Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution
10 novembre 2023
L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.
Un défi courant dans la préparation d’échantillons de cryo-microscopie électronique est la localisation des particules à l’interface air-eau, ce qui fait que les particules adoptent des orientations préférées et se dénaturent. Au lieu de cela, il est préférable de faire reposer les particules sur la surface de la grille, que le film mince soutient, comme le graphène. Un autre défi est l’exigence de concentrations d’échantillons relativement élevées, qui pourraient également être résolues par le graphène.
Les grilles revêtues de graphène offrent de nombreux avantages pour la détermination de la structure cryoEM, mais ont toujours été difficiles à fabriquer en interne de manière reproductible, ainsi que leur coût d’achat prohibitif dans le commerce. Ce protocole permet le dépôt robuste de graphène monocouche, réduisant ainsi la barrière à l’utilisation de ces grilles par les utilisateurs dans leurs recherches. Le graphène est unique en raison de ses propriétés matérielles.
Il s’agit d’une monocouche de carbone et présente donc un bruit de fond minimal. D’autres supports de grille cryoEM, tels qu’une fine couche de carbone amorphe ou de flocons d’oxyde de graphène, ne peuvent pas être appliqués en monocouche unique et contribuent à un signal de fond plus important. Maintenant que nous avons établi un protocole robuste pour l’application du graphène aux grilles cryoEM, nous aimerions poursuivre la fonctionnalisation de grilles recouvertes de graphène avec des poignées d’affinité pour la capture sur grille directement à partir de lysats cellulaires.
Cela pourrait atténuer un autre goulot d’étranglement dans la préparation des échantillons cryoEM.
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Aperçu
Cet article présente un protocole pour revêtir des grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) d'une monocouche de graphène. L'utilisation du graphène améliore la densité des particules, minimise les interactions avec l'interface air-eau et améliore la distribution de l'orientation des particules.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie électronique cryogénique
- Science des matériaux
- Techniques de préparation des échantillons
Contexte
- La localisation des particules à l'interface air-eau est un défi courant en cryo-EM.
- Les orientations préférées peuvent conduire à la dénaturation des particules.
- Les supports en graphène peuvent aider les particules à se poser sur la surface de la grille.
- Historiquement, les grilles revêtues de graphène ont été difficiles et coûteuses à fabriquer.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole robuste pour le dépôt de monocouche de graphène sur les grilles cryoEM.
- Réduire les barrières pour les chercheurs afin d'utiliser des grilles revêtues de graphène.
- Améliorer les avantages de la détermination de la structure en cryo-EM.
Méthodes utilisées
- Développement d'un protocole pour le revêtement en graphène.
- Évaluation de la densité et de l'orientation des particules.
- Comparaison des grilles revêtues de graphène avec les grilles traditionnelles.
- Évaluation de la reproductibilité dans la fabrication des grilles.
Résultats principaux
- Les grilles revêtues de graphène améliorent significativement la localisation des particules.
- Une densité accrue des particules permet une meilleure détermination de la structure.
- Le protocole robuste facilite la fabrication interne des grilles en graphène.
- Coûts réduits et accessibilité améliorée pour les chercheurs.
Conclusions
- L'utilisation du graphène dans les grilles cryo-EM répond aux défis clés de la préparation des échantillons.
- Ce protocole permet une adoption plus large des grilles revêtues de graphène dans la recherche.
- Les propriétés uniques du graphène améliorent les capacités de la cryo-EM.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
