Microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon
12 janvier 2024
Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.
La microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique est une technique de microscopie totalement stable, qui peut combiner les informations de localisation fournies par la microscopie fluorescente et constitue l’ultrastructure par microscopie électronique. Cependant, la mentalité de cette technique est de préserver la fluorescence après avoir une préparation simple. En utilisant cette protéine fluorescente, nous pouvons obtenir une lumière corrélative et le microscope électronique qui peut maintenir simultanément la fluorescence et l’ultra-structure.
Aperçu
Cette étude présente un protocole détaillé de microscopie correlative en lumière et en transmission après inclusion en Epon utilisant la protéine fluorescente mScarlet. La méthode préserve avec succès à la fois la fluorescence et l'ultrastructure, ce qui la rend applicable à diverses utilisations biologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Microscopie correlative en lumière et en électrons
- Applications des protéines fluorescentes
- Techniques de microscopie
Contexte
- Combinaison de la microscopie fluorescente avec la microscopie électronique
- Difficultés liées à la préservation de la fluorescence pendant la préparation
- Utilisation de mScarlet pour une imagerie améliorée
Méthodes utilisées
- Techniques de microscopie correlative en lumière et en électrons
- Tissu cérébral de souris comme modèle biologique
- Post-embedding utilisant l’Epon et la mScarlet
Résultats principaux
- Préservation réussie de la fluorescence et de l'ultrastructure
- Imagerie détaillée du tissu cérébral
- Alignement efficace des signaux de microscopie de fluorescence et de microscopie électronique
Conclusions
- L'étude démontre une méthode fiable pour la microscopie correlative en lumière et en électrons
- Mettre en évidence le potentiel d'applications plus larges dans la recherche en biologie
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
L'imagerie corrélatrice lumière-électron (CLEM) après inclusion en résine Epon permet la préservation simultanée de la fluorescence et de l'ultrastructure, répondant ainsi à un défi majeur en imagerie cellulaire exploratoire. Cette capacité renforce la détection mécanistique et la validation des cibles en fournissant un contexte spatial haute résolution pour la localisation moléculaire. La méthode soutient la confiance prédictive aux points critiques des étapes de découverte précoce et des voies de recherche préclinique.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une localisation précise des cibles moléculaires au sein de l'ultrastructure cellulaire préservée.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles en corrélant les signaux de fluorescence avec les caractéristiques ultrastructurales.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à la visualisation directe des relations moléculaires et structurales.
- Améliore la confiance prédictive pour la progression des cibles dans le processus de découverte.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des sections biologiques validées pour des flux de travail d'imagerie à haut contenu en aval.
- Garantit la reproductibilité et la production d'images quantitatives en préservant à la fois la fluorescence et l'ultrastructure.
- Facilite la standardisation et l'extensibilité des tests pour des applications de criblage nécessitant une résolution spatiale.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur les structures subcellulaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données de localisation moléculaire avec les modifications ultrastructurales pertinentes pour la maladie dans les modèles précliniques.
- Assure une continuité du stade de découverte à la validation préclinique en intégrant des données d'imagerie multimodales.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque fondées sur des preuves moléculaires et spatiales solides.
- Améliore le développement de biomarqueurs translationnels en corrélant la fluorescence avec la pathologie ultrastructurale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à la recherche préclinique, en associant l'analyse de la localisation moléculaire et l'analyse ultrastructurale.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies biologiques en corrélant les données moléculaires et structurales.
- Criblage : Fournit des images quantitatives reproductibles pour le développement de tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Offre des mesures haute résolution et des sorties de recalage d'images destinées à l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Permet d'associer des marqueurs moléculaires à des ultrastructures pertinentes pour la maladie dans des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité d'imagerie réutilisable pour divers programmes de recherche et développement nécessitant une microscopie corrélative.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise les flux de travail d'imagerie et garantit la reproductibilité entre les expériences.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital en fournissant des données spatiales robustes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque et la progression des actifs de découverte et précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les techniques de microscopie à fluorescence et de microscopie électronique.
- Exige un accès à des instruments d'imagerie avancés et à des logiciels d'alignement d'images.
- Implique une standardisation entre équipes pour les protocoles de préparation des échantillons et d'imagerie.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types de tissus ou les systèmes modèles.
- Dépend de la compatibilité des protéines fluorescentes avec l'inclusion en Epon et la préparation pour la microscopie électronique.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
