Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9

Nos recherches portent sur la mort cellulaire du programme mammifère, en étudiant plus particulièrement l’équilibre entre l’apoptose et la nécroptose dans le contexte de l’hyperglycémie. Plus récemment, il a été démontré que la protéine de mort cellulaire RIP1 kinase module l’expression des gènes pendant la nécroptose. Notre défi expérimental actuel consiste à manipuler génétiquement les cellules immunitaires qui se développent en suspension, en particulier en éliminant le gène de la kinase RIP1 à l’aide de CRISPR-Cas9.

Notre protocole offre deux avantages distincts. Il améliore les méthodes de transfection pour les cellules immunitaires qui se développent en suspension en utilisant le lentivirus, et il élimine le besoin de clonage de cellule unique pendant le processus de création d’un knockout génétique à l’aide de CRISPR-Cas9, Nos résultats ont ouvert la voie à l’étude du rôle de la kinase RIP1 dans le changement hyperglycémique dans la nécroptose. Pour commencer, la traînée de quadrant Escherichia coli hébergeant l’ARN guide du vecteur lentiviral sur des plaques de gélose Luria-Bertani ou LB complétée par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles dans la zone la plus diluée de la plaque. Après l’incubation, à l’aide d’une boucle stérile, sélectionnez une seule colonie et ajoutez-la à cinq millilitres de bouillon LB, complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans un tube conique de 50 millilitres. Aérez et collez le capuchon du tube.

Incuber le tube dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 225 tr/min pendant huit heures. Pendant ce temps, ajoutez 40 millilitres de bouillon LB, complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans quatre tubes de 50 millilitres. Après l’incubation, transférez 40 microlitres de la culture cultivée dans chacun des quatre tubes.

Aérez et collez les capuchons des tubes avant de les incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 225 tr/min pendant 12 à 16 heures. Le lendemain, centrifugez les cultures à 3 220 x g dans un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes. Décantez les surnageants dans un bécher à déchets et combinez les quatre granulés dans 10 millilitres de bouillon LB, complété par de l’ampicilline.

Centrifugez les granulés combinés à vitesse maximale dans un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes pour obtenir un seul granulé et jetez autant de surnageants que possible dans le bécher à déchets. Semez HEK293T cellules à une concentration de trois à cinq fois 10 à la puissance six cellules dans un ballon T25 contenant du DMEM. Incuber le ballon pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Pendant ce temps, préparez le mélange de transfection en utilisant un rapport de 1:1:1:1 de plasmides et un rapport de 3:1 de réactif de transfection à l’ADN plasmidique avec un milieu sérique réduit. Mélangez 75 microlitres de réactif de transfection, 2 500 microlitres de milieu sérique réduit et 25 microgrammes d’ADN plasmidique total. Laissez le mélange incuber à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.

Ensuite, pipetez soigneusement le mélange de transfection sur les cellules de HEK293T confluentes dans le flacon contenant le milieu. Agitez doucement le ballon pour assurer une homogénéisation adéquate du mélange et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après deux jours d’incubation, transférez le milieu du producteur HEK293T flacon cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez le tube à 800 x g pendant cinq minutes pour granuler les cellules de HEK293T restantes. Retirez soigneusement tout le virus contenant du surnageant sans déranger la pastille et transférez-la dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Comptez et calculez le volume requis de la suspension de cellules U937 pour obtenir une pastille de 2 x 10 à la puissance de six cellules.

Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres à 400 x g pendant 10 minutes et décantez le surnageant, en laissant la pastille cellulaire dans le tube. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans le surnageant contenant un virus et centrifuger le tube à 290 x g pendant 60 minutes. Après la centrifugation, à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille avec le surnageant contenant le virus dans le tube.

Placez le tube sur un rotateur bout à bout pendant 60 minutes. Ensuite, centrifugez le tube à 400 x g pendant 10 minutes et mettez à nouveau la pastille en suspension dans un rapport de 1:1 de surnageants contenant le virus et un milieu RPMI 1640 complet, complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Transférez le mélange cellulaire dans un nouveau flacon de culture tissulaire T25 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après l’incubation, centrifugez les cellules U937 à 400 x g pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension avec un média RPMI 1640 complet, complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et cinq microgrammes par millilitre de puromycine. Transférez la culture cellulaire dans une fiole T25.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux à trois semaines, en vérifiant les cellules tous les un à deux jours pour détecter des signes de croissance. L’analyse par transfert Western a confirmé la perte d’expression de la protéine RIP1 dans les cellules mutantes CRISPR RIP1 sans signal détectable par rapport au signal fort dans les cellules témoins de type sauvage et non cible. Le traitement par TCZ a induit une mort cellulaire nécroptotique significative dans les cellules de contrôle de type sauvage et non cible, qui a été inversée par le traitement à la nécrostatine-1.

En revanche, les cellules knock-out RIP1 CRISPR ont montré une mort cellulaire significativement plus faible par rapport aux cellules de contrôle de type sauvage et non cible, sans effet de la nécrostatine-1, indiquant une perte de la fonction RIP1. La microscopie à fluorescence sur cellules vivantes a montré une augmentation significative de la production de superoxyde mitochondrial dans les cellules de type sauvage et les cellules témoins non cibles après le traitement par TCZ, qui a été réduite lors du traitement à la nécrostatine-1. Les cellules knock-out RIP1 CRISPR ont montré une production minimale de superoxyde mitochondrial sans effet observable du traitement à la nécrostatine-1.