Name: Structuration cellulaire à l’aide de la stratégie d’Archimède magnétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Découvrez une méthode de structuration cellulaire par effet d'Archimède magnétique, sans marquage ni encre, adaptable à tout substrat. Cette technique économique et accessible facilite l'étude de la migration cellulaire et l'assemblage d'organoides.

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Cette étude est soutenue financièrement par le Programme national clé de R&D de Chine (2021YFA1101100), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000971), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (n° 2021FZZX001-42) et le Fonds scientifique de la nuit étoilée de l’Institut d’études avancées de Shanghai de l’Université du Zhejiang (subvention n° 2021). SN-ZJU-SIAS-004).

1. Assemblage des ensembles d’aimants
<ol><li>Assemblez les jeux d’aimants pour les motifs de bandes.<ol><li>Choisissez des aimants rectangulaires plats, comme illustré à la figure 1A. Les dimensions des aimants rectangulaires utilisés pour cette démonstration sont de 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (épaisseur × hauteur × longueur) (voir tableau des matériaux). L’épaisseur des aimants détermine les espaces entre les bandes cellulaires.</li>
		<li>Découpez des plaques de silicone de 2 mm d’épaisseur (voir tableau des matériaux) en rectangles de 2 mm × 8 mm × 30 mm. Assurez-vous que les deux dernières dimensions de ces plaques de silicone sont légèrement inférieures à celles des aimants rectangulaires mentionnés ci-dessus afin d’optimiser l’assemblage. L’épaisseur des plaques de silicone détermine la largeur des bandes cellulaires.</li>
		<li>Assemblez les aimants rectangulaires et les plaques de silicone couche par couche, comme illustré à la figure 1A. Chaque ensemble d’aimants se compose de 4 aimants et de 3 plaques en silicone. Assurez-vous que les pôles de chaque aimant adjacent sont opposés afin que les ensembles d’aimants puissent s’aligner automatiquement en raison de la force d’attraction intrinsèque.</li>
		<li>Stérilisez les aimants avant utilisation. REMARQUE : Il est recommandé de laver les ensembles d’aimants à l’eau pure, puis de les immerger dans de l’éthanol à 75% pendant 10 minutes. Les dimensions globales de ces ensembles d’aimants sont de 12 mm × 10 mm × 35 mm, conçus pour s’adapter aux plaques de culture cellulaire standard à 6 puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Assembler les jeux d’aimants pour les motifs de réseau de points<ol><li>Choisissez des aimants cylindriques miniatures, comme illustré à la figure 1B. Les dimensions des aimants cylindriques utilisés pour cette démonstration sont de Φ1,5 mm × 10 mm (diamètre × hauteur), magnétisés dans le sens axial.</li>
		<li>Assemblez les aimants cylindriques comme indiqué à la Figure 1B. Assurez-vous que chaque ensemble d’aimants se compose de 36 aimants cylindriques disposés dans une grille de 6 × 6. Assurez-vous également que les pôles de chaque aimant adjacent sont opposés pour permettre aux ensembles d’aimants de s’aligner automatiquement en raison de la force d’attraction intrinsèque.</li>
		<li>Stérilisez les aimants avant utilisation, en suivant la même procédure qu’à l’étape 1.1.4. Les dimensions globales de ces ensembles d’aimants sont de 9 mm × 10 mm × 9 mm, conçus pour s’adapter aux plaques de culture cellulaire standard à 6 puits.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Motif de cellules sur des lames de verre
<ol><li>Préparez le dispositif de culture cellulaire.<ol><li>Utilisez des plaques en silicone de 2 mm d’épaisseur pour créer des moules en silicone. À l’aide d’un poinçonneur, créez un trou rectangulaire de 1 cm × 1 cm dans la plaque. Coupez la plaque de silicone autour du trou pour fabriquer un moule rond (diamètre = 25 mm) avec le trou au centre, comme illustré à la figure 1C.</li>
		<li>Nettoyez soigneusement les moules en silicone à l’aide d’un nettoyeur à ultrasons. Stérilisez les moules en les lavant à l’eau pure pendant 10 minutes, puis en remplaçant l’eau par de l’éthanol à 75 % pendant 10 minutes supplémentaires. Enfin, séchez les moules dans une boîte de stérilisation à 65 °C pendant 60 min.</li>
		<li>Fixez le moule en silicone stérilisé à une lame de cellule en verre ronde de Φ25 mm et appuyez doucement dessus pour que le silicone adhère au verre, comme illustré à la figure 1C. Le dispositif de culture cellulaire résultant aura un dessous en verre et une cavité de culture de 200 μL. Les dimensions de l’appareil sont de Φ25 mm × 2,15 mm, ce qui le rend adapté aux plaques de culture cellulaire standard à 6 puits. REMARQUE : Le dispositif de culture cellulaire décrit ci-dessus peut être remplacé par d’autres boîtes de Pétri dont la face inférieure est inférieure à 0,5 mm, comme les boîtes confocales.</li>
		<li>Placez les jeux d’aimants sur une plaque à 6 puits. Les pinces à épiler non magnétiques sont recommandées pour faciliter l’utilisation. REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles à partir de ce moment jusqu’à l’observation des modèles cellulaires.</li>
		<li>Positionnez le dispositif de culture cellulaire au-dessus de l’aimant placé dans le puits de la plaque à 6 puits. Assurez-vous que le dispositif de culture cellulaire est placé horizontalement et que le dessous est en contact étroit avec l’ensemble d’aimants.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le milieu de culture cellulaire contenant du Gd-DTPA<ol><li>Préparer l’injection de Gd-DTPA disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), généralement avec une concentration de 500 mM. Diluer l’injection en ajoutant 30 μL d’injection de Gd-DTPA à 470 μL de milieu de culture cellulaire complet pour atteindre une concentration cible de 30 mM. REMARQUE : En fonction de la réglementation locale et de la disponibilité, d’autres agents de contraste à base de gadolinium (GBCA) ayant la même concentration cible peuvent donner des résultats similaires11.</li>
	</ol></li>
	<li>Créez les modèles de cellules.<ol><li>Récoltez des cellules pour la création de motifs. Dans cette démonstration, des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC, voir le tableau des matériaux) ont été utilisées pour la structuration (Figure 2). Centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g (à température ambiante) pour les retirer de la suspension et les remettre en suspension dans le milieu contenant du Gd-DTPA. Comptez la densité cellulaire.</li>
		<li>Ajustez la densité cellulaire à environ ~2 × 105 cellules/mL avec un milieu contenant du Gd-DTPA. Mélangez délicatement la suspension cellulaire et ajoutez 200 μL dans la cavité de chaque moule de culture cellulaire pour créer une surface liquide pleine à ras bord.</li>
		<li>Transférez délicatement la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et incubez pendant 3 à 6 h jusqu’à ce que les cellules adhèrent bien au substrat. Évitez de claquer la porte de l’incubateur pour éviter toute interférence avec l’assemblage des motifs cellulaires. Pour les cellules à faible taux d’adhérence, le traitement de nuit avec des GBCA est généralement sûr12.</li>
		<li>La structuration cellulaire est considérée comme complète lorsque les cellules adhèrent au fond de la cavité du dispositif de culture cellulaire. Remplacer le milieu contenant du Gd-DTPA par un milieu de culture complet.</li>
		<li>Retirez le dispositif de culture cellulaire de l’ensemble d’aimants. On peut soit observer immédiatement le modèle cellulaire, soit transférer l’appareil dans une nouvelle plaque de culture pour une culture ultérieure.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Structuration de co-culture par aimant latéral : fabrication du gabarit mobile
REMARQUE : La procédure suivante est présentée pour tirer parti de la structuration cellulaire basée sur Mag-Arch et explorer la possibilité d’autres applications.
<ol><li>Préparez l’appareil pour la création de motifs de cellules à rayures en suivant les étapes 1 et 2. Cependant, réduisez la densité cellulaire à 1 × 105 cellules/ml et remplacez les plaques de silicone qui séparent les aimants par des plaques plus fines, ce qui rend chaque motif de cellule à rayures plus mince. REMARQUE : Cela fournit suffisamment de surface pour poser plusieurs cellules dans des motifs de rayures. À titre de référence, nous vous suggérons d’utiliser des plaques en silicone de 1 mm au lieu de 2 mm pour séparer les aimants.</li>
	<li>Modélisez le premier type de cellules comme illustré aux étapes 2.2-2.3. Cette étape nécessite également 3 à 6 h pour la fixation des cellules. REMARQUE : Pour distinguer les différents types de cellules dans le système de co-culture, les utilisateurs peuvent étiqueter les cellules avec des colorants fluorescents tels que DiI, DiD ou des trackers cellulaires (CMTPX, CMFDA, CMAC, etc.) avant la structuration. Par exemple, pour la coloration DiI et DiD, ajouter 1 μL de la solution mère (10 mM) (voir le tableau des matériaux) pour 1 mL de milieu exempt de FBS et bien mélanger pour obtenir une solution de travail. Remplacez le milieu de culture par la solution de travail pour couvrir les cellules adhérentes. Après avoir incubé pendant 30 minutes et lavé trois fois avec du PBS, procédez à la récolte des cellules.</li>
	<li>Après avoir modelé le premier type de cellules, déplacez le dispositif de culture cellulaire de 1 mm des aimants situés en dessous vers la droite, comme illustré à la figure 3Aii.</li>
	<li>Lavez délicatement les lames de verre avec 200 μL de PBS deux fois. Évitez de laisser sécher les lames.</li>
	<li>Modélisez le deuxième type de cellules de la même manière que celle illustrée aux étapes 2.2 et 2.3.</li>
	<li>Déplacez le dispositif de culture cellulaire de 1 mm des aimants situés ci-dessous vers la droite, comme illustré à la figure 3Aiii, et lavez à nouveau les lames de verre avec 200 μL de PBS. Modélisez le troisième type de cellules de la même manière qu’illustré aux étapes 2.2 et 2.3.</li>
	<li>Après avoir modelé tous les types de cellules, lavez délicatement les lames de verre avec 200 μL de PBS deux fois et remplacez-les par un milieu de culture cellulaire complet.</li>
	<li>Retirez le dispositif de culture cellulaire de l’ensemble d’aimants. On peut ensuite observer le modèle cellulaire ou transférer l’appareil sur une nouvelle plaque de culture pour une culture ultérieure.</li>
</ol>4. Structuration de la co-culture en ajustant la concentration de Gd-DTPA
REMARQUE : Les GBCA n’affectent pas de manière significative l’adhésion cellulaire ou la croissance ultérieure à des concentrations de travail (≤75 mM). De plus, les modèles cellulaires sont influencés par la concentration de Gd-DTPA : des concentrations plus élevées entraînent des motifs cellulaires plus petits/plus minces. Ainsi, il est possible de créer des systèmes de co-culture en ajustant simplement la concentration en Gd-DTPA. Cet exemple illustre la mise en forme de réseaux circulaires concentriques.
<ol><li>Modélisez le premier type de cellules comme illustré aux étapes 2.2 à 2.3 à l’aide d’aimants cylindriques miniatures de l’étape 1.2. Étiquetez les cellules avec des colorants fluorescents tels que DiI, DiD ou des trackers cellulaires (voir l’étape 3) avant de les récolter pour distinguer les différents types de cellules dans le système de co-culture. REMARQUE : On aura besoin d’une concentration plus élevée de Gd-DTPA (50 mM au lieu de 30 mM) et d’une densité cellulaire plus faible, environ 1 × 105 cellules/mL.</li>
	<li>Après avoir modelé le premier réseau de cellules, lavez délicatement les lames de verre avec 200 μL de PBS deux fois. Évitez de laisser sécher les lames.</li>
	<li>Modélisez le deuxième type de cellules en suivant la même procédure que précédemment. Gardez les lames de verre relativement immobiles sur les aimants pour éviter toute luxation. Il est recommandé de fixer une plaque en silicone avec un creux qui s’adapte aux jeux d’aimants sur la surface inférieure de la lame de verre. REMARQUE : Ici, on aura besoin d’une concentration plus faible de Gd-DTPA (20 mM au lieu de 30 mM) de sorte que les deuxièmes modèles cellulaires devraient être plus grands que les premiers, comme illustré à la figure 3B.</li>
	<li>Après avoir modelé tous les types de cellules, lavez délicatement les lames de verre avec 200 μL de PBS deux fois et remplacez le milieu par un milieu de culture cellulaire complet.</li>
	<li>Retirez le dispositif de culture cellulaire de l’ensemble d’aimants. On peut ensuite observer le modèle cellulaire ou transférer l’appareil sur une nouvelle plaque de culture pour une culture ultérieure.</li>
</ol>5. Structuration cellulaire dans la puce microfluidique
REMARQUE : Il a été démontré que la méthode basée sur Mag-Arch fonctionne dans des chambres étroites fermées dans notre étude précédente8. Voici un exemple de modélisation de réseaux de points dans un canal microfluidique.
<ol><li>Fabrication de la puce microfluide<ol><li>Personnalisez des moules en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 40 mm × 75 mm × 20 mm (voir le tableau des matériaux) contenant une cavité rectangulaire de 24 mm × 50 mm × 8 mm, comme illustré à la figure 4A.</li>
		<li>Aplatir une plaque de silicone de 0,5 mm d’épaisseur. Découpez les plaques de silicone en fonction de la forme du canal de fluide, qui a une cavité rectangulaire de 15 mm × 20 mm × 0,5 mm avec des zones tampons triangulaires à l’entrée et à la sortie, comme illustré à la figure 4A,B.</li>
		<li>Personnalisez des plaques de verre rectangulaires de 40 mm × 75 mm. Nettoyez les plaques de verre avec du plasma d’air pendant 30 s.</li>
		<li>Immédiatement après le nettoyage au plasma à l’air, couvrez les plaques de verre avec 0,5 mL d’un tampon anti-adhérence disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et laissez-les sécher à l’air libre. Lavez les plaques de verre une fois avec de l’éthanol et laissez-les sécher à l’air libre.</li>
		<li>Fixez solidement une plaque de silicone préparée à l’étape 5.1.2 au milieu d’une plaque de verre, comme illustré à la figure 4A.</li>
		<li>Préparer le prépolymère de polydiméthylsiloxane (PDMS) conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour chaque puce PDMS, peser 10 g du constituant de base et 1 g de l’agent raffermissant dans un tube à centrifuger de 50 ml.</li>
		<li>Mélangez soigneusement les agents à l’aide d’une tige d’agitation en verre jusqu’à ce que les petites bulles soient uniformément réparties dans le colloïde. Le mélange prend 5 à 10 minutes, selon le volume colloïdal. Centrifuger le prépolymère colloïdal pendant 1 min à 500 x g (à température ambiante) pour éliminer les bulles.</li>
		<li>Versez lentement ~10 mL du prépolymère dans la cavité pour remplir le moule en PTFE.</li>
		<li>Placez soigneusement le moule dans un réservoir sous vide et maintenez-le à l’horizontale pour éviter que le prépolymère ne s’écoule.</li>
		<li>Éliminez les bulles d’air résiduelles du prépolymère à l’aide d’une pompe à vide. L’aspiration prend 120-180 min.</li>
		<li>Si nécessaire, versez plus de prépolymère pour remplir davantage la cavité du moule. Passez encore 60 minutes sous vide.</li>
		<li>Couvrez soigneusement le moule en PTFE avec la plaque de verre, avec le côté silice face à la cavité, comme illustré à la figure 4Bi.</li>
		<li>Assurez-vous que toutes les bulles sont éliminées. Transférez le moule dans une étuve de séchage à 60 °C pour que le prépolymère se solidifie pendant la nuit.</li>
		<li>Démoulez le four. Après refroidissement, démoulez soigneusement le couvercle PDMS solidifié. Créez une entrée et une sortie avec une perforatrice aiguilletée de Φ1 mm.</li>
		<li>Lavez le couvercle du PDMS et les glissières du couvercle de 24 mm × 50 mm conformément à l’étape 2.1.2. REMARQUE : Procédez aux étapes suivantes dans des conditions stériles.</li>
		<li>Fixez un couvercle PDMS et une lame de couvercle pour créer une puce microfluide contenant un canal d’écoulement d’environ ~500 μm de hauteur. La face inférieure doit être constituée d’une lame de couvercle en verre de ~0,15 mm pour permettre la structuration des cellules avec la stratégie basée sur Mag-Arch.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblez les adaptateurs stériles disponibles dans le commerce à l’entrée et à la sortie de la puce microfluide8.</li>
	<li>Préparer un tampon d’enrobage de gélatine à 2 % (p/v, dissous dans du PBS). Stériliser le tampon à l’autoclave.</li>
	<li>Injectez le tampon d’enrobage de gélatine dans la puce via l’adaptateur d’entrée à l’aide d’une seringue de 1 ml. Si des bulles apparaissent, rincez-les avec un tampon de revêtement supplémentaire.</li>
	<li>Placez la puce dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm. Ajouter 1 mL de PBS autour du fond du plat pour éviter qu’il ne sèche. Transférez la boîte dans un incubateur de culture cellulaire. L’enrobage prend 30 min.</li>
	<li>Rincer le tampon de revêtement avec 2 mL de milieu contenu en Gd (30 mM) par l’entrée.</li>
	<li>Injecter doucement 1 mL de suspension cellulaire contenant 30 mM de Gd-DTPA à l’aide d’une seringue de 1 mL.</li>
	<li>Modélisez les cellules comme illustré aux étapes 2.2-2.3 à l’aide d’aimants cylindriques miniatures de l’étape 1.2. REMARQUE : Cependant, il est recommandé de fixer une plaque de silicone avec un creux qui s’adapte aux jeux d’aimants sur la surface inférieure de la lame de verre, comme le montre la figure 4Ci.</li>
	<li>Après le modelage, rafraîchir délicatement le milieu contenu dans le Gd-DTPA avec 1 mL de milieu complet en rinçant avec une seringue de 1 mL. REMARQUE : Le processus de structuration cellulaire en microfluidique, des étapes 5.7 à 5.9, prend environ 180 minutes, ce qui est similaire à la structuration cellulaire sur des lames de verre standard.</li>
	<li>Quantifier les modèles au microscope. Si nécessaire, connectez la puce microfluide à un dispositif de culture circulant pour une culture ultérieure. REMARQUE : D’après notre expérience, les cellules sont capables de croître pendant au moins 72 h lorsqu’elles sont soutenues par un simple dispositif basé sur une micropompe, qui fournit à la microfluidique un flux continu de milieu de culture frais dans un incubateur cellulaire8.</li>
</ol>

Une nouvelle méthode de structuration de cellules d’Archimède magnétiques sans encre et sans marquage

<ol><li>Christian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+adhesion+using+hydrogel+patterning+techniques+for+applications+in+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy.</a> J Vis Exp. 179, e63121(2022).</li>
<li>Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+human+trophoblast+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Investigation of human trophoblast invasion in vitro.</a> Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).</li>
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<li>Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dive+into+the+bath%3A+Embedded+3D+bioprinting+of+freeform+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models.</a> Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).</li>
<li>Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stencil+micropatterning+of+human+pluripotent+stem+cells+for+probing+spatial+organization+of+differentiation+fates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates.</a> J Vis Exp. 112, e54097(2016).</li>
<li>Joddar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+approaches+for+cardiac+organoid+formation+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization.</a> Transl Res. 250, 46-67 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La structuration cellulaire basée sur Mag-Arch offre une solution conviviale pour la plupart des laboratoires biomédicaux. Cette méthode progresse parallèlement aux caractères sans encre, sans étiquette, indépendant du substrat et à la capacité de motifs à haut débit 8,13. Pour la mise en forme de cellules de type unique, il modélise les cellules en une seule étape. La procédure se termine simplement par le rafraîchissement des milieux de culture.
Des études antérieures ont utilisé des particules magnétiques pour marquer les cellules et les attirer avec des aimants afin de former des motifs précis14,15. Cependant, la présence de particules magnétiques sur les cellules a soulevé des inquiétudes quant aux effets potentiels sur les comportements cellulaires. La structuration cellulaire basée sur Mag-Arch adopte la stratégie inverse en transformant les liquides extracellulaires en paramagnétiques, plutôt qu’en cellules. Cette stratégie facilite grandement l’élimination des réactifs paramagnétiques supplémentaires en rafraîchissant le milieu de culture. Des études ont généré des sphères cellulaires et des réseaux de points avec des motifs cellulaires basés sur Mag-Arch11,16. Par rapport aux études existantes basées sur Mag-Arch, les méthodes présentées par ce protocole permettent de personnaliser librement la forme des motifs. De plus, le protocole présente des stratégies pour fabriquer des systèmes de co-culture. Il a également été prouvé qu’il fonctionne à l’intérieur de chambres de culture cellulaires étroites fermées, comme nous l’avons testé en microfluidique.
Plutôt que des méthodes parallèles, qui nécessitent un équipement de bio-impression professionnel17, des modèles personnalisés 18 ou une modification de surface d’un complexe19, la méthode basée sur Mag-Arch ne nécessite que deux nécessités : des aimants et des GBCA. La surface du motif magnétique détermine le motif de cellule de manière inverse. Plusieurs motifs de rayures et de tableaux de points ont été démontrés comme étant de base. Les utilisateurs peuvent générer des motifs à leur guise avec différentes formes d’ensembles d’aimants, qui sont abondamment disponibles dans le commerce. Pour obtenir un résultat idéal, il est recommandé d’adopter des aimants qui fournissent une force magnétique suffisante. Dans notre pratique, nous avons adopté des aimants néodyme-fer-bore N52, dont la rémanence était supérieure à 1430 mT et le magnétisme de surface supérieur à 100 mT sur les pôles. Pour les GBCA, le Gd-DTPA a été adopté parce qu’il est stable dans des conditions physiologiques et disponible à moindre coût dans la plupart des pays et des régions. D’autres ACGB pourraient être adoptées autrement. Les GBCA macrocycliques non ioniques, tels que le gadobutrol et le gadotéridol, pourraient être un meilleur choix pour une cytotoxicité plus faible lors de la structuration de cellules vulnérables pour un traitement à long terme11,12.
La limitation de la structuration cellulaire basée sur Mag-Arch réside principalement dans la zone de travail du champ magnétique généré par les aimants. En suivant la formule de l’inverse du carré, le champ magnétique diminue fortement avec la distance8. En conséquence, la méthode Mag-Arch ne parvient pas à assembler des motifs cellulaires idéaux sur des boîtes ou des plaques de culture cellulaire en polystyrène général, dont le fond est supérieur à 1 mm d’épaisseur. Ainsi, le protocole doit fonctionner sur des surfaces de culture cellulaire plus fines, telles que des lames de verre ou des boîtes de culture cellulaire confocale. Lors de la structuration à l’intérieur de la microfluidique, il est également nécessaire que les glissières inférieures de la microfluidique soient plus fines que 0,5 mm. Pour la mise en place de systèmes de co-culture, la méthode peut prendre du temps, car chaque type de cellule supplémentaire augmente le temps de fixation des cellules de 3 à 6 heures.
Dans l’ensemble, ce protocole offre un moyen simplifié pour la structuration cellulaire, qui pourrait être reproduite dans la plupart des laboratoires sans aucun équipement spécial. Les utilisateurs peuvent l’adopter comme un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires, imiter les microenvironnements multicellulaires ou tester l’affinité cellulaire des biomatériaux8.

La structuration cellulaire est en train de devenir une technologie intuitive et puissante pour les études in vitro 1. En manipulant les positions des cellules dans les plaques de culture, il fournit des solutions pour une variété d’expériences, y compris la migration cellulaire2, la co-culture multicellulaire biomimétique3, l’assemblage d’organoïdes4, les études de biomatériaux5, etc. Dans la plupart des situations, une méthode sans encre et sans marquage est préférée pour la structuration cellulaire, car elle offre une facilité d’utilisation et une viabilité cellulaire élevée pour les investigations ultérieures.
L’effet Mag-Arch est un phénomène physique dans lequel les objets diamagnétiques dans les liquides paramagnétiques ont tendance à se déplacer vers des régions avec de faibles champs magnétiques6. Les cellules vivantes sont naturellement diamagnétiques, tandis que les milieux de culture cellulaire peuvent être rendus paramagnétiques en ajoutant des éléments paramagnétiques solubles, tels que le gadopentétate diméglumine (Gd-DTPA), couramment utilisé par voie intraveineuse en imagerie par résonance magnétique nucléaire comme agent de contraste7. Par conséquent, on s’attend à ce que les cellules soient repoussées par le milieu paramagnétique environnant et se déplacent vers des régions où les champs magnétiques sont plus faibles8. Un champ magnétique structuré peut être facilement généré à l’aide d’un ensemble d’aimants en néodyme. Idéalement, les motifs cellulaires sont assemblés en opposition aux motifs magnétiques. Techniquement, il s’agit d’une méthode sans marquage car le seul réactif supplémentaire, le Gd-DTPA, reste dans l’environnement extracellulaire et ne se lie pas aux cellules. Ainsi, les influences potentielles sur la culture cellulaire ultérieure peuvent être facilement évitées en remplaçant le milieu de culture. Par rapport à d’autres méthodes 1,3,9,10, la stratégie basée sur Mag-Arch ne nécessite pas de composants bio-encre ou l’application de particules spécifiques pour marquer positivement les cellules. De plus, il a été démontré qu’il fonctionne sur plusieurs substrats pour l’adhésion cellulaire et qu’il est capable de structurer des cellules à haut débit4.
Cet article présente un protocole détaillé pour la structuration cellulaire à l’aide de la méthode basée sur Mag-Arch, couvrant tout, de la fabrication du dispositif à l’ajustement du motif cellulaire. En plus des modèles que nous avons démontrés, les utilisateurs peuvent facilement créer divers modèles de cellules à l’aide d’aimants et d’une solution Gd-DTPA. De plus, des protocoles pour l’assemblage de modèles de co-culture complexes et la manipulation de cellules dans des puces microfluidiques fermées sont également fournis.

<table><tbody><tr><td>A2780 Cellules cancéreuses de l’ovaire</td><td>Procell</td><td>CL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire (DMEM, haute teneur en glucose)</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture</td><td>Citotest Scientific</td><td>80340-3610</td><td>Pour la fabrication de microfluidique. Dimension : 24 mm & temps ; DiD</td></tr><tr><td></td><td>MedChemExpress (MCE) de 50 mm&nbsp ;</td><td>HY-D1028</td><td>Pour le marquage de cellules avec fluorescence rouge (Ex : 640 nm)</td></tr><tr><td>DiI</td><td>MedChemExpress (MCE)&nbsp ;</td><td>HY-D0083&nbsp ;</td><td>Pour le marquage des cellules avec une fluorescence orange (Ex : 550 nm)</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Biochannel</td><td>BC-SE-FBS07</td><td></td></tr><tr><td>Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA)</td><td>Beijing Beilu Pharmaceutical&nbsp ;</td><td></td><td></td>H10860002</tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900863</td><td></td></tr><tr><td>Lames de cellule en verre</td><td>Citotest Scientific</td><td>80346-2510</td><td>Diamètre : 25 mm ; épaisseur : 0,19-0,22 mm</td></tr><tr><td>Plaques de verre</td><td>Quincaillerie</td><td></td> PURESHI <td>Pour la fabrication de microfluidique. Dimension : 40 mm & fois ; </td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs)</td> <td>de</td> 75 mmServicebio <td>STCC12103G-1</td><td></td></tr><tr><td>Aimants néodyme-fer-bore (N52)</td><td>Lalaci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Revêtement de plaque de verre non toxique (Gel Slick Solution)</td><td>Lonza</td><td>1049286</td><td>Pour faciliter le démoulage lors de la fabrication de</td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate microfluidique (PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4200</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>SANHOPTT</td><td>PT-2S</td><td></td></tr><tr><td>Kit polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>DOWSIL</td><td>SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Pour la fabrication de moules microfluidiques</td></tr><tr><td>Moule en polytétrafluoroéthylène (PFTE)</td><td>Quincaillerie</td><td></td> PURESHI <td>Personnalisé en ligne, pour la fabrication de microfluidique</td></tr><tr><td>Plaque de silicium</td><td>Quincaillerie</td><td></td><td></td>PURESHI</tr><tr><td>Muscle lisse Cellules (SMC)</td><td>Procell</td><td>CL-0517</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>Sapeen</td><td>CSA-02</td><td></td></tr></tbody></table>

structuration cellulaire à l’aide de la stratégie d’archimède magnétique

Cell Patterning Using Magnetic-Archimedes Strategy

La structuration cellulaire, qui permet un contrôle précis du positionnement des cellules, présente un avantage unique dans l’étude du comportement cellulaire. Dans ce protocole, une stratégie de structuration cellulaire basée sur l’effet d’Archimède magnétique (Mag-Arch) est introduite. Cette approche permet un contrôle précis de la distribution des cellules sans utiliser d’encre ou de particules de marquage. En introduisant un réactif paramagnétique pour améliorer la susceptibilité magnétique du milieu de culture cellulaire, les cellules sont repoussées par des aimants et s’organisent selon un motif complémentaire aux ensembles d’aimants positionnés sous le substrat microfluidique.
Dans cet article, des procédures détaillées pour la structuration cellulaire à l’aide de la stratégie basée sur Mag-Arch sont fournies. Des méthodes de structuration de types unicellulaires ainsi que de types cellulaires multiples pour des expériences de co-culture sont proposées. De plus, des instructions complètes pour la fabrication de dispositifs microfluidiques contenant des canaux pour la structuration des cellules sont fournies. La réalisation de cette fonctionnalité à l’aide de méthodes parallèles est difficile, mais peut être réalisée de manière simplifiée et rentable. L’utilisation de la structuration cellulaire basée sur Mag-Arch dote les chercheurs d’un outil puissant pour la recherche in vitro .

Des aimants rectangulaires (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) et cylindriques (Φ1,5 m × 10 mm) ont été sélectionnés pour créer des motifs cellulaires à titre de démonstration. Les utilisateurs ont la possibilité de modifier la taille et la forme des aimants ou de les assembler différemment pour créer divers motifs cellulaires. Dans les figures 1A, B, les aimants ont été assemblés, les pôles magnétiques étant représentés en bleu (sud) et en rouge (nord) pour plus de clarté. Dans cette configuration, les aimants s’attirent latéralement et s’alignent, comme illustré à la figure 2. La figure 1C, D illustre la structure du dispositif de culture cellulaire et la procédure de structuration cellulaire.
La figure 2 montre des modèles de cellules de type unique. Des HUVEC marqués GFP ont été utilisés pour l’observation au microscope à fluorescence. Les cellules ont été organisées en bandes et en réseaux de points à l’aide d’ensembles d’aimants correspondants. Pour les HUVEC, qui adhèrent rapidement aux lames de verre (en 120-180 min), l’ensemble de la procédure a été réalisé en 4 h. En suivant le protocole, on a obtenu des motifs avec des bords bien définis et une grande uniformité. Pour déterminer la viabilité, les cellules ont été traitées avec du Gd-DTPA pendant 12 h, ce qui est beaucoup plus long que 3 à 6 h à l’étape 2. Cependant, la coloration vivante/morte et le test CCK8 8n’ont montré aucune diminution significative de la viabilité cellulaire. Une concentration relativement élevée de Gd-DTPA (50 mM) induit une différence statistique, tout en préservant un taux de vie de 90,76 % ± 1,78 % (Figure supplémentaire 1).
En s’appuyant sur le protocole de structuration cellulaire monotype, des exemples de structuration cellulaire multitype ont été fournis pour des applications potentielles de co-culture. Dans ce scénario, des HUVEC, des cellules cancéreuses de l’ovaire A2780 et des cellules musculaires lisses (SMC) ont été utilisées. Pour les distinguer, les cellules ont été marquées avec GFP, DiD et DiI avant d’être structurées. En suivant l’étape 3, un motif de cellules tripartites de bandes côte à côte a été généré (Figure 3A). À l’inverse, l’étape 4 a été utilisée pour créer des réseaux de points concentriques en ajustant la concentration de Gd-DTPA (Figure 3B). La première couche de cellules a été colorée avec DiI (rouge) et modelée avec 50 mM de Gd-DTPA, tandis que la deuxième couche de cellules a été marquée avec GFP (vert) et modelée avec 25 mM de Gd-DTPA. Par conséquent, la taille des points de la première couche était plus petite, entourée concentriquement par la deuxième couche de cellules à motifs de points. Différents types de cellules présentaient des taux de fixation et d’étalement variables, les HUVEC se fixant et se propageant rapidement, les A2780 se fixant rapidement mais se propageant plus lentement, et les SMC se fixant et se propageant relativement lentement. Ces résultats ont démontré que divers types de cellules pouvaient former des modèles cellulaires en 3 h et être utilisés dans des expériences de co-culture.
De plus, il a été démontré que la structuration cellulaire à l’aide d’un champ magnétique était compatible avec des dispositifs de culture étroits fermés, tels que des puces microfluidiques. À l’étape 5, des puces microfluidiques ont été fabriquées et des réseaux de points ont été générés à l’intérieur de celles-ci (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66063/66063fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration et schéma de principe de la structuration cellulaire basée sur l’arc magnétique. (A) Assemblage d’ensembles d’aimants pour la création de motifs de cellules à bandes. (B) Assemblage d’ensembles d’aimants pour la génération de motifs de cellules à réseau de points. (C) Mise en place du dispositif de culture cellulaire. (D) Procédure étape par étape pour la structuration des cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66063/66063fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66063/66063fig02.jpg"> Figure 2 : Assemblage d’appareils et structuration de HUVEC en bandes et en réseaux de points. (A) Ensembles d’aimants confinés dans des dispositifs de culture cellulaire (i) et placés dans une plaque de culture cellulaire (ii). (B) et (C) Ensembles d’aimants et les modèles de cellules correspondants. Les cellules ont été marquées avec une protéine fluorescente verte (GFP) pour visualiser le modèle cellulaire. Barres d’échelle = 1,5 mm ; médaillons = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66063/66063fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66063/66063fig03.jpg"> Figure 3 : Structuration des systèmes de co-culture avec une stratégie étape par étape. (A) Structuration de la co-culture à l’aide d’un aimant latéral (i-iii). Les cellules ont été marquées avec GFP (vert), DiD (bleu) et DiI (rouge) pour distinguer différents types de cellules. Barres d’échelle = 1 mm. (B) Structuration de co-culture obtenue en ajustant la concentration de Gd-DTPA ; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. Barres d’échelle = 1,5 mm ; encarts = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66063/66063fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66063/66063fig04.jpg"> Figure 4 : Structuration cellulaire dans une chambre microfluidique. (A) Schéma de principe du moule microfluidique. (B) Fabrication de microfluidique à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) (i,ii). (C) Structuration cellulaire à l’intérieur du dispositif microfluidique (i,ii) et résultat représentatif montrant des motifs cellulaires à réseau de points (iii). Les cellules ont été marquées avec une protéine fluorescente verte (GFP). Barre d’échelle = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66063/66063fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Influence du Gd-DTPA sur la viabilité cellulaire. Les HUVEC ont été traités avec des concentrations variables de Gd-DTPA pendant 12 h, puis soumis à une coloration vivante/morte ou à un test CCK-8. (A) Coloration vivante ou morte des HUVEC. Barres d’échelle = 200 μm. (B) Histogramme illustrant les résultats de coloration en direct/mort. (C) Histogramme montrant les résultats de l’analyse CCK-8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66063/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit une méthode de structuration cellulaire à haut débit sans encre, sans marquage, indépendante du substrat, basée sur l’effet Archimède magnétique.

Structuration cellulaire à l’aide de la stratégie d’Archimède magnétique

Cell patterning, allowing precise control of cell positioning, presents a unique advantage in the study of cell behavior. In this protocol, a cell ...

La structuration cellulaire est une technologie intuitive et puissante pour les études in vitro. Notre recherche vise à présenter une méthode de modèle cellulaire polyvalente, conviviale et peu coûteuse, qui pourrait être reproduite dans la plupart des laboratoires biomédicaux. Comparé à d’autres méthodes, notre protocole ne nécessite pas de compétences et d’équipements spécialisés.De plus, il progresse parallèlement aux caractères sans encre, sans étiquette, indépendant du substrat et à la capacité de création de motifs à haut débit. Le protocole ne nécessite que deux nécessités : les aimants et les agents de contraste à base de gadolinium, qui sont tous deux faciles à obtenir à bas prix. La méthode du motif cellulaire basé sur le magnétisme fournit des solutions pratiques pour la première étape d’une variété d’expériences, y compris la migration cellulaire, la co-culture multicellulaire biomimétique, l’assemblage d’organoïdes, les études de biomatériaux, etc.

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Découvrez une méthode de structuration cellulaire par effet d'Archimède magnétique, sans marquage ni encre, adaptable à tout substrat. Cette technique économique et accessible facilite l'étude de la migration cellulaire et l'assemblage d'organoides.

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