Name: Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez la production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour étudier les interactions cellule-matrice et concevoir des supports biomimétiques en ingénierie tissulaire cardiaque.

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<meta charset="utf8"></head><body>Génération d’une matrice extracellulaire imitant le myocarde pour la culture cellulaire

<ol><li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li>
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<li>Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+relationship+between+cardiac+fibroblasts+and+cardiomyocytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease.</a> J Am Heart Assoc. 10 (5), e019338(2021).</li>
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<li>Nurzynska, D., Iruegas, M. E., Castaldo, C., Müller-Best, P., Di Meglio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+biotechnology+in+myocardial+regeneration-tissue+engineering+triad%3A+cells%2C+scaffolds%2C+and+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Application of biotechnology in myocardial regeneration-tissue engineering triad: cells, scaffolds, and signaling molecules.</a> Biomed Res Int. 2013, 236893(2013).</li>
<li>Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+after+myocardial+infarction%3A+An+approachable+goal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cardiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration after myocardial infarction: An approachable goal.</a> Curr Cardiol Rep. 22 (10), 122(2020).</li>
<li>Spedicati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+design+of+bioartificial+scaffolds+for+the+in+vitro+modeling+of+human+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomimetic design of bioartificial scaffolds for the in vitro modeling of human cardiac fibrosis.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 983782(2022).</li>
<li>Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast%3A+The+renaissance+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast: The renaissance cell.</a> Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).</li>
<li>Castaldo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast-derived+extracellular+matrix+%28biomatrix%29+as+a+model+for+the+studies+of+cardiac+primitive+cell+biological+properties+in+normal+and+pathological+adult+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast-derived extracellular matrix (biomatrix) as a model for the studies of cardiac primitive cell biological properties in normal and pathological adult human heart.</a> Biomed Res Int. 2013, 352370(2013).</li>
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<li>Gopal, S., Multhaupt, H. A. B., Couchman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+cell-extracellular+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium in cell-extracellular matrix interactions.</a> Adv Exp Med Biol. 1131, 1079-1102 (2020).</li>
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<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+regulates+the+profibrotic+activity+of+fibroblasts+in+in+vitro+replica+settings+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Vitamin C regulates the profibrotic activity of fibroblasts in in vitro replica settings of myocardial infarction.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8379(2023).</li>
<li>Jaffré, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+angiotensin+receptors+in+cardiac+fibroblasts+coregulate+adrenergic-dependent+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Serotonin and angiotensin receptors in cardiac fibroblasts coregulate adrenergic-dependent cardiac hypertrophy.</a> Circ Res. 104 (1), 113-123 (2009).</li>
<li>Błyszczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+cardiac+fibroblasts+control+contraction+of+human+fibrotic+cardiac+microtissues+by+a+%CE%B2-adrenoreceptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Activated cardiac fibroblasts control contraction of human fibrotic cardiac microtissues by a β-adrenoreceptor-dependent mechanism.</a> Cells. 9 (5), 1270(2020).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiol. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
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<li>Seo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+heart+ECM+hydrogel+using+supercritical+carbon+dioxide+for+improved+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Decellularized heart ECM hydrogel using supercritical carbon dioxide for improved angiogenesis.</a> Acta Biomater. 67, 270-281 (2018).</li>
<li>Liguori, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biomechanical+clues+from+cardiac+tissue+decellularized+extracellular+matrix+drive+stromal+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular and biomechanical clues from cardiac tissue decellularized extracellular matrix drive stromal cell plasticity.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 520(2020).</li>
<li>Silva, A. C., Pereira, C., Fonseca, A. C. R. G., Pinto-do-Ó, P., Nascimento, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bearing+my+heart%3A+The+role+of+extracellular+matrix+on+cardiac+development%2C+homeostasis%2C+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bearing my heart: The role of extracellular matrix on cardiac development, homeostasis, and injury response.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 621644(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Flacon de laboratoire de 1 L</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td>Nettoyer et autoclaver avant utilisation</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>Stérile, polystyrène</td></tr><tr><td>100 mm plaque de verre&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>Nettoyer et autoclaver avant utilisation</td></tr><tr><td>Plaques de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Boîte de culture cellulaire stérile traitée Tubes</td></tr><tr><td>stériles de 15 mL Falcon</td><td></td> 352097 <td>Centrifugeuse Tubes stériles, polypropylène</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Verres de protection</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>Stérile, &nbsp ; flacon de laboratoire en polystyrène</td></tr><tr><td>de 250 mL</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>Nettoyer et autoclaver avant utilisation</td></tr><tr><td>Plaques de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Boîte de culture cellulaire traitée et stérile</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td>Tubes stériles en polystyrène</td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Centrifugeuse Tubes stériles en polypropylène</td></tr><tr><td>Flacon de laboratoire de 500 mL</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>Propre et autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Plaques de 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Boîte de culture cellulaire stérile traitée</td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium (NH4OH)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>338818</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>Stérile et jetable</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Conserver à 2-8 &deg ; C; éviter l’exposition à la lumière</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Conserver à -20 &deg ;C. Le sérum doit être aliquote en plus petits volumes de travail</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>Nettoyer et autoclaver avant</td></tr><tr><td>utilisation Gélatine de peau de porc</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Poudre commerciale</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Grands ciseaux chirurgicaux</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>Nettoyer et autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection&nbsp ;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S3146</td><td>Nettoyer et autoclaver avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine&nbsp ;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Conserver à -20&deg ;C. La solution&nbsp ; doit être aliquote en volumes de travail plus petits</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium Monobasique</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td></td></tr><tr><td>Poudre Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Filtres Stericup</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>Membranes filtrantes stériles et jetables de 0,22 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine liquide-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Se conserve à -20 &deg ;C. Il doit être aliquote en volumes de travail plus petits</td></tr></tbody></table>

production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

La croissance des fibroblastes à partir des petits fragments de myocarde natif mis en culture a été observée dans les 3 à 5 jours (Figure 1).
Dans les jours qui ont suivi, le nombre de fibroblastes a continué d’augmenter, peut-être en raison d’une croissance soutenue de l’échantillon de tissu cardiaque et de la prolifération de fibroblastes migrés à la surface de la boîte. Il ne faut pas s’attendre à ce que tous les fragments de myocarde obtenus par désagrégation mécanique au scalpel produisent le même nombre de fibroblastes dans le même laps de temps, car les fragments de tissu résultants peuvent avoir des volumes et des taux de survie cellulaire légèrement différents. Notamment, les fragments de myocarde avec une activité de croissance confirmée peuvent être conservés et replaqués, ce qui leur permet d’être utilisés au moins deux fois pour l’isolement des fibroblastes.
Les fibroblastes peuvent être sous-cultivés sur plusieurs passages afin d’augmenter le nombre de cellules disponibles pour d’autres expériences. Cependant, une fois qu’ils atteignent la confluence, les fibroblastes cessent de proliférer in vitro et assument une activité de synthèse et de sécrétion, déposant une matrice extracellulaire. La décellularisation ultérieure laisse la surface de la plaque recouverte d’un treillis ECM cardiaque (Figure 2). L’observation visuelle de la boîte de culture, à l’œil nu et à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé, pendant l’élimination des fibroblastes est essentielle pour minimiser le temps d’incubation dans la solution de décellularisation au minimum nécessaire et suffisant. La présence d’un voile flottant pendant l’incubation indique la perméabilisation et le détachement de la monocouche de fibroblastes, et la solution de décellularisation doit être diluée et retirée immédiatement après.
La composition de l’ECM cardiaque dérivée des fibroblastes dépend de la source des fibroblastes. Dans nos expériences, la MEC cardiaque produite par des fibroblastes isolés de cœurs humains normaux et de cœurs humains atteints de cardiopathie ischémique avait des teneurs en protéines différentes et exerçait des influences différentes sur la prolifération, l’apoptose et la migration des cellules cardiaques primitives11,12. Bien que la perte de protéines ECM soit inévitable au cours du processus de décellularisation, la méthode employée dans le présent protocole a préservé dans une large mesure la composition et l’architecture de la ECM cardiaque produite in vitro (Figure 3).
Dans ce protocole, le tissu auriculaire a été utilisé car il peut être obtenu à partir de cœurs normaux (donneur) et pathologiques (receveurs). Bien que l’ensemble du cœur pathologique (receveur) puisse être sectionné et utilisé pour la recherche (conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et avec l’approbation du comité d’éthique local), il n’est pas possible d’obtenir des échantillons de ventricules du cœur du donneur au moment de la transplantation. Pour cette raison, si le champ de l’étude est d’étudier les différences entre le tissu cardiaque dans des conditions normales et pathologiques, la meilleure source d’échantillon est la paroi auriculaire. En fonction de la disponibilité d’autres sources de tissu cardiaque viables, des échantillons des parois auriculaires ou ventriculaires des cœurs normaux ou pathologiques peuvent être utilisés en suivant le même protocole pour le revêtement de la boîte ECM cardiaque.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg"> Figure 1 : Isolement des fibroblastes cardiaques. Excroissance de fibroblastes à partir de fragments de myocarde après 4 jours (A), 8 jours (B) et 12 jours (C) de culture. Barres d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg"> Figure 2 : Décellularisation de la matrice extracellulaire. Fibroblastes après environ 10 s (A), 20 s (B), 30 s (C), 40 s (D), 50 s (E) et 60 s (F) d’incubation dans la solution de décellularisation. Barres d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg"> Figure 3 : Composition de la matrice extracellulaire avant et après décellularisation. Coloration par immunofluorescence indirecte des protéines représentatives de la matrice extracellulaire cardiaque, y compris le collagène de type III (A, E) et de type IV (B, F), la laminine (C, G) et la fibronectine (D, H), avant (A-D) et après l’élimination des fibroblastes (E-H). Les noyaux cellulaires ont été colorés au DAPI (bleu). Barres d’échelle : (A-C,E-G) 50 μm ; (D,H) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solutions</td>
			<td colspan="2">Composition des solutions</td>
			<td>Volume final</td>
			<td>Commentaires</td>
		</tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td>
			<td colspan="2">Sels alimentés dans le commerce + eau stérile bidistillée + 0,35 g de bicarbonate de sodium</td>
			<td>1 L</td>
			<td>Stérilisé par filtration/stockage à 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solution de décellularisation</td>
			<td colspan="2">0,25 % Triton X-100 + 10 mM NH4OH+ PBS</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>Stérilisé par filtration/stockage à 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)</td>
			<td colspan="2">223,75 mL de DMEM + 25 mL de sérum fœtal bovin + 1,25 mL de solution de pénicilline/streptomycine</td>
			<td>250 ml</td>
			<td>Conserver à 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solution de gélatine</td>
			<td colspan="2">0,2 g de gélatine en poudre + 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>Stérilisé par filtration/stockage à 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0,1 g de phosphate de potassium monobasique + 0,1 g de chlorure de potassium + 4,0 g de chlorure de sodium + 0,575 g de phosphate de sodium dibasique + eau stérile bidistillée</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>Stérilisé par filtration/stockage à 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solution stoppée de trypsine (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 mL de sérum fœtal bovin + 45 mL de solution saline équilibrée Hank’s</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>Conserver à 4 °C</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Les composants et les concentrations respectives de chaque solution utilisée dans l’étude.

Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

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Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

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Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

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Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

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La cardiaque matrice extracellulaire (ECM) est un réseau complexe de molécules qui orchestrent des processus clés dans les tissus et organes tout en supportant un remodelage physiologique tout au long de la vie. Décellularisation normalisée de coeur foetal et adultes permet des études expérimentales comparatives des deux tissus dans un contexte 3D en capturant l’architecture native et propriétés biomécaniques.

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Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.

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Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de...

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Découvrez la production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour étudier les interactions cellule-matrice et concevoir des supports biomimétiques en ingénierie tissulaire cardiaque.

Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

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