Name: Un modèle de rat de sécheresse oculaire avec un dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 6 s
Description: Découvrez un modèle de rat de sécheresse oculaire par injection sous-cutanée de scopolamine pour étudier le dysfonctionnement de la glande lacrymale. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes de la maladie et de tester de nouvelles thérapies.

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Cette étude a été soutenue par les spécialités cliniques clés de haut niveau de la province du Guangdong (SZGSP014) et la Fondation des sciences naturelles de Shenzhen (JCYJ20210324125805012).

Toutes les expériences sur les animaux effectuées selon ce protocole sont effectuées sous l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC).
1. Préparation des animaux
<ol><li>Préparez 12 rats femelles Wistar SPF en bonne santé âgés de 6 semaines pesant 160 g ± 20 g.</li>
	<li>Utilisez une lampe à fente et un ophtalmoscope pour examiner l’état oculaire de tous les rats, en vous assurant qu’il n’y a pas de maladie du segment antérieur ou de la rétine.</li>
	<li>Élevez tous les rats pendant 1 semaine avec suffisamment de nourriture et d’eau.</li>
	<li>Tous les rats ont été divisés au hasard en groupes normaux, concentration de médicament scopolamine 2,5 mg/mL, concentration de médicament scopolamine 5 mg/mL et concentration de médicament scopolamine 7,5 mg/mL, avec trois animaux dans chaque groupe.</li>
</ol>2. Préparation de la solution
<ol><li>Préparer le bromhydrate de scopolamine en le dissolvant dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % pour obtenir une solution à des concentrations de 7,5 mg/mL, 5 mg/mL et 2,5 mg/mL.</li>
	<li>Préparer une solution de chlorure de sodium à 0,9 % sans bromhydrate de scopolamine à utiliser comme injection pour le groupe témoin de rats.</li>
</ol>3. Équipement et préparation du matériel
<ol><li>Préparez un microscope pour petits animaux.</li>
	<li>Préparer le matériel pour l’expérience, y compris une seringue jetable de 1 mL avec aiguille (26 G) ; bandelettes ophtalmiques à la fluorescéine sodique ; bandelette de test de déchirure de Schirmer ; éthanol absolu ; 4 % de paraformaldéhyde ; xylène; baume neutre ; hématoxyline, éosine ; et kit de coloration périodique à l’acide Schiff.</li>
</ol>4. Injection sous-cutanée
REMARQUE : Cette procédure nécessite l’aide d’une deuxième personne pour aider à sécuriser les rats.
<ol><li>Maintenez le corps du rat stable et attrapez et étirez ses pattes arrière gauche (ou droite). REMARQUE : Un assistant peut aider à tenir l’animal.</li>
	<li>Nettoyer le site d’injection avec de l’alcool.</li>
	<li>Insérer une seringue jetable de 1 ml avec une aiguille (26 G) à la base du pli cutané entre le pouce et l’index.</li>
	<li>Aspirez la seringue en tirant sur le piston de la seringue. Tout sang dans la seringue indique un mauvais placement de l’aiguille ; Retirez et repositionnez l’aiguille.</li>
	<li>Administrer une solution de chlorure de sodium à 0,9 % avec ou sans bromhydrate de scopolamine dans un mouvement régulier et fluide.</li>
	<li>Injecter tous les rats selon différentes concentrations, à raison de 0,5 mL injecté à chaque fois et quatre fois par jour (à 9h00, 12h00, 15h00 et 18h00) pendant une période consécutive de 19 jours, en alternance entre les membres gauche et droit. NOTE : Les groupes sont nommés comme suit : Groupe sans bromhydrate de scopolamine : 0 groupe (témoin) Groupe avec bromhydrate de scopolamine 2,5 mg/mL : groupe 2,5 Groupe avec bromhydrate de scopolamine 5 mg/mL : 5 groupes Groupe avec bromhydrate de scopolamine 7,5 mg/mL : groupe 7,5</li>
	<li>Remettez l’animal dans sa cage et surveillez sa respiration et son comportement pendant 5 à 10 minutes.</li>
</ol>5. Test de sécrétion lacrymale (test lacrymal de Schirmer, STT)
<ol><li>Créer une bande de papier filtre modifiée pour les rats11. Coupez la moitié de la bande de papier filtre utilisée pour les humains le long de la ligne médiane (1 mm × 15 mm) et coupez la tête de la bande pour la rendre lisse. REMARQUE : Avant d’effectuer le test de sécrétion lacrymale, immobilisez manuellement le corps du rat pour l’empêcher de bouger et assurer l’exposition des yeux du rat.</li>
	<li>Placez la bande de papier filtre sur le 1/3 externe du sac conjonctival de la paupière inférieure du rat.</li>
	<li>Chronométrez le test pendant 5 min. Contrôlez la fermeture des yeux du rat tout au long de la procédure.</li>
	<li>Après la mesure, utilisez une pince à épiler pour serrer la bande de papier filtre dans un tube de microcentrifugation et notez le volume de déchirure en faisant une marque sur la paroi du tube.</li>
	<li>Mesurez la sécrétion lacrymale le jour 0, le jour 1, le jour 3, le jour 5, le jour 7, le jour 11, le jour 15 et le jour 19.</li>
</ol>6. Coloration cornéenne à la fluorescéine
<ol><li>Déposer 0,5 μL de solution de fluorescéine sodique à 0,5 % dans le sac conjonctival inférieur de chaque rat.</li>
	<li>Observez la cornée sous lumière bleue pendant 3 min après l’instillation de fluorescéine.</li>
	<li>Enregistrer la coloration par fluorescence de la cornée de chaque rat et observer s’il y a un défaut cornéen.</li>
	<li>Effectuez une coloration cornéenne à la fluorescéine le jour 0, le jour 1, le jour 3, le jour 5, le jour 7, le jour 11, le jour 15 et le jour 19.</li>
</ol>7. Observation histologique du tissu conjonctival
<ol><li>Après avoir terminé le développement du modèle, anesthésier profondément les rats avec une injection intrapéritonéale de 0,4 mL/100 g d’hydrate de chloral aqueux à 10 % pour soulager la tension des animaux. Ensuite, euthanasier les rats par luxation cervicale.</li>
	<li>Prélevez la conjonctive bulbaire dans les mêmes régions de chaque rat, d’une taille d’environ 2 mm x 2 mm.</li>
	<li>Fixer immédiatement les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et les incorporer dans de la parodine13.</li>
	<li>Couper des sections de 5 μm d’épaisseur et colorer avec de l’hématoxyline et de l’éosine (HE)14 et une coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) (suivre les instructions du fabricant).</li>
</ol>8. Observation histologique du tissu cornéen et lacrymal
<ol><li>Après avoir terminé l’élaboration du modèle, euthanasier le rat comme décrit à l’étape 7.1.</li>
	<li>Prenez la cornée du côté droit de chaque rat et fixez-la immédiatement dans une solution de paraformaldéhyde à 4%.</li>
	<li>Coupez l’épiderme céphalique et le tissu sous-cutané le long de la ligne reliant l’oreille et le coin externe de l’œil, élargissez l’incision des deux côtés et isolez davantage la glande extra-orbitaire jaunâtre.</li>
	<li>Retirez soigneusement la fourrure du rat et séparez la glande extraorbitaire avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %.</li>
	<li>Placer les glandes extraorbitaires isolées dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et les incorporer dans de la paraffine.</li>
	<li>Couper des sections continues de ~5 μm d’épaisseur et les colorer avec de l’HE pour les échantillons de tissu cornéen et glandulaire extraorbitaire.</li>
</ol>9. Analyse statistique
<ol><li>Utiliser un logiciel approprié pour l’analyse statistique des données.<ol><li>Effectuer une analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour analyser les données et le test de la différence la moins significative (LSD) pour la comparaison entre les groupes. Fixer le niveau de signification statistique à α = 0,05, P < 0,05 indiquant la signification statistique. NOTE : Le logiciel SPSS 20 a été utilisé pour l’analyse statistique des données expérimentales.</li>
	</ol></li>
</ol>

Dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine chez le rat

<ol><li>Papas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+prevalence+of+dry+eye+disease%3A+A+Bayesian+view%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Physiol+Opt%22%5BJournal%5D)">The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).</li>
<li>Sy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+opinion+in+the+management+of+aqueous+deficient+dry+eye+disease+%28DED%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED).</a> BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).</li>
<li>Seo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1alpha+%28hypoxia+inducible+factor-1alpha%29+prevents+dry+eye-induced+acinar+cell+death+in+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland.</a> Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).</li>
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<li>Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+influence+on+the+secretory+immune+system+of+the+eye%3A+androgen+regulation+of+secretory+component+levels+in+rat+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears.</a> J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).</li>
<li>Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+tear+volume+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of tear volume in the rat.</a> Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).</li>
<li>Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+production+after+unilateral+removal+of+the+main+lacrimal+gland+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys.</a> Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).</li>
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<li>Viau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+ocular+surface+and+lacrimal+gland+changes+in+a+new+scopolamine-induced+dry+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).</li>
<li>Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ocular+surface+changes+in+a+rabbit+dry+eye+model+using+a+modified+impression+cytology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique.</a> Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).</li>
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<li>Dursun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of keratoconjunctivitis sicca.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dry+eye+mouse+model+produced+by+exorbital+and+intraorbital+lacrimal+gland+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision.</a> Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).</li>
<li>Ramos, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonproliferative+and+Proliferative+Lesions+of+the+Rat+and+Mouse+Special+Sense+Organs%28Ocular+%5Beye+and+glands%5D%2C+Olfactory+and+Otic%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic).</a> J Toxicol Pathol. 31, (2018).</li>
<li>Stapleton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFOS+DEWS+II+Epidemiology+report%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">TFOS DEWS II Epidemiology report.</a> Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).</li>
<li>Foulks, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+guidelines+for+management+of+dry+eye+associated+with+Sjogren+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease.</a> Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).</li>
<li>Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+dry+eye+disease%3A+Useful%2C+varied+and+evolving+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review).</a> Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).</li>
<li>Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sjogren%27s+syndrome%3A+immunological+response+underlying+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%22%5BJournal%5D)">Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride).</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts potentiel lié aux médicaments et au matériel utilisés dans cette procédure.

La sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) est un type important de sécheresse oculaire, représentant environ 1/3 de la population totale des yeux secs17, et la principale cause de l’ADDE est une lésion pathologique et une inflammation des glandes lacrymales13. Pour ce type de sécheresse oculaire, les méthodes de traitement clinique les plus courantes sont les larmes artificielles pour soulager les symptômes ou l’application topique de stéroïdes ou de cyclosporine18, alors qu’il existe peu d’options de traitement pour les dommages à la glande lacrymale. Par conséquent, il est très important d’explorer l’impact de la reconstruction de la fonction des glandes lacrymales sur la sécheresse oculaire et d’établir un modèle animal de dysfonctionnement des glandes lacrymales. Nous avons utilisé une méthode d’application répétée de médicaments pour supprimer la sécrétion de la glande lacrymale chez le rat et créé un modèle animal de dysfonction chronique des glandes lacrymales sécheresse oculaire.
Nous avons choisi des rats pour construire ce modèle de sécheresse oculaire, qui présente plus d’avantages par rapport aux autres modèles animaux19. Par exemple, les lapins ont une plus grande taille et ont besoin de plus de doses de médicaments ou d’injections plus fréquentes pour obtenir l’effet désiré. De plus, les lapins sont légèrement plus chers, ce qui signifie plus de coûts pour l’expérience. Les souris sont également couramment utilisées dans la recherche ophtalmique, mais elles sont généralement utilisées pour construire des modèles du syndrome de Sjögren20. Ces modèles se concentrent sur la comparaison de l’inflammation des organes et de l’infiltration des lymphocytes pour explorer les mécanismes immunopathologiques. Les souris ont une petite taille corporelle, une anatomie complexe des glandes lacrymales et une faible sécrétion lacrymale, ce qui rend difficile la représentation précise de la production de larmes. Le modèle animal de rat est un modèle plus approprié pour la sécheresse oculaire car il permet des injections de médicaments pratiques, a des conditions d’alimentation relativement simples, convient aux études cliniques et expérimentales et présente également des avantages en termes de coût. C’est un bon modèle animal pour ADDE.
Nous avons appliqué la scopolamine, un bloqueur des récepteurs cholinergiques, pour inhiber les récepteurs cholinergiques dans le corps du rat, réduisant la sécrétion des glandes lacrymales et modifiant la structure pathologique des cellules des glandes lacrymales, ce qui simule fondamentalement l’état des glandes lacrymales chez les patients atteints de sécheresse oculaire. Comparativement à d’autres méthodes, cette approche simule mieux l’état endommagé des glandes lacrymales à l’état naturel. D’autres méthodes, telles que l’utilisation de gouttes ophtalmiques au chlorure de benzalkonium21 ou la modification des conditions extérieures telles que la réduction de l’humidité et l’augmentation de l’évaporation de la surface oculaire 4,8, ne font que perturber l’environnement de la surface oculaire et ne modifient pas l’état fonctionnel de la glande lacrymale. Par conséquent, ils ne conviennent pas aux sécheresses oculaires chroniques à long terme.
En mesurant le volume de sécrétion des larmes chez le rat, nous avons amélioré les bandelettes de test lacrymal de Schirmer. Tout d’abord, nous coupons la bandelette de test de déchirure utilisée par les humains le long de la ligne médiane. Ensuite, nous avons coupé le haut en forme d’arc rond et l’avons doucement replié en haut pour faciliter l’insertion dans le sac conjonctival inférieur du rat. Il est à noter que les rats sont actifs, et difficiles à mesurer les larmes pendant 5 min. Après avoir inséré la bandelette de test lacrymal de Schirmer dans le sac conjonctival inférieur du rat, nous avons fermé manuellement les yeux du rat pour augmenter leur confort et éviter de se débattre pendant la longue mesure des larmes, ce qui peut affecter les résultats de la mesure.
Lors de l’extraction de la glande lacrymale, il est nécessaire de la localiser d’abord. Le point de localisation de la glande lacrymale est le point médian entre l’avant de l’oreille et le canthus interne. Ensuite, coupez le tissu cutané sous la fourrure, minimisant l’entrée de fourrure fragmentée et réduisant le processus de manipulation à un stade ultérieur. Pendant le processus d’extraction, il est également important de nettoyer la fourrure fragmentée en temps opportun. En particulier lors de la séparation de la glande lacrymale, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline pour rincer à plusieurs reprises et éviter de mélanger avec d’autres tissus qui pourraient affecter les résultats de la section.
L’avantage du modèle animal de sécheresse oculaire développé est que le protocole corrélait différentes concentrations de médicaments avec différents degrés de lésions des glandes lacrymales. Cela fournit une base expérimentale pour l’étude du traitement du dysfonctionnement des glandes lacrymales. Nous avons affiné certaines des étapes opérationnelles du processus de modélisation afin de fournir des documents de référence plus détaillés pour un chercheur. De plus, nous avons ajouté des indicateurs d’analyse pour le modèle animal de sécheresse oculaire, incorporant des indicateurs morphologiques de la cornée, de la conjonctive et de la glande lacrymale, en comptant les cellules conjonctivales et en évaluant le degré de lésion des glandes lacrymales. Nous avons évalué la fonction des glandes lacrymales à partir de l’inflammation, de l’œdème et de l’atrophie. Nous avons choisi les méthodes d’analyse les plus complètes, les plus rentables et les plus précises pour refléter le degré de sécheresse oculaire et de dysfonctionnement des glandes lacrymales.
Cependant, notre méthode a également certaines limites. En raison du long processus de construction de modèles animaux, les expérimentateurs doivent injecter à plusieurs reprises. Bien qu’il existe actuellement certaines méthodes pour remplacer les injections manuelles, telles que les pompes à médicaments ou les patchs transdermiques, leur utilisation présente encore quelques complications. Notre prochain objectif est d’appliquer de meilleures méthodes pour réduire la fréquence des médicaments, éviter l’apparition de complications et assurer la précision du dosage. En conclusion, nous avons amélioré un modèle animal de sécheresse oculaire causée par l’injection de scopolamine, fournissant une base expérimentale pour la recherche sur le dysfonctionnement des glandes lacrymales dans l’ADDE.

En 2021, environ 12 % des personnes sont touchées de manière significative par la sécheresse oculaire1, ce qui en fait l’une des maladies oculaires chroniques les plus courantes. La sécheresse oculaire peut être divisée en deux types : la sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) et la sécheresse oculaire par évaporation (EDE)2, en fonction des différents facteurs qui affectent la maladie. L’ADDE est divisé en syndrome de Sjögren (SS) et non-SS, mais la majorité des patients atteints de sécheresse oculaire sont des patients non SS en clinique3. Les symptômes de sécheresse oculaire chronique affectent gravement la qualité visuelle des patients. Actuellement, le traitement conventionnel de la DED implique l’application de larmes artificielles pour lubrifier la surface oculaire et la physiothérapie des paupières. Cependant, le syndrome de l’œil sec peut ne pas offrir une guérison complète dans de nombreux cas. Par conséquent, l’étude de la pathogenèse de la sécheresse oculaire est cruciale pour le développement de nouveaux traitements et médicaments. Les modèles animaux du syndrome de l’œil sec constituent une base pour d’autres recherches.
Il existe de nombreuses façons de construire des modèles animaux du syndrome de l’œil sec4, notamment en modifiant les niveaux de sécrétion lacrymale en modifiant les niveaux d’hormones. Par exemple, l’ablation des testicules de rats peut réduire la sécrétion d’androgènes, augmenter la sécrétion lacrymale et diminuer la concentration de composants sécrétoires libres (SC) et d’IgA dans les larmes 5,6. Une autre méthode consiste à indiquer les réactions auto-immunes dans la glande lacrymale en enlevant les nerfs de la surface de l’œil qui contrôlent la glande. De plus, une réduction directe de la sécrétion lacrymale peut être obtenue en enlevant chirurgicalement la glande lacrymale7. Les conditions environnementales changeantes peuvent également accélérer l’évaporation des larmes. Par exemple, l’élevage d’animaux dans des conditions de faible humidité et de ventilation sèche peut établir un modèle de sécheresse oculaire par évaporation excessive8, qui peut être combiné à d’autres méthodes pour augmenter la gravité de la sécheresse oculaire. Les principaux médicaments utilisés pour induire des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire sont l’atropine et la scopolamine9. En tant qu’inhibiteurs parasympathiques, les deux peuvent induire un blocage pharmacologique des récepteurs cholinergiques (muscariniques) dans la glande lacrymale et inhiber la sécrétion de larmes. Comparée à la sécheresse oculaire causée par l’injection d’atropine10, la scopolamine a un effet inhibiteur plus fort sur les glandes sécrétionnelles, une durée d’action plus longue et des effets plus faibles sur les muscles lisses cardiaques, intestinaux grêles et bronchiques. C’est l’un des médicaments les plus matures pour les modèles animaux de sécheresse oculaire.
Différentes méthodes peuvent être utilisées pour induire la sécheresse oculaire avec la scopolamine, telles que l’injection sous-cutanée, la pompe à médicament ou l’application de patchs 4,11,12. Afin de réduire la fréquence d’administration de médicaments aux animaux de laboratoire, de nombreux chercheurs appliquent des patchs transdermiques sur la queue des souris ou utilisent des pompes à médicaments. Cependant, ces deux méthodes ont des limites. Par exemple, l’absorption des patchs transdermiques doit tenir compte de l’absorption individuelle des souris, ce qui peut entraîner un dosage incohérent des médicaments. Bien que les pompes à médicaments puissent contrôler avec précision la posologie de chaque administration, elles ne sont pas toujours compatibles avec le médicament administré ou la concentration utilisée. Ils doivent également être placés chirurgicalement, ce qui est plus invasif pour l’animal, nécessite un événement anesthésique et peut entraîner des complications post-chirurgicales telles que la déhiscence. L’injection sous-cutanée, bien que plus lourde, peut assurer un dosage précis pour chaque administration et maintenir la cohérence de l’administration du médicament entre les différents rats. En même temps, il a un coût inférieur et convient à la réalisation d’un grand nombre d’expériences sur les animaux.
Cette étude applique des injections sous-cutanées répétées de scopolamine pour établir un modèle de rat à œil sec. Nous analysons les indicateurs de la sécheresse oculaire tels que les défauts cornéens, les niveaux de sécrétion lacrymale et la morphologie pathologique de la cornée, de la conjonctive et de la glande lacrymale. En combinant la concentration de médicaments, les manifestations pathologiques et les symptômes de la sécheresse oculaire, nous développons en détail le modèle de rat à œil sec, fournissant des données expérimentales plus précises pour l’étude du traitement de la sécheresse oculaire et des mécanismes pathologiques. Nous décrivons également le processus de modélisation en détail pour les futurs chercheurs.

<table><tbody><tr><td>Solution de chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>SJZ No.4 Pharmaceutical</td><td>H13023201</td><td></td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd</td><td>G1113</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10009218</tr><tr><td>Bandelettes ophtalmiques sodique à la fluorescéine</td><td>Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd</td><td>YN-YG-I</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline et éosine</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>D006</td><td></td></tr><tr><td>Baume neutre</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.</td><td>G8590</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.</td><td>YA0012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration périodique à l’acide</td><td>Schiff Beyotime Biotechnology</td><td>C0142S</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes de test de déchirure Schirmer</td><td>Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd</td><td>YN-LZ-I</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de scopolamine</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>S860151</td><td></td></tr><tr><td>Microscope pour petits animaux</td><td>Head Biotechnology Co,. Ltd</td><td>ZM191</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10023418</tr></tbody></table>

un modèle de rat de sécheresse oculaire avec un dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

La sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) est un type de sécheresse oculaire qui peut entraîner une réduction de la quantité et de la qualité de la sécrétion lacrymale. Une production anormale prolongée de larmes peut entraîner une perturbation de l’environnement de la surface oculaire, y compris des lésions cornéennes et une inflammation. Dans les cas graves, l’ADDE peut entraîner une perte de vision ou même la cécité. Actuellement, le traitement de la sécheresse oculaire se limite aux gouttes ophtalmiques ou à la physiothérapie, qui ne peuvent que soulager les symptômes de l’inconfort oculaire et ne peuvent pas guérir fondamentalement le syndrome de l’œil sec. Pour restaurer la fonction de la glande lacrymale dans la sécheresse oculaire, nous avons créé un modèle animal de dysfonctionnement des glandes lacrymales chez le rat induit par la scopolamine. Grâce à l’évaluation complète de la glande lacrymale, des cornées, des conjonctives et d’autres facteurs, nous visons à fournir une compréhension complète des changements pathologiques de l’ADDE. Comparé au modèle actuel de souris œil sec, ce modèle animal ADDE comprend une évaluation fonctionnelle de la glande lacrymale, offrant une meilleure plate-forme pour étudier le dysfonctionnement des glandes lacrymales dans ADDE.

Schirmer I teste, SIT I Le volume lacrymal des rats a été mesuré les jours 0, 3, 5, 7, 11, 15 et 19 après le début de l’expérience. Les résultats expérimentaux ont montré que la sécrétion lacrymale du groupe scopolamine (groupe 2,5, groupe 5, groupe 7,5), par rapport au groupe témoin (groupe 0), était significativement diminuée, et la différence était statistiquement significative (P &lt; 0,01). Il n’y avait pas de signification statistique entre le groupe 2,5, le groupe 5 et le groupe 7,5 (P &gt; 0,05). Aucune différence significative n’a été observée entre les différents groupes en termes de nombre de jours (P &gt; 0,05) (figure 1, tableau 1).
Coloration cornéenne à la fluorescéine La coloration à la fluorescéine cornéenne a été réalisée les jours 0, 3, 5, 7, 11, 15 et 19 de l’expérience. Les résultats ont montré qu’il n’y avait pas de coloration à la fluorescéine cornéenne dans aucun groupe, ce qui indique qu’aucun défaut épithélial cornéen évident ne s’est formé au cours de l’expérience de 20 jours avec différentes concentrations de médicaments à base de scopolamine (Figure 2).
Analyse pathologique de l’épithélium cornéen Après l’expérience, des tissus cornéens de chaque rat ont été collectés pour une coloration HE afin d’observer la morphologie de l’épithélium cornéen et de mesurer l’épaisseur de la couche épithéliale cornéenne. L’épithélium cornéen du groupe témoin était composé de 4 à 6 couches de cellules épithéliales disposées de manière ordonnée, dont la couche basale était constituée d’une seule couche de cellules épithéliales cylindriques disposées de manière ordonnée et serrée. L’épithélium cornéen des groupes de scopolamine 2.5, 5 et 7 était significativement plus mince que le groupe témoin, avec une morphologie cellulaire aplatie et atrophique et une structure cellulaire désordonnée. Dans le groupe 7.5, il y avait une connexion intercellulaire lâche et une structure vacuolaire dans la couche basale (indiquée par la flèche rouge sur la figure 3). Par rapport à l’épithélium cornéen des groupes scopolamines, l’épithélium cornéen du groupe témoin normal a montré des différences statistiques dans l’épaisseur de la couche épithéliale cornéenne (Figure 4).
Analyse pathologique de la glande lacrymale La principale glande de sécrétion lacrymale chez le rat est la glande lacrymale extrorbitale15. Lors de l’observation de coupes de glandes lacrymales, des changements dans la morphologie des cellules épithéliales de la glande lacrymale ont été observés avec l’augmentation de la concentration de scopolamine, accompagnée d’inflammation et d’œdème tissulaire. Aucun changement de ce type n’a été observé dans le groupe témoin. Les résultats de la pathologie suggèrent que les changements inflammatoires de la glande lacrymale, l’œdème cellulaire et l’atrophie des cellules épithéliales glandulaires peuvent être utilisés comme indicateurs de lésions fonctionnelles de la glande lacrymale16 (tableau 2). Ces indicateurs peuvent être utilisés pour mesurer la gravité de la sécheresse oculaire par rapport à la quantité de sécrétion lacrymale (Figure 5).
Analyse des résultats de coloration conjonctivale La structure de la conjonctive dans le groupe témoin est complète, principalement composée de la couche superficielle et de la lamina propria. La couche superficielle est constituée de cellules épithéliales cylindriques laminées, lisses et complètes, avec des microvillosités à la surface de la cellule. Des cellules caliciformes dispersées étaient présentes entre les cellules épithéliales, avec un grand volume cellulaire et des granules muqueux dans le cytoplasme cellulaire. La couche superficielle de l’épithélium conjonctival dans les trois groupes de médicaments scopolamines était significativement plus mince, le nombre de microvillosités et de cellules caliciformes était réduit, la structure de l’arrangement cellulaire était incomplète, accompagnée d’œdème, et une petite quantité de cellules inflammatoires comme observé dans la coloration de l’EH (Figure 6).
En colorant la conjonctive avec PAS, le nombre moyen de cellules caliciformes par champ microscopique 40x dans trois échantillons indépendants de chaque souris a été calculé et exprimé en moyenne ± SD (Figure 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig01.jpg"> Figure 1 : Statistiques de la valeur du test de Schirmer dans chaque groupe (mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig02.jpg"> Figure 2 : Coloration à la fluorescéine sodique de la cornée de rat. Dans l’expérience de 20 jours avec la fluorescéine sodique, aucun résultat positif n’a été observé dans les cornées de tous les rats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig03.jpg"> Figure 3 : Coloration de l’épithélium cornéen et mesure de l’épaisseur. Dans le groupe 7.5, il y avait une connexion intercellulaire lâche et une structure vacuolaire dans la couche basale (indiquée par la flèche rouge) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig04.jpg"> Figure 4 : Statistiques de l’épaisseur de l’épithélium cornéen dans chaque groupe. Par rapport à l’épithélium cornéen des groupes scopolamines, l’épithélium cornéen du groupe témoin normal a montré des différences statistiques dans l’épaisseur de la couche épithéliale cornéenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig05.jpg"> (A) Groupe 0 : Dans le champ visuel, les glandes lacrymales présentaient une structure lobulaire et étaient composées de canaux et de glandes tubulaires, sans anomalies évidentes dans la morphologie des canaux, tandis que les glandes tubulaires étaient composées de cellules glandulaires en forme de cône avec des substances muqueuses abondantes dans le cytoplasme, pas d’œdème évident dans les tissus conjonctifs, pas d’anomalies évidentes dans les vaisseaux sanguins interstitiels, et pas de nécrose évidente et d’infiltration cellulaire inflammatoire. (B) Groupe 2.5 : Dans le champ visuel, une atrophie occasionnelle des cellules épithéliales de la glande lacrymale est observée, avec un volume réduit, des cavités glandulaires dilatées de forme irrégulière et une substance mucineuse réduite dans la cavité (indiquée par la flèche rouge). Il y a aussi une infiltration occasionnelle de lymphocytes libres dans le stroma (indiquée par la flèche bleue), mais aucune anomalie évidente dans la morphologie du canal ou aucun signe d’œdème n’est observé. (C) Groupe 5 : Dans le champ visuel, les cellules épithéliales lacrymales ont parfois été atrophiées et réduites en taille, la cavité glandulaire a été élargie, la substance muqueuse dans la cavité a été réduite (flèche rouge) et une infiltration de lymphocytes libres a parfois été observée dans le stroma (flèche bleue), et aucune anomalie évidente de la morphologie des canaux ou d’œdème du tissu conjonctif entre les lobules des glandes lacrymales n’a été observée. (D) Groupe 7.5 : L’œdème peut être vu dans le champ visuel ; l’espacement entre les glandes lacrymales est élargi et la disposition est irrégulière (flèche verte), les cellules épithéliales des glandes lacrymales sont souvent atrophiées, le volume devient plus petit et la forme est irrégulière (flèche jaune), parfois la cavité glandulaire est élargie, la matière muqueuse dans la cavité est réduite (flèche rouge), parfois le lymphocyte libre est infiltré (flèche bleue), sans anomalies apparentes dans la morphologie des canaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig06.jpg"> Figure 6 : Coloration HE de la conjonctive de rat. Par rapport à l’épithélium conjonctival du groupe témoin, les trois groupes d’épithélium conjonctival médicamenté par la scopolamine ont montré des dommages structurels à des degrés divers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig07.jpg"> Figure 7 : Coloration PAS de la conjonctive. (A) Rats témoins normaux. (B) rats du groupe scopolamine. (C) Densité des cellules caliciformes dans chaque groupe (20x). Barre noire = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="7">Test de Schirmer I, SIT(Valeur moyenne, unité [mm])</td>
		</tr><tr><td>Groupe</td>
			<td>0 jours</td>
			<td>3 jours</td>
			<td>5 jours</td>
			<td>7 jours</td>
			<td>11 jours</td>
			<td>15 jours</td>
			<td>19 jours</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>6</td>
			<td>4.2</td>
			<td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>5.5</td>
			<td>6.3</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2.7</td>
			<td>2</td>
			<td>2.7</td>
			<td>3.3</td>
			<td>3.7</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>2.7</td>
			<td>1.7</td>
			<td>2.3</td>
			<td>3.2</td>
			<td>3.7</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>7.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>3.2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.8</td>
			<td>2.7</td>
			<td>3.2</td>
			<td>2.8</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Test de Schirmer sur des rats dans les quatre groupes à différents moments (mm). Après l’application de médicaments, la sécrétion de larmes chez les rats a considérablement diminué.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td>Nécrose</td>
			<td>Inflammation</td>
			<td>Œdème</td>
			<td>Atrophie épithéliale</td>
		</tr><tr><td>0 Grp-1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>0 grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>0 grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Score tissulaire pathologique de la glande lacrymale du rat. Critère de notation : 0 : Dans des conditions normales, compte tenu de facteurs tels que l’âge, le sexe et la tension de l’animal, le tissu est considéré comme normal ;
1 : Les changements observés ont juste dépassé la plage normale ; 2 : Des lésions peuvent être observées, mais elles ne sont pas encore sévères ; 3 : Les lésions sont évidentes et continuent de s’aggraver ; 4 : Les lésions sont extrêmement graves et ont affecté l’ensemble des tissus16.

Ici, nous établissons un modèle de dysfonctionnement des glandes lacrymales chez le rat pour fournir une base pour l’étude de la sécheresse oculaire carencée en eau.

Un modèle de rat de sécheresse oculaire avec un dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Le processus de développement d’un modèle animal de sécheresse oculaire est long. Il nécessite une injection sous-cutanée continue de scopolamine dans les pattes arrière du riz pour supprimer la sécrétion de la glande lacrymale chez le riz. Les expérimentateurs doivent donc avoir suffisamment de patience pour administrer le médicament régulièrement sur une longue période.Notre protocole est une méthode très utile qui permet de créer différents degrés de modèles de sécheresse oculaire en fonction de différentes concentrations de médicaments. Cela peut faciliter l’étude du traitement de la sécheresse oculaire pour les futurs chercheurs. Notre équipe continuera d’explorer le domaine de la régénération des glandes lacrymales, très enthousiaste à l’idée de travailler sur la reconstruction 3D et de mener des expériences de transplantation.Notre objectif ultime est de développer des options de traitement plus avancées et plus efficaces pour les personnes souffrant du syndrome de l’œil sec.

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Glaucome Expérimental induite par l&#39;injection oculaire de microsphères magnétiques

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