Name: Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez la génération d'une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l'aide du système CRISPR-Cas9. Cette méthode permet d'étudier le rôle de RIPK1 dans les voies de signalisation cellulaire.

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<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM moyen ajusté</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide Hoechst 33342 trichlorhydrate</td><td>Sigma</td><td>Réf. B2261</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium complet</td><td>Sigma</td><td>Réf. R6504</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC souche d’ARNg E.coli</td><td>transOMIC</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>Souche d’ARNg CRISPR RIP1 E.coli</td><td>transOMIC</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de bout en bout</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Fluorescence Microscope</td><td>Technologies de la vie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de plasmide GenElute Maxiprep</td><td>Sigma</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-lapin de chèvre, (H+L) conjugué HRP</td><td>Sigma</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>Scientifique du Nouveau-Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon LB</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Mélange d’emballage lentiviral</td><td>Gibco</td><td>N° A43237</td><td></td></tr><tr><td>Rouge MitoSOX</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nécrostatine-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Sigma</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-humain RIP1 mAb</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>Équipement SDS-PAGE et western blot</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha ;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937 Monocytes humains</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Système d’essai de prolifération cellulaire</td><td>Takara</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9</td><td>Roche Diagnostics</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’une lignée cellulaire rip1 knockout u937 à l’aide du système crispr-cas9

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

Suite à la production d’une population confluente de cellules U937 mutantes RIP1 CRISPR, des analyses SDS-PAGE et Western blot ont été effectuées. L’analyse par transfert Western a été utilisée pour déterminer la création réussie d’une lignée cellulaire mutante CRISPR RIP1 en évaluant la perte des niveaux d’expression de la protéine RIP1. Cette détermination a été faite sur la base du résultat comparatif des monocytes WT U937 et des cellules NTC. Dans la figure 2, l’express...

Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

Nos recherches portent sur la mort cellulaire du programme mammifère, en étudiant plus particulièrement l’équilibre entre l’apoptose et la nécroptose dans le contexte de l’hyperglycémie. Plus récemment, il a été démontré que la protéine de mort cellulaire RIP1 kinase module l’expression des gènes pendant la nécroptose. Notre défi expérimental actuel consiste à manipuler génétiquement les cellules immunitaires qui se développent en suspension, en particulier en éliminant le gène de la kinase RIP1 à l’aide de CRISPR-Cas9.Notre protocole offre deux avantages distincts. Il améliore les méthodes de transfection pour les cellules immunitaires qui se développent en suspension en utilisant le lentivirus, et il élimine le besoin de clonage de cellule unique pendant le processus de création d’un knockout génétique à l’aide de CRISPR-Cas9, Nos résultats ont ouvert la voie à l’étude du rôle de la kinase RIP1 dans le changement hyperglycémique dans la nécroptose. Pour commencer, la traînée de quadrant Escherichia coli hébergeant l’ARN guide du vecteur lentiviral sur des plaques de gélose Luria-Bertani ou LB complétée par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles dans la zone la plus diluée de la plaque. Après l’incubation, à l’aide d’une boucle stérile, sélectionnez une seule colonie et ajoutez-la à cinq millilitres de bouillon LB, complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans un tube conique de 50 millilitres. Aérez et collez le capuchon du tube.Incuber le tube dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 225 tr/min pendant huit heures. Pendant ce temps, ajoutez 40 millilitres de bouillon LB, complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans quatre tubes de 50 millilitres. Après l’incubation, transférez 40 microlitres de la culture cultivée dans chacun des quatre tubes.Aérez et collez les capuchons des tubes avant de les incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 225 tr/min pendant 12 à 16 heures. Le lendemain, centrifugez les cultures à 3 220 x g dans un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes. Décantez les surnageants dans un bécher à déchets et combinez les quatre granulés dans 10 millilitres de bouillon LB, complété par de l’ampicilline.Centrifugez les granulés combinés à vitesse maximale dans un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes pour obtenir un seul granulé et jetez autant de surnageants que possible dans le bécher à déchets. Semez HEK293T cellules à une concentration de trois à cinq fois 10 à la puissance six cellules dans un ballon T25 contenant du DMEM. Incuber le ballon pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Pendant ce temps, préparez le mélange de transfection en utilisant un rapport de 1:1:1:1 de plasmides et un rapport de 3:1 de réactif de transfection à l’ADN plasmidique avec un milieu sérique réduit. Mélangez 75 microlitres de réactif de transfection, 2 500 microlitres de milieu sérique réduit et 25 microgrammes d’ADN plasmidique total. Laissez le mélange incuber à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.Ensuite, pipetez soigneusement le mélange de transfection sur les cellules de HEK293T confluentes dans le flacon contenant le milieu. Agitez doucement le ballon pour assurer une homogénéisation adéquate du mélange et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après deux jours d’incubation, transférez le milieu du producteur HEK293T flacon cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifugez le tube à 800 x g pendant cinq minutes pour granuler les cellules de HEK293T restantes. Retirez soigneusement tout le virus contenant du surnageant sans déranger la pastille et transférez-la dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Comptez et calculez le volume requis de la suspension de cellules U937 pour obtenir une pastille de 2 x 10 à la puissance de six cellules.Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres à 400 x g pendant 10 minutes et décantez le surnageant, en laissant la pastille cellulaire dans le tube. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans le surnageant contenant un virus et centrifuger le tube à 290 x g pendant 60 minutes. Après la centrifugation, à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille avec le surnageant contenant le virus dans le tube.Placez le tube sur un rotateur bout à bout pendant 60 minutes. Ensuite, centrifugez le tube à 400 x g pendant 10 minutes et mettez à nouveau la pastille en suspension dans un rapport de 1:1 de surnageants contenant le virus et un milieu RPMI 1640 complet, complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Transférez le mélange cellulaire dans un nouveau flacon de culture tissulaire T25 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Après l’incubation, centrifugez les cellules U937 à 400 x g pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension avec un média RPMI 1640 complet, complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et cinq microgrammes par millilitre de puromycine. Transférez la culture cellulaire dans une fiole T25.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux à trois semaines, en vérifiant les cellules tous les un à deux jours pour détecter des signes de croissance. L’analyse par transfert Western a confirmé la perte d’expression de la protéine RIP1 dans les cellules mutantes CRISPR RIP1 sans signal détectable par rapport au signal fort dans les cellules témoins de type sauvage et non cible. Le traitement par TCZ a induit une mort cellulaire nécroptotique significative dans les cellules de contrôle de type sauvage et non cible, qui a été inversée par le traitement à la nécrostatine-1.En revanche, les cellules knock-out RIP1 CRISPR ont montré une mort cellulaire significativement plus faible par rapport aux cellules de contrôle de type sauvage et non cible, sans effet de la nécrostatine-1, indiquant une perte de la fonction RIP1. La microscopie à fluorescence sur cellules vivantes a montré une augmentation significative de la production de superoxyde mitochondrial dans les cellules de type sauvage et les cellules témoins non cibles après le traitement par TCZ, qui a été réduite lors du traitement à la nécrostatine-1. Les cellules knock-out RIP1 CRISPR ont montré une production minimale de superoxyde mitochondrial sans effet observable du traitement à la nécrostatine-1.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

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Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 est un système robuste pour produire la perturbation des gènes et des éléments génétiques. Nous décrivons ici un protocole pour la création efficace de délétions génomiques dans des lignées cellulaires de mammifères à l’aide de CRISPR/Cas9.

Génération de suppressions génomiques dans des lignées cellulaires de mammifères via CRISPR / Cas9

Les outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR) ont considérablement amélioré l’efficacité du ciblage génique dans les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur hiPSC spécifique à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas.

Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l&#39;CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.

Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé

Cet article rapporte la construction de cellules knock-out de la protéine E associée au centromère (CENP-E) à l’aide du système CRISPR/Cas9 et de trois stratégies de criblage basées sur le phénotype. Nous avons utilisé la lignée cellulaire knock-out CENP-E pour établir une nouvelle approche visant à valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui est utile pour le développement de médicaments et la recherche biologique.

Génération de lignées cellulaires knock-out Protein-E CENP-E-/- associées au centromère à l’aide du système CRISPR/Cas9

La lignée cellulaire THP-1 est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des monocytes/macrophages humains dans divers domaines de recherche liés à la biologie. Cet article décrit un protocole pour une ingénierie efficace basée sur CRISPR-Cas9 et l’isolement de clones unicellulaires, permettant la production de données phénotypiques robustes et reproductibles.

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Découvrez la génération d'une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l'aide du système CRISPR-Cas9. Cette méthode permet d'étudier le rôle de RIPK1 dans les voies de signalisation cellulaire.

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