Name: Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 35 s
Description: Apprenez à créer un organoïde 3D de type tendon/ligament à partir de fibroblastes dermiques humains. Cette méthode sans support reproduit fidèlement la composition cellulaire et les interactions matricielles des tissus tendineux.

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D.D. et S.M.-D. reconnaître la subvention BMBF « CellWiTaL : Systèmes cellulaires reproductibles pour la recherche de médicaments - impression laser sans couche de transfert de cellules uniques hautement spécifiques dans des structures cellulaires tridimensionnelles » Proposition n° 13N15874. D.D. et V.R.A. récompensent la bourse EU MSCA-COFUND OSTASKILLS « Formation holistique de la recherche sur l’arthrose de nouvelle génération » GA Nr. 101034412. Tous les auteurs remercient Mme Beate Geyer pour son assistance technique.

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de techniques aseptiques.
1. Culture et pré-expansion des NHDF
<ol><li>Décongelez rapidement le flacon cryogénique contenant des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF, 1 x 106 cellules) à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient presque en train de décongeler.</li>
	<li>Ajouter lentement 1 mL de milieu de croissance des fibroblastes 2 préchauffé (trousse prête à l’emploi comprenant un milieu basal, un sérum de veau fœtal à 2 %, un facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et de l’insuline) complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (pen/streptocoque) (milieu NHDF), préchauffé à 37 °C sur les cellules.</li>
	<li>Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirez le surnageant. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 12 mL de milieu NHDF préchauffé.</li>
	<li>Transférez les cellules dans une fiole T-75 et agitez brièvement dans le sens transversal. Placer la fiole T-75 à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .</li>
	<li>Changez de milieu tous les 2 jours. Observez les NHDF au microscope jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 70 à 80 %.</li>
</ol>2. Expansion 2D
<ol><li>Sortez la fiole T-75 de l’incubateur et retirez le milieu NHDF. Lavez les cellules avec une solution saline tampon de phosphate (PBS) préchauffée.</li>
	<li>Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % dans les cellules. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon (environ 3 min).</li>
	<li>Ajouter 6 ml de milieu NHDF préchauffé pour neutraliser l’action de la trypsine. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à RT et retirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu DMEM (Modified Eagles Medium) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 x acides aminés MEM, 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.</li>
	<li>Placez les NHDF dans une boîte de culture cellulaire adhérente de 10 cm à une densité de 8 x 103 NHDF/cm2 (au total, 4,4 x 105 NHDF par boîte de 10 cm). Balancez-vous doucement en croix.</li>
	<li>Placez la boîte de culture cellulaire de 10 cm à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 . Changez de support tous les 2 jours</li>
	<li>Surveiller les cellules au microscope jusqu’à ce que la confluence atteigne 100 % (environ 5 jours).</li>
</ol>3. Stimulation 2D
<ol><li>Sortez de l’incubateur les boîtes de culture cellulaire de 10 cm contenant les NHDF (étapes 2.6 et 2.7). Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS préchauffé.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 50 μg/mL d’acide ascorbique et 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.</li>
	<li>Placez la boîte de Pétri à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 . Changez de milieu tous les 2 jours.</li>
	<li>Surveiller les NHDF au microscope pendant 14 jours.</li>
</ol>4. 3D maturation
<ol><li>Sortez la boîte de culture cellulaire de 10 cm de l’incubateur et retirez le milieu à haute teneur en glucose DMEM.</li>
	<li>Détachez doucement et rapidement la feuille de cellules formée de la parabole à l’aide d’un grattoir à cellules. Tout en détachant, roulez simultanément la feuille de cellule en un organoïde en forme de tige 3D.</li>
	<li>Prenez et placez les organoïdes NHDF dans une boîte de Pétri non adhérente (pour les cellules) de 10 cm. Ce type de parabole est utilisé pour éviter l’émigration cellulaire de l’organoïde vers le plastique.</li>
	<li>À ce moment-là ou un jour après (jour 0 ou jour 1 de la maturation 3D), prélevez certains des organoïdes pour des analyses plus approfondies telles que le poids humide, l’évaluation histologique (les organoïdes du jour 1 sont préférables car ils deviennent plus compacts), l’isolement de l’ARN et des protéines.</li>
	<li>Fixez les bords de l’organoïde avec des broches métalliques comme suit :<ol><li>Tenez soigneusement un côté de l’organoïde à l’aide d’une pince à épiler, et à l’aide d’une autre pince à épiler, appliquez doucement un étirement manuel d’environ 10 % d’allongement axial. Pour estimer l’allongement axial de 10 %, utilisez un papier millimétrique ou une règle.</li>
		<li>Ensuite, prenez une goupille métallique avec la pince à épiler et appuyez manuellement à travers le bord de l’organoïde dans le plat en plastique pour le fixer. Répétez cette procédure avec la deuxième goupille sur le deuxième bord de l’organoïde.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 10 ml de milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 1 x acides aminés MEM, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 ng/mL de TGFß3 et 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.</li>
	<li>Placez la parabole de 10 cm à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 . Changez de milieu tous les 2 jours.</li>
	<li>Surveillez régulièrement les organoïdes pendant 14 jours. REMARQUE : Les goupilles peuvent se desserrer, donc refixez-les en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 4.5.</li>
	<li>Après 14 jours, retirez le milieu à haute teneur en glucose DMEM des organoïdes. Lavez les organoïdes avec du PBS préchauffé.</li>
	<li>Mesurez les organoïdes pour le poids humide au jour 0 et au jour 14 à l’aide d’une balance de précision.<ol><li>Placez une parabole vide de 10 cm sur la balance et tarez le poids à zéro pour vous assurer que seul le poids des organoïdes est mesuré. Retirez complètement le milieu de culture de la boîte de 10 cm et mesurez le poids humide de l’organoïde un par un. REMARQUE : Dans cette étude, au jour 0, trois organoïdes par donneur et au jour 14, deux organoïdes par donneur ont été pesés.</li>
	</ol></li>
	<li>Selon les objectifs de l’étude, mettez en œuvre certains des organoïdes NHDF dans d’autres analyses histologiques ou congelez-les immédiatement dans de l’azote liquide à l’aide de tubes stériles sans ADN/ARN pour l’isolement ultérieur de l’ADN, de l’ARN et des protéines, puis stockez-les à -80 °C.</li>
	<li>Pour l’examen histologique, fixer chaque organoïde dans 5 mL de paraformaldéhyde prérefroidi (4 °C) à 4 % dans du PBS (ajusté à un pH neutre) pendant 45 min sur de la glace, suivi d’un lavage PBS à RT (2 x 5 min chacun).</li>
	<li>Cryoprotégez les organoïdes fixes à l’aide d’un gradient de saccharose en plaçant les organoïdes dans des bocaux en verre pour l’histologie. Incuber les organoïdes dans 10 % de saccharose dans une solution de PBS pendant 2 h à 4 °C, puis 2 h à 4 °C à 20 % de saccharose/PBS, et enfin une nuit d’incubation à 30 % de saccharose/PBS à 4 °C. Changez les solutions de saccharose en pipetant d’abord, puis en remplissant avec la nouvelle solution.</li>
	<li>Intégrez les organoïdes dans le cryo-milieu.<ol><li>Placez une plaque de cuivre sur de la glace sèche dans une boîte en polystyrène et laissez refroidir pendant 10 min.</li>
		<li>Ensuite, placez un cryomoule en plastique, pré-rempli de cryo-médium, sur la plaque de cuivre et appuyez doucement sur l’organoïde au fond du cryomoule à l’aide d’une pince à épiler. Attendez que le cryomédium soit complètement congelé.</li>
		<li>Pour les organoïdes longs, coupez d’abord en deux à l’aide d’un scalpel et placez les deux moitiés parallèles l’une à l’autre dans le cryomoule. Répéter la procédure pour chaque organoïde destiné à subir une analyse histologique.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à la cryosection.</li>
	<li>À l’aide d’un cryotome, couper les organoïdes longitudinalement en sections de 10 μm d’épaisseur et les soumettre à une coloration histologique telle que l’hématoxyline et l’éosine (H&E) en utilisant le protocole standard8.</li>
</ol>

Modèle organoïde en trois étapes pour la recherche et l’ingénierie des tendons

<ol><li>Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+plan+for+Achilles%3A+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li>
<li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+tendon+pathologies%3A+Triggers%2C+trails+and+end-state%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844(2020).</li>
<li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li>
<li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li>
<li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tendon+microenvironment%3A+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299(2022).</li>
<li>Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologics+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li>
<li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772(2023).</li>
<li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li>
<li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+tendon+stem%2Fprogenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406(2020).</li>
<li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li>
<li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li>
<li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li>
<li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered%2C+scaffold-free+tendon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li>
<li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem%2Fprogenitor+cells+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272(2018).</li>
<li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+tendons%3A+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047(2020).</li>
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<li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-%CE%B2+and+elongated+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les résultats démontrés dans cette étude fournissent des informations précieuses sur l’établissement et la caractérisation du modèle organoïde NHDF 3D pour l’étude des tissus T/L. Le protocole en 3 étapes a conduit à la formation d’organoïdes 3D en forme de bâtonnets qui présentent des caractéristiques typiques de la niche T/L. Ce modèle a déjà été rapporté dans Kroner-Weigl et al. 20237 et démontré en détail ici.
Les images en contraste de phase présentées dans la figure 2 ont montré la progression de la confluence NHDF et la formation de la nappe au cours des étapes d’expansion et de stimulation. Le processus de maturation 3D a été réalisé en roulant manuellement les feuilles cellulaires en organoïdes 3D ressemblant à des bâtonnets, qui ont ensuite été cultivés sous tension statique pendant 14 jours. Les organoïdes présentaient un aspect blanc scintillant et une densité accrue au 14e jour, suggérant une contraction et une réorganisation structurelle au sein des organoïdes. Cela indique que la période de maturation est critique pour obtenir une structure plus organisée et imitant les tissus T/L.
De plus, l’analyse du poids a révélé une diminution significative du poids humide des organoïdes entre les jours 0 et 14, indiquant encore une fois une contraction significative et une réorganisation de l’ECM au sein des organoïdes au cours du processus de maturation. Il est important de noter que les mesures du poids humide peuvent varier d’une expérience à l’autre en raison de la manipulation et du milieu résiduel dans l’organoïde ou dans les plats. De plus, l’organoïde peut contenir plus de milieu au début car, comme nous le verrons ci-dessous, au jour 0, les couches formées par le laminage de la feuille cellulaire sont séparées et non fusionnées. Avec le temps, les couches se sont jointes et sont devenues plus compactes, et ainsi, le support a pu être extrudé.
L’évaluation morphologique par coloration H&E a fourni des informations supplémentaires sur les caractéristiques structurelles de l’organoïde. Le jour 1, les organoïdes présentaient des couches déconnectées, principalement composées de cellules avec des noyaux ronds entourés d’une mince ECM péricellulaire. L’absence d’alignement cellulaire parallèle à l’axe de la charge de traction suggère qu’une maturation supplémentaire est nécessaire pour obtenir une architecture cellulaire et ECM plus organisée des organoïdes. Malgré la contraction et la réduction du poids et de la dimension des organoïdes entre les jours 1 et 14, la coloration H&E a montré une augmentation des zones positives à l’éosine, suggérant une augmentation du dépôt ECM. De plus, il n’y avait plus de couches visibles, et parfois, les cellules avaient des noyaux allongés et étaient positionnées en rangées de cellules parallèles. Cela a souligné que les cellules à l’intérieur des organoïdes subissent une auto-organisation en modifiant leur propre arrangement ainsi que le dépôt, la structure et l’alignement de l’ECM, imitant ainsi le comportement de la formation du tissu natif T/L.
Dans l’ensemble, ces résultats mettent en évidence le potentiel du modèle organoïde NHDF en tant qu’outil précieux pour l’étude de la biologie T/L, de la ténogenèse in vitro et même pour le développement ultérieur de l’ingénierie T/L sans échafaudage. Cependant, il y a trois étapes critiques pour la manipulation réussie du modèle organoïde 3D : 1) La formation d’une feuille cellulaire serrée pendant l’étape de stimulation 2D du protocole. Lors de l’utilisation de cellules primaires, cela dépend principalement des propriétés de la cellule donneuse ; Par conséquent, il est important d’évaluer plusieurs donateurs en parallèle ; 2) Le laminage manuel de la feuille de cellule. Cela nécessite de rouler rapidement, mais en même temps doucement, la feuille cellulaire à l’aide d’un grattoir cellulaire. Par conséquent, il est conseillé de prévoir des organoïdes initiaux pour entraîner d’abord cette procédure ; et 3) la fixation stable des broches sur les bords de l’organoïde. Cette fixation assure l’allongement axial de l’organoïde et empêche les déformations ainsi que l’effondrement en une structure en forme de grumeaux. De plus, pendant la phase de maturation 3D, puisque les organoïdes subissent un remodelage de l’ECM, les broches peuvent se détacher soudainement, il est donc important de surveiller fréquemment chaque organoïde et de refixer les broches.
Le modèle actuel n’a pas encore atteint le niveau de mimétisme in vivo du tissu T/L et présente un certain nombre de limites. Par exemple, il faut un grand nombre de cellules par organoïde ainsi que 35 jours pour que la procédure soit terminée, alors que la plupart des protocoles de différenciation, tels que le modèle de pastille chondrogénique 3D, sont réglés à 21 jours22. Les étapes de lavage de la procédure du protocole doivent de préférence être effectuées avec un tampon de lavage physiologiquement équilibré, par exemple, la solution saline équilibrée Hanks (HBSS) ou la solution saline équilibrée Earles (EBSS), plutôt que la PBS qui pourrait avoir des conséquences métaboliques pour les cellules humaines primaires cultivées in vitro. En ce qui concerne le milieu de culture utilisé dans les étapes de stimulation 2D et de maturation 3D dans l’organoïde, il a été choisi la formulation DMEM plus 10% FBS parce qu’elle est à la base de protocoles de différenciation largement acceptés ainsi que dans le but de normaliser et de comparer entre différents types de cellules pour leurs propriétés organoïdogènes.. La reproduction du protocole organoïde en 3 étapes dans différents contextes de laboratoire peut être influencée par le type de cellule utilisé, la qualité et le passage des cellules, ainsi que les propriétés cellulaires dépendantes du donneur. Des variations dans l’équipement, notamment dans la qualité des boîtes de culture cellulaire de 10 cm24 utilisées lors de la phase de stimulation 2D, pourraient potentiellement impacter la robustesse de la formation des feuillets cellulaires. De plus, en raison de la contraction de l’ECM au cours de la maturation 3D, la fixation axiale des organoïdes via des broches peut se desserrer ; Par conséquent, comme mentionné ci-dessus, une surveillance fréquente est recommandée. Le test et la sélection de différentes goupilles en termes de diamètre et de résistance peuvent également réduire le risque de détachement de la goupille25. Cependant, l’utilisation de goupilles pour l’étirement manuel n’est pas robuste et elle est sujette à une variabilité de manipulation ; Par conséquent, il est très important de développer dans la recherche de suivi un mécanisme de serrage pour maintenir les bords des organoïdes, ce qui peut non seulement aboutir à la standardisation de cette étape, mais peut également permettre un étirement dynamique des organoïdes. En général, il sera intéressant d’étudier deux façons de modifier les modèles d’organoïdes, l’une la réduction d’échelle - pour réduire le nombre de cellules par organoïde et la durée de la procédure, ce qui le rendra plus convivial, en particulier pour les études in vitro ; et la deuxième mise à l’échelle - augmenter les dimensions des organoïdes afin de tester leur comportement dans de grands modèles animaux comme stratégie potentielle de remplacement des tendons.
Le modèle présenté ici peut fournir une plate-forme pour étudier les mécanismes sous-jacents au développement des tendons, à la physiopathologie et peut-être à la réparation et à la régénération si les organoïdes sont combinés avec différents types de cellules et soumis à des micro-ruptures. Il est important de mentionner que l’étude de Kroner-Weigl et al. 20237 a identifié plusieurs limites concernant le type de cellules NHDF, à savoir, les organoïdes formés par NHDF sont plus grands et plus cellulaires que ceux dérivés des cellules T/L, ce qui rend difficile le contrôle de la prolifération et du comportement cellulaires. En ce qui concerne l’apoptose cellulaire, le test TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transférase dUTP nick end marking) n’a montré aucun signe de cellules mortes dans tout l’organoïde au jour 147, suggérant une diffusion appropriée des nutriments, des déchets et de l’oxygène pendant l’étape de maturation 3D. Il est intéressant de noter que, malgré les différences morphologiques, le dépistage pilote par PCR quantitative d’un certain nombre de gènes liés à la T/L (y compris différents types de collagène, la sclérosaxie (SCX), la sclérose (MKX), etc.) a suggéré une expression génique comparable entre le NHDF et les organoïdes T/L7, une découverte qui devrait être étudiée plus avant et devrait être validée au niveau des protéines. Par conséquent, pour ce type de cellule, une optimisation supplémentaire est nécessaire afin de soutenir la différenciation T/L et peut être basée sur l’ajustement du milieu utilisé dans les étapes de stimulation 2D et de maturation 3D (par exemple, la concentration sérique, les facteurs de croissance, les vitamines), l’allongement du temps de maturation ou même la soumission des organoïdes à un étirement mécanique dynamique. L’évolution du protocole pourrait encore améliorer les propriétés compositionnelles, structurelles et fonctionnelles des organoïdes, permettant ainsi au modèle de mieux imiter la niche tissulaire complexe in vivo T/L. De plus, d’autres sources cellulaires peuvent être étudiées pour leur capacité à former des organoïdes T/L et si elles peuvent subir une différenciation T/L. Yan et al. 20209, a utilisé le modèle organoïde 3D en utilisant des cellules souches/progénitrices tendineuses jeunes/saines et âgées/dégénératives (Y-TSPCs et A-TSPCs) pour étudier le comportement cellulaire en 3D ainsi que si la capacité de formation des tendons change avec le vieillissement T/L. Ils ont rapporté que les organoïdes A-TSPC 3D présentent une mauvaise morphologie tissulaire et que les cellules à l’intérieur ont un taux de prolifération plus faible mais une apoptose plus élevée parallèlement à des niveaux élevés de marqueurs liés à la sénescence9. Par conséquent, le modèle organoïde 3D T/L est une plate-forme prometteuse pour l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le vieillissement des tendons et peut être utilisé pour tester de nouvelles thérapies pharmacologiques pour la réparation et la régénération des tendons. Dans une approche différente, Chu et al. 2021 ont implémenté des cellules folliculaires dentaires (DFC) dans le modèle organoïde 3D afin d’évaluer leur différenciation ligamentogénique. Ce type de cellule formait des organoïdes très bien organisés, suggérant ainsi que les DFC étaient une source cellulaire attrayante pour différencier le tissu du ligament parodontal (PDL), qui pourrait, à son tour, développer une stratégie thérapeutique prometteuse pour la parodontite8.
À l’avenir, le modèle pourrait devenir encore plus complexe en incluant différents types de cellules (par exemple, les myofibroblastes, les macrophages), ce qui pourrait offrir de nouvelles perspectives sur les comportements spécifiques aux cellules et la diaphonie cellulaire au sein des organoïdes et contribuer à une compréhension plus complète de la biologie, de la physiologie et de la physiopathologie de T/L 8,9,16,26.
Les modèles organoïdes 3D présentent plusieurs avantages pour les applications d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative. Ils imitent étroitement la composition et l’organisation cellulaires ainsi que les interactions entre cellules et entre cellules et cellules des tissus humains, offrant ainsi une plate-forme physiologiquement pertinente pour l’étude des mécanismes de la maladie et des réponses auxmédicaments27. Les organoïdes peuvent être utilisés comme une plate-forme de criblage à haut débit pour évaluer l’efficacité mais aussi les effets secondaires potentiels de différents médicaments et fournir une alternative fiable et peu coûteuse aux tests sur les animaux. De plus, ils permettent des comparaisons directes entre les affections saines et malades, ce qui permet de découvrir des changements moléculaires et cellulaires clés associés à diverses pathologies, d’identifier des biomarqueurs pour la détection précoce des maladies, de faciliter la compréhension des mécanismes de la maladie et de développer des thérapies ciblées28,29.
Dans l’ensemble, nous avons démontré en détail les étapes du modèle organoïde 3D T/L précédemment établi qui fournit une plate-forme prometteuse pour l’étude de la biologie tissulaire T/L et des processus ténogéniques in vitro de divers types de cellules. La mise en œuvre, l’optimisation et la recherche de ce modèle sont fortement encouragées, car elles peuvent conduire à l’avancement des stratégies d’ingénierie T/L sans échafaudage, qui, à leur tour, peuvent contribuer à améliorer la thérapie T/L.

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des composants vitaux du système musculo-squelettique qui fournissent un soutien et une stabilité essentiels au corps. Malgré leur rôle critique, ces tissus conjonctifs sont sujets à la dégénérescence et aux blessures, provoquant des douleurs et des troubles de la mobilité1. De plus, leur apport sanguin limité et leur capacité de guérison lente peuvent entraîner des blessures chroniques, tandis que des facteurs tels que le vieillissement, les mouvements répétitifs et une réadaptation inadéquate augmentent encore le risque de dégénérescence etde blessures. Les traitements conventionnels, tels que le repos, la physiothérapie et les interventions chirurgicales, ne parviennent pas à restaurer complètement la structure et la fonction T/L. Au cours des dernières années, les chercheurs se sont efforcés de mieux comprendre la nature complexe de la T/L afin de trouver des traitements efficaces pour les troubles T/L 3,4,5. Les T/L se distinguent par une structure hiérarchiquement organisée, dominée par la matrice extracellulaire (ECM), composée principalement de fibres de collagène de type I et de protéoglycanes, une caractéristique difficile à reproduire in vitro6. Les modèles traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ne parviennent pas à capturer l’organisation tridimensionnelle (3D) caractéristique des tissus T/L, ce qui limite leur potentiel de traduction et entrave les progrès innovants dans le domaine de la régénération T/L.
Récemment, le développement de modèles organoïdes 3D a offert de nouvelles possibilités pour faire progresser la recherche fondamentale et l’ingénierie tissulaire sans échafaudage de divers types de tissus 7,8,9,10,11,12,13. Par exemple, pour étudier la jonction myotendineuse, Larkin et al. 2006 ont développé des constructions musculaires squelettiques 3D avec des segments de tendon auto-organisés dérivés du tendon10 de la queue de rat. De plus, Schiele et al. 2013, en utilisant des canaux de croissance micro-usinés recouverts de fibronectine, ont dirigé l’auto-assemblage des fibroblastes dermiques humains pour former des fibres cellulaires sans l’aide d’un échafaudage 3D, une approche qui peut capturer les traits clés du développement des tendons embryonnaires11. Dans l’étude de Florida et al. 2016, les cellules stromales de la moelle osseuse ont d’abord été étendues en lignées osseuses et ligamentaires, puis utilisées pour générer des feuilles cellulaires monocouches auto-assemblées, qui ont ensuite été mises en œuvre pour créer une construction os-ligamentaire-os multiphasique imitant le ligament croisé antérieur natif, un modèle visant à améliorer la compréhension de la régénération ligamentaire12. Pour élucider les processus de mécanotransduction tendineuse, Mubyana et al. 2018 ont utilisé une méthodologie sans échafaudage par laquelle des fibres de tendon uniques ont été créées et soumises à un protocole de charge mécanique13. Les organoïdes sont des structures 3D auto-organisées qui imitent l’architecture native, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus. Les cultures d’organoïdes 3D fournissent un modèle plus pertinent sur le plan physiologique pour l’étude de la biologie des tissus et des organes ainsi que de la physiopathologie. De tels modèles peuvent également être utilisés pour induire une différenciation tissulaire spécifique de différents types de cellules souches/progénitrices14,15. Par conséquent, la mise en œuvre de modèles organoïdes 3D dans le domaine de la biologie T/L et de l’ingénierie tissulaire devient une approche très attrayante 9,16. D’autres sources cellulaires peuvent être mises en œuvre pour l’assemblage de l’organoïde et stimulées vers la différenciation ténogénique. Un type de cellule pertinent utilisé pour la démonstration dans cette étude est les fibroblastes dermiques 7,17,18. Ces cellules sont facilement accessibles grâce à une procédure de biopsie cutanée, qui est moins invasive que la ponction de la moelle osseuse ou la liposuccion et peut être multipliée assez rapidement en grand nombre en raison de leur bonne capacité de prolifération. En revanche, les types de cellules plus spécialisés, tels que les fibroblastes résidents T/L, sont plus difficiles à isoler et à développer. Par conséquent, les fibroblastes dermiques ont également été utilisés comme point de départ pour les technologies de reprogrammation cellulaire vers des cellules souches embryonnaires pluripotentes induites19. Soumettre les fibroblastes dermiques à des conditions de culture 3D spécifiques et à des signaux de signalisation, tels que le facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGFß3), qui a été signalé comme un régulateur clé de divers processus cellulaires, y compris la formation et le maintien de T/L, peut potentialiser leur différenciation ténogénique in vitro conduisant à l’expression de gènes spécifiques du tendon et au dépôt d’ECM20 typique de T/L, 21. Aéroport
Ici, nous décrivons et démontrons un protocole organoïde en 3 étapes précédemment établi et mis en œuvre (expansion 2D, stimulation 2D et maturation 3D) utilisant des fibroblastes dermiques humains adultes normaux (NHDF) disponibles dans le commerce comme source cellulaire, offrant un modèle précieux pour l’étude de la ténogenèse in vitro 7. Malgré le fait que ce modèle n’est pas équivalent au tissu T/L in vivo, il fournit tout de même un système plus pertinent sur le plan physiologique qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes de différenciation cellulaire, imiter la physiopathologie T/L in vitro et établir des plateformes de médecine personnalisée et de dépistage de médicaments. De plus, à l’avenir, des études pourront évaluer si les organoïdes 3D sont adaptés à l’ingénierie T/L sans échafaudage en augmentant l’optimisation et utilisables pour le développement de constructions mécaniquement robustes à l’échelle qui ressemblent étroitement aux dimensions et aux propriétés structurelles et biophysiques des tissus T/L natifs.

<table><tbody><tr><td>Acide ascorbique&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne&nbsp ; &nbsp ;</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire adhérente de 10 cm</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne.</td><td></td><td></td>CLS430167</tr><tr><td>boîte de Pétri non adhérente de 10 cm&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS430591</tr><tr><td>Cryo-medium</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas&nbsp ; &nbsp ;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Norme de cryomoule&nbsp ;</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Sucrose&nbsp ;</td><td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Allemagne</td><td>A2211</td><td></td></tr><tr><td>DMEM moyen à haute teneur en glucose&nbsp ;</td><td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne&nbsp ;</td><td>DMEM-HA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne&nbsp ; &nbsp ;</td><td>DMEM-LPXA</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Anprotec, Bruckberg, Allemagne&nbsp ;</td><td>AC-SM-0027</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des fibroblastes 2&nbsp ;</td><td>PromoCell, Heidelberg, Allemagne&nbsp ; &nbsp ;</td><td>C-23020</td><td></td></tr><tr><td>H& Kit de coloration E</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé avec caméra haute résolution</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td>Zeiss Axio Observer avec&nbsp ; Acides aminés Axiocam 506</td></tr><tr><td>MEM&nbsp ;</td><td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne&nbsp ; &nbsp ;</td><td>NEAA-B</td><td></td></tr><tr><td>Goupilles métalliques&nbsp ;</td><td>EntoSphinx, Pardubice, République tchèque</td><td>04.31</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes dermiques humains normaux</td><td>PromoCell, Heidelberg, Allemagne&nbsp ;</td><td>C-12302</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne&nbsp ;</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne&nbsp ;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig ; 3&nbsp ;</td><td>R& D Systems, Wiesbaden, Allemagne&nbsp ;</td><td>&nbsp ; 8420-B3</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 % DPBS&nbsp ;</td><td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne&nbsp ;</td><td>&nbsp ; ESSAI-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3d de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des structures fortes et hiérarchisées qui unissent le système musculo-squelettique. Ces tissus ont une matrice extracellulaire (ECM) riche en collagène de type I strictement agencée et des cellules de la lignée T/L principalement positionnées en rangées parallèles. Après une blessure, les T/L nécessitent une longue période de rééducation avec un risque de défaillance élevé et des résultats de réparation souvent insatisfaisants. Malgré les progrès récents de la recherche en biologie T/L, l’un des défis restants est que le domaine T/L ne dispose toujours pas d’un protocole de différenciation standardisé capable de récapituler le processus de formation T/L in vitro. Par exemple, la différenciation osseuse et graisseuse des cellules précurseurs mésenchymateuses ne nécessite qu’une culture cellulaire bidimensionnelle standard (2D) et l’ajout de milieux de stimulation spécifiques. Pour la différenciation en cartilage, une culture tridimensionnelle (3D) de granulés et une supplémentation en TGFß sont nécessaires. Cependant, la différenciation cellulaire en tendon nécessite un modèle de culture 3D très ordonné, qui devrait idéalement être également soumis à une stimulation mécanique dynamique. Nous avons établi un modèle d’organoïde en 3 étapes (expansion, stimulation et maturation) pour former une structure 3D en forme de bâtonnet à partir d’une feuille cellulaire auto-assemblée, qui fournit un microenvironnement naturel avec ses propres facteurs ECM, autocrines et paracrines. Ces organoïdes en forme de bâtonnets ont une architecture cellulaire multicouche au sein d’une ECM riche et peuvent être manipulés assez facilement pour être exposés à des contraintes mécaniques statiques. Ici, nous avons démontré le protocole en 3 étapes en utilisant des fibroblastes dermiques disponibles dans le commerce. Nous avons pu montrer que ce type de cellule forme des organoïdes robustes et abondants en MEC. La procédure décrite peut être optimisée en termes de milieux de culture et optimisée pour la stimulation mécanique axiale dynamique. De la même manière, d’autres sources cellulaires peuvent être testées pour leur potentiel à former des organoïdes T/L et donc à subir une différenciation T/L. En résumé, l’approche éprouvée des organoïdes 3D T/L peut être utilisée comme modèle pour la recherche fondamentale sur les tendons et même pour l’ingénierie T/L sans échafaudage.

Le modèle organoïde 3D T/L a été précédemment établi et démontré ici par la mise en œuvre de NHDF achetés dans le commerce (n = 3, 3 organoïdes par donneur, NHDF ont été utilisés aux passages 5 à 8). Le flux de travail du modèle est résumé dans la figure 1. La figure 2 montre des images représentatives en contraste de phase de la culture NHDF pendant la pré-expansion dans des flacons T-75 (Figure 2A) ainsi qu’au début et après 5 jours de culture dans l’étape d’expansion 2D dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm (Figure 2B). La figure 2C (images représentatives en contraste de phase) montre la confluence des NHDF lors de la stimulation 2D après 14 jours de culture dans les boîtes de culture cellulaire de 10 cm. Par la suite, les feuilles cellulaires ont été détachées manuellement et enroulées simultanément en organoïdes 3D en forme de bâtonnets (au jour 0, la longueur de l’organoïde est d’environ 6 cm, la largeur d’environ 0,4 cm), qui ont été cultivés sous une tension statique de 10 % pendant 14 jours (Figure 3, jour 0 et jour 14, images macroscopiques représentatives). Au 14e jour du processus de maturation 3D, les organoïdes présentaient un aspect blanc scintillant, se contractaient et semblaient plus denses que les organoïdes initiaux. Le poids humide des organoïdes a été mesuré au moment de la formation (jour 0) et à nouveau au jour 14 de l’étape de maturation 3D (Figure 4). Une réduction significative du poids humide a été observée, indiquant une contraction et une réorganisation structurelle de l’ECM au sein des organoïdes pendant la durée de cette étape du protocole. En plus du changement de poids, en raison de la contraction, la longueur de l’organoïde a également diminué (au 14e jour, la longueur de l’organoïde est d’environ 3,5 cm et la largeur est d’environ 0,3 cm). Au cours de ce processus, les goupilles métalliques se sont desserrées et ont dû être refixées ; par conséquent, pendant les 14 jours de maturation 3D, nous recommandons de surveiller fréquemment les organoïdes. Pour évaluer la morphologie des organoïdes, des coupes longitudinales ont été obtenues à partir d’organoïdes NHDF collectés au jour 1 et au jour 14 de l’étape de maturation 3D et soumis à une coloration H&amp;E (Figure 5). Le premier jour, les organoïdes présentaient des couches déconnectées, principalement composées de cellules entourées de faibles quantités d’ECM. De plus, les cellules à l’intérieur des couches d’organoïdes n’étaient pas alignées le long de l’axe longitudinal des organoïdes utilisé comme direction pour la charge de traction statique appliquée. Les noyaux NHDF présentaient une forme ronde de tailles et de formes variables. L’analyse H&amp;E des organoïdes du jour 14 a révélé une augmentation notable du signal éosine, indiquant un dépôt ECM pendant le processus de maturation 3D. À ce moment-là, les organoïdes présentaient des couches fusionnées, avec des zones contenant des cellules alignées. Les cellules étaient souvent en groupes ; Cependant, ils étaient également organisés en rangées de cellules à certains endroits. La majorité des noyaux avaient des tailles similaires et étaient parfois allongés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66047/66047fig1v2.jpg"> Figure 1 : Dessin animé d’un modèle organoïde 3D T/L composé de 3 étapes : expansion 2D, stimulation 2D et maturation 3D. Initialement, les NHDF ont été pré-expansés dans un ballon T-75 jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 70 % à 80 %. Par la suite, des NHDF ont été cultivés à l’aide du milieu à faible teneur en glucose Modified Eagles Medium (DMEM) de Dulbecco dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm pendant 5 jours (expansion 2D). Les cellules ont ensuite été stimulées avec un milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par de l’acide ascorbique pendant 14 jours de culture (stimulation 2D). Ensuite, les NHDF ont été détachés de la boîte adhérente de 10 cm, roulés dans un organoïde en forme de tige 3D, transférés et fixés dans une boîte de culture cellulaire non adhérente de 10 cm remplie d’un milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par de l’acide ascorbique et du facteur de croissance transformant bêta 3 (TGFß3) pendant 14 jours (maturation 3D). Les organoïdes 3D formés peuvent faire l’objet d’une évaluation du poids humide, d’une évaluation histologique, de l’isolement de l’ARN et des protéines et d’autres analyses (p. ex., microscopie électronique à transmission, mesures biomécaniques) à différents moments tels que les jours 0, 1 et 14. Le dessin animé a été généré dans le logiciel BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66047/66047fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66047/66047fig02.jpg"> Figure 2 : Images représentatives en contraste de phase des NHDF pendant les étapes de pré-expansion, d’expansion 2D et de stimulation 2D. (A) NHDF pendant la pré-expansion dans le ballon T-75. (B) NHDF aux jours 1 et 5 de l’étape d’expansion 2D dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm. (C) NHDF aux jours 1 et 14 de l’étape de stimulation 2D dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm. Barres d’échelle : 200 μm. Les images ont été prises avec un microscope inversé équipé d’une caméra haute résolution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66047/66047fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66047/66047fig03.jpg"> Figure 3 : Morphologie grossière des organoïdes 3D du NHDF. Images macroscopiques représentatives des organoïdes NHDF aux jours 0 et 14 de l’étape de maturation 3D. Barre d’échelle : 1 cm. Les images ont été prises avec l’appareil photo d’un téléphone portable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66047/66047fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66047/66047fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse du poids humide des organoïdes 3D NHDF. La mesure du poids humide des organoïdes a été effectuée au jour 0 et au jour 14, à la fin du processus de maturation 3D. Le graphique montre les valeurs moyennes et les écarts-types (NHDF n = 3, 3 organoïdes/donneur au jour 0 et 2 organoïdes/donneur au jour 14 en raison de 1 organoïde/donneur prélevé pour l’histologie au jour 1), chaque point représente des organoïdes individuels tandis que chaque forme colorée représente un donneur individuel différent. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type, et un test t paramétrique non apparié a été utilisé. Différences statistiques : **p ≤0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66047/66047fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66047/66047fig05.jpg"> Figure 5 : Analyse histologique d’organoïdes NHDF 3D. Images représentatives de coupes d’organoïdes NHDF colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&amp;E) au cours du processus de maturation 3D aux jours 1 et 14. Image de droite - images à faible grossissement, image de gauche - vue agrandie avec les indicateurs suivants : flèches jaunes - couches déconnectées ; pointes de flèches jaunes - noyaux de tailles et de formes variables ; flèches noires - couches fusionnées et dépôt ECM ; pointes de flèches noires - rangées de cellules, noyaux de taille et d’allongement similaires ; étoiles noires -cellules en groupes. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66047/66047fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Dans cet article, nous démontrons un modèle organoïde en trois étapes (expansion bidimensionnelle [2D], stimulation 2D, maturation tridimensionnelle [3D]) offrant un outil prometteur pour la recherche fondamentale sur les tendons et une méthode potentielle sans échafaudage pour l’ingénierie tissulaire des tendons.

Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

Nous démontrons un protocole organoïde en trois étapes établi et mis en œuvre en utilisant des fibroblastes dermiques humains normaux disponibles dans le commerce comme source cellulaire. Le modèle organoïde 3D présente plusieurs avantages pour l’ingénierie tissulaire et l’application de la médecine régénérative. Il imite étroitement la composition et l’organisation cellulaires ainsi que les interactions cellule-cellule et cellule-matrice des tissus tendineux.L’approche éprouvée des organoïdes tendon-ligament en 3D peut être utilisée comme modèle pour la recherche fondamentale et appliquée sur les tendons dans les domaines suivants. La ténogenèse in vitro, le mécanisme de la maladie, les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire tendineuse sans échafaudage.

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Une méthode est décrite pour la préparation d'une matrice tridimensionnelle composée de collagène de type I et de fibroblastes humains primaires. Ce gel organotypique constitue un substrat utile pour évaluer la migration cellulaire invasive, car il imite les caractéristiques fondamentales du stroma tissulaire et se prête à de nombreuses formes de microscopie.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

Cette vidéo décrit le protocole détaillé de génération de reconstructions cutanées organotypiques 3D in vitro pour étudier la progression du mélanome. Ce modèle de peau imite à la fois l’architecture et la complexité multicellulaire des organes in vivo.

Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine

Ce protocole vidéo décrit une technique de culture in vitro basée sur cassette pour générer de la peau organotypique humaine à l’aide de kératinocytes épidermiques et de derme humain dévitalisé. Ils imitent la fonction et la physiologie de leurs homologues tissulaires in vivo.

Culture de peau 3D organotypique : une technique de culture in vitro sur cassette pour régénérer l’épiderme humain sur derme acellulaire

Pour créer des structures hautement organisées de tissus complexes, il faut assembler plusieurs types de matériaux et de cellules en un composite intégré.  Cette conception combinatoire intègre des feuilles de cellules stratifiées spécifiques à un organe avec deux matériaux distincts d’origine biologique contenant une base de matrice fibreuse solide, et des cellules endothéliales pour améliorer la formation de nouveaux vaisseaux.

Ingénierie tissulaire: Construction d&#39;un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Ici, nous présentons un système modèle assembloïde pour imiter la diaphonie cellulaire tendineuse entre le tissu central du tendon porteur et un compartiment extrinsèque contenant des populations cellulaires activées par la maladie et la blessure. Comme cas d’utilisation important, nous démontrons comment le système peut être déployé pour sonder l’activation des cellules endothéliales extrinsèques pertinentes pour la maladie.

Ingénierie d’assembloïdes tendineux pour sonder la diaphonie cellulaire dans la maladie et la réparation

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC cultivés dans des hydrogels de fibrine 3D visant à soutenir la maturation des cellules épithéliales thymiques (TEC) et le maintien prolongé, ainsi que la thymopoïèse in vitro.

Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes à partir de cellules épithéliales alvéolaires A549 et de fibroblastes pulmonaires MRC-5 sur un échafaudage hydrogel à matrice extracellulaire, suivie de l’intégration dans des gels de collagène 3D et d’une exposition à une contrainte mécanique à l’aide d’un bioréacteur d’étirement cellulaire pour étudier la mécanobiologie alvéolaire.

Génération d’organoïdes alvéolaires A549/MRC-5 intégrés en collagène 3D à l’aide d’un bioréacteur mécanique à étirement cellulaire

Apprenez à créer un organoïde 3D de type tendon/ligament à partir de fibroblastes dermiques humains. Cette méthode sans support reproduit fidèlement la composition cellulaire et les interactions matricielles des tissus tendineux.

Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains (Vidéo) | JoVE Journal

Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

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