane cellulaire2. Les VE jouent un rôle crucial dans la communication intercellulaire en transportant des protéines, des acides nucléiques, des lipides et des métabolites, reflétant l’état physiologique de la cellule, y compris la croissance, l’angiogenèse, les métastases, la prolifération et la résistance auxthérapies 3. En conséquence, ils sont apparus comme des biomarqueurs prometteurs et des cibles thérapeutiques pour des maladies, y compris le cancer, soulignant leur potentiel dans les systèmes de diagnostic et d’administration de médicaments4.
Pour utiliser pleinement les VE dans le diagnostic et la thérapeutique des maladies, il est crucial d’isoler efficacement divers biofluides5. Les méthodes courantes comprennent l’ultracentrifugation (UC), la centrifugation par gradient de densité, la chromatographie d’exclusion stérique (SEC), la filtration et l’immuno-isolement6. La CU est une technique largement utilisée, mais elle peut produire des particules de densité similaire qui ne sont pas des VE et peuvent générer des agrégats de VE7. La SEC a gagné en popularité en raison de sa capacité à fournir des échantillons de plus grande pureté en excluant les particules en fonction de leur taille plutôt que de leur densité8. Cependant, une sélection minutieuse de la taille de pores appropriée pour la colonne SEC et l’optimisation des conditions de chromatographie sont essentielles pour minimiser le co-isolement des particules indésirables comme les chylomicrons et les lipoprotéines de basse densité8. Malgré leur efficacité, les deux méthodes sont longues et difficiles à automatiser, en particulier pour les échantillons de plus grand volume comme les milieux cellulaires ou l’urine, ce qui limite leur évolutivité pour les applications industrielles9.
Ces dernières années, le fractionnement asymétrique du champ d’écoulement (A4F) a évolué comme une technique de séparation puissante pour la séparation de particules de taille micro et nanométrique basée sur la taille et la flottabilité10. Le principe de fonctionnement d’A4F repose sur un canal microfluidique doté d’une membrane poreuse à sa base, générant une force exercée vers la membrane appelée tangentiel10. Lorsqu’il est combiné avec le mouvement brownien et l’écoulement de Poiseuille inhérents au système, le flux croisé facilite une séparation efficace des particules en raison de la variation de la position des particules dans la dynamique de l’écoulement11. Malgré les avantages, cette méthode est limitée à des volumes d’échantillons de l’ordre de12 microlitres et nécessite une étape de focalisation supplémentaire, prolongeant la durée du processus10.
Au cours de la dernière décennie, la microfluidique a pris de l’importance en tant qu’outil de séparation rapide, efficace et cliniquement fiabledes VE 13. Cependant, la plupart des méthodes microfluidiques conçues pour la séparation des VE sont optimisées pour les échantillons de VE de petit volume et à forte concentration ou dépendent de procédures de séparation complexes14. De plus, dans le domaine de la microfluidique, le polydiméthylsiloxane (PDMS) est reconnu comme le matériau de référence en raison de sa transparence optique, de sa biocompatibilité et de sa facilité d’utilisation15. Néanmoins, sa propension connue à absorber de petites molécules lipophiles, dont les VE, peut être problématique pour son application dans le domaine desVE13.
Le copolymère d’oléfine cyclique (COC) est un matériau fréquemment utilisé en microfluidique en raison de sa biocompatibilité, de sa faible absorption des molécules et de sa résistance chimique élevée15. Cependant, la fabrication de dispositifs COC implique souvent des processus complexes ou des équipements spécialisés16. Par ailleurs, le thiol-ène hors stœchiométrie (OSTE) est une alternative prometteuse au PDMS en raison de la diminution de l’absorption des petites molécules, de la stabilité chimique supérieure, de la facilité de fabrication et du processus de fabrication évolutif17,18. Cependant, en raison des connexions complexes aux tubes, les appareils peuvent être sujets à des fuites19.
L’objectif de cette étude était de concevoir et de fabriquer un dispositif microfluidique combinant OSTE et COC et le principe A4F bifurqué pour la séparation des VE à partir d’échantillons de grand volume tels que l’urine ou les milieux cellulaires.

<table><tbody><tr><td>0,1 et micro ; m carboxylate FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Concentration de la matière : 3,6 x 1013 billes/mL (en fonction du LOT)</td></tr><tr><td>0,5 mL de tubes à microcentrifuger</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringue à cône Luer à usage unique sans aiguille</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro ; m polystyrène FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Concentration de la matière : 1 x 1010 billes/mL (selon LOT)</td></tr><tr><td>10 mL Pipettes sérologiques</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Filtres centrifuges Amicon Ultra</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Tubes Protein LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>seringues de 20 mL</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 et micro ; m ID polyéther éther cétone tube</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO unités de filtre centrifuge</td><td>Merck Millipore,UFC200324</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL Seringue médicale sans aiguille</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes coniques</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor d’ultracentrifugeuse à angle fixe</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 et micro ; m ID tube en polytétrafluoroéthylène</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque à 96 puits, f-bottom, liaison moyenne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>Plaque ELISA</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), sans sérum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Plate-forme</td> <td>de lames de microscopie TopasMicrofluidic Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas plate-forme de lames de microscopie 2 x 16 Mini Luer&nbsp ;</td><td>Microfluidic Chipshop</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de pression Elveflow OB1</td><td>Elvesys Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs Luer</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp ; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Aligneur de masque Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>analyseur de nanoparticules&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope optique Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg gratuit. Bioréactifs Fisher. 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PC (diamètre des pores de 50 nm, densité de 11,8 %)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, stériles</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/Colonne 35 nm</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC</td></tr><tr><td>QSIL 216 Kit d’élastomère de silicone</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Résine Tough Noir</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti rotor d’ultracentrifugeuse pivotant</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc</td><td>protéine Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Substrat de peroxydase de raifort</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité de nettoyage à ultrasons P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td> <td>universel à microplaquesBio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>Gobelet de collecte d’urine, 150mL, stérile</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 Seringue</td><td>Filtre SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Système de</td><td>diffusion dynamique de la lumière (DLS) préanalytique</td><td></td>&nbsp ;</tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique a4f bifurqué

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Les vésicules extracellulaires (VE) présentent un immense potentiel pour diverses applications biomédicales, notamment le diagnostic, l’administration de médicaments et la médecine régénérative. Néanmoins, les méthodologies actuelles d’isolement des VE présentent des défis importants, tels que la complexité, la consommation de temps et le besoin d’équipements encombrants, ce qui entrave leur application clinique. Pour remédier à ces limitations, nous avons cherché à développer un système microfluidique innovant basé sur le copolymère d’oléfines cycliques hors stœchiométrie thiol-ène (COC-OSTE) pour l’isolement efficace des VE à partir d’échantillons de grand volume de manière continue. En utilisant la séparation basée sur la taille et la flottabilité, la technologie utilisée dans cette étude a permis d’obtenir une distribution granulométrique nettement plus étroite par rapport aux approches existantes à partir d’échantillons d’urine et de milieux cellulaires, permettant de cibler des fractions de taille spécifiques des VE dans les applications futures. Notre conception innovante de dispositif microfluidique COC-OSTE, utilisant une technologie de fractionnement de champ à flux asymétrique bifurquée, offre une approche simple et continue d’isolation EV pour les échantillons de grand volume. De plus, le potentiel de fabrication de masse de ce dispositif microfluidique offre évolutivité et cohérence, ce qui permet d’intégrer l’isolation des VE dans les diagnostics cliniques de routine et les processus industriels, où une cohérence et un débit élevés sont des exigences essentielles.

Nous avons fabriqué un dispositif microfluidique à l’aide d’un moule double négatif imprimé en 3D (Figure 1) par lithographie douce (Figure 2A) pour une séparation à haut débit des VE basée sur le principe A4F bifurqué (Figure 2B,C). L’installation nécessite une pompe et une station de circulation, comme on peut le voir sur la figure 3, pour isoler les véhicules électriques de manière automatisée. Tout d’abord, pour évaluer la preuve de concept des dispositifs, un mélange de billes de polystyrène de 100 nm et 1000 nm de diamètre a été préparé pour représenter les vésicules et les débris cellulaires fins, respectivement10. Des expériences ont été menées avec des débits variables pour le mélange de billes, avec et sans écoulement bifurqué, afin d’étudier l’effet de la vitesse linéaire sur l’efficacité de la séparation. Dans toutes les expériences, la récupération des petites billes est restée constante et supérieure à 90 %10, montrant le potentiel du dispositif pour récupérer les VE.
Ensuite, nous avons évalué et comparé le potentiel du dispositif COC-OSTE pour isoler les VE de grands volumes (&gt;1 mL) de biofluides complexes avec un prétraitement minimal. Ainsi, l’urine de 10 donneurs sains (figure 4) et les milieux cellulaires de deux lignées cellulaires prostatiques différentes (figure 5) ont été utilisés comme modèle pour isoler simultanément les VE en suivant trois procédures différentes : l’ultracentrifugation (UC), la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et le dispositif OSTE-COC basé sur la microfluidique A4F. Après isolement, le nombre total de particules et leur distribution granulométrique ont été évalués à l’aide d’une analyse de suivi des nanoparticules (NTA). En moyenne, le dispositif OSTE-COC a montré une meilleure récupération des particules totales des biofluides par rapport à la CU, mais la signification statistique n’a été obtenue qu’en combinant le nombre de particules des deux ports (Figure 4A). Afin de comparer les performances de l’appareil avec d’autres systèmes, la prise R &amp; L doit être prise en considération. Comme le montre la figure 4, les performances des sorties L et R sur la récupération des VE surpassent celles de l’UC et de la SEC. Séparément, le port L a été conçu pour capturer la petite fraction EV, tandis que le port R a été conçu pour collecter la plus grande fraction EV avec d’autres molécules de taille similaire. Il est intéressant de noter que la récupération à l’aide du R-PORT du dispositif OSTE-COC était légèrement supérieure à celle de la SEC et de la CU seules (Figure 4A). L’expression de CD63 a montré un schéma similaire (Figure 4C). Ce résultat indique que le dispositif OSTE-COC était plus efficace dans la récupération totale des VE. Une distribution granulométrique équivalente a été trouvée entre les différentes méthodologies, sauf pour la CU, qui montre une distribution granulométrique plus grande (figure 4B).
Des résultats comparables ont été observés dans des cultures de milieux cellulaires. Dans les deux scénarios, la récupération totale des particules à partir des deux ports du dispositif a montré des performances supérieures à celles des méthodologies SEC ou UC (comme illustré dans la figure 5A, B). Notamment, les VE dérivées des cellules PC3 ont démontré une distribution de taille distincte, avec une plus grande homogénéité dans la distribution L-PORT par rapport à d’autres groupes expérimentaux (Figure 5C,D). De plus, l’analyse de l’expression de CD63 a confirmé les taux de récupération plus élevés des VE obtenus à l’aide du dispositif COC-OSTE (comme illustré dans la figure 5E,F). Un résumé comparant les caractéristiques d’isolement des différentes méthodologies examinées dans cette étude se trouve au tableau 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> Figure 1 : Dimensions du moule double négatif en forme de serpentin 3DP et vue isométrique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> Figure 2 : Dispositif microfluidique COC-OSTE. (A) Schéma des différentes étapes principales de la fabrication du dispositif OSTE-COC. (B) Principe de fonctionnement de l’appareil. (C) Image de l’appareil fini. Barre d’échelle : 15 mm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Priedols et al.10 et de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> Figure 3 : Configuration expérimentale de l’appareil. Le pousse-seringue est à gauche, le dispositif OSTE-COC est au milieu et la station de récupération est à droite. Cette figure a été modifiée avec la permission de Priedols et al.10 et de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> Figure 4 : Distribution granulométrique des VE urinaires et récupération des particules chez 10 donneurs à l’aide de l’ultracentrifugation (CU), de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et du dispositif COC-OSTE. (A) Quantité de particules récupérées à partir de chaque méthode d’isolement par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Les données sont représentées par une moyenne +/- écart-type. Signification statistique indiquée par * (p&lt;0,05). (B) Les boîtes à moustaches montrent la distribution granulométrique moyenne parmi tous les échantillons d’urine évalués par la NTA, les moustaches indiquant les valeurs minimales et maximales. Les valeurs p ont été dérivées des comparaisons avec la colite ulcéreuse, **** indiquant une signification statistique élevée (p&lt;0,0001). (C) La médiane et la plage de la quantité moyenne de CD63, évaluées à l’aide d’un test immuno-enzymatique à double sandwich (dsELISA), pour chaque méthode d’isolement, ont été calculées pour tous les échantillons. Port L : Port gauche ; Port R : Port droit. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> Figure 5 : Caractérisation des VE isolés des cellules PC3 et LNCaP à l’aide de différentes méthodes. (A) Quantité de particules récupérées dans un milieu PC3 à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) représentée par l’écart-type moyen+/- . (B) Quantité de particules récupérées à partir de milieux cellulaires LNCaP à l’aide de NTA représentée par une moyenne +/- écart-type. (C) La distribution granulométrique médiane des VE des cultures PC3, ainsi que la portée, ont été déterminées par NTA. (D) Distribution de la taille médiane des VE isolés à partir de cultures LNCaP avec portée. (E) Médiane et plage d’expression de CD63 pour chaque méthode d’isolement pour les VE dérivées de lignées cellulaires PC3, à l’aide d’un test immuno-enzymatique à double sandwich (dsELISA). (F) Médiane et plage d’expression de CD63 EV dérivée de LNCaP par dsELISA pour chaque méthode d’isolement. UC : Ultracentrifugation ; SEC : Chromatographie d’exclusion stérique ; Port L : Port gauche ; Port R : Port droit. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SECONDE</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>Temps de traitement/échantillon</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Débit</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Coût/échantillon</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Pureté</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Automatisation</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Rendement des véhicules électriques</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Sélection de la taille</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1. Comparaison des caractéristiques d’isolement des VE avec les trois méthodes UC SEC et le dispositif COC-OSTE. UC : Ultracentrifugation ; SEC : Chromatographie d’exclusion stérique. COC-OSTE : copolymère d’oléfine cyclique hors stœchiométrie thiol-ène. + : faible ; ++ : moyen ; +++ : élevé. * Selon l’appareil.

Les vésicules extracellulaires sont extrêmement prometteuses pour les applications biomédicales, mais les méthodes d’isolement actuelles prennent du temps et ne sont pas pratiques pour une utilisation clinique. Dans cette étude, nous présentons un dispositif microfluidique qui permet d’isoler directement des vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides de manière continue avec un minimum d’étapes.

Isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique A4F bifurqué

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Nous voyons le potentiel des vésicules extracellulaires, mais reconnaissons également la difficulté de leur isolement, en particulier à partir de biofluides de grands échantillons tels que les milieux de bioréacteur. Dans cette recherche, nous avons testé si nous pouvions utiliser le fractionnement asymétrique du champ d’écoulement pour isoler les vésicules extracellulaires. À l’heure actuelle, il est impossible d’isoler les vésicules extracellulaires directement des biofluides en flux continu pour les intégrer dans des bioréacteurs.Au lieu de cela, les biofluides doivent d’abord être collectés et traités, ce qui ajoute de la variabilité et de la main-d’œuvre. Notre dispositif conçu pour l’isolement des vésicules extracellulaires à partir de biofluides de grand volume permet l’intégration avec des bioréacteurs pour un débit continu et une automatisation. Nous avons constaté que la viscosité liquide pourrait avoir un impact sur l’isolation des vésicules extracellulaires en utilisant le fractionnement asymétrique du flux de champ.Nous cherchons à savoir si l’adaptation des flux de biofluides et de tampons à la viscosité peut améliorer l’isolation.

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