Name: Impression 3D de bactéries pour étudier la motilité et la croissance dans des milieux poreux 3D complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Découvrez l'impression 3D de colonies bactériennes dans des matrices d'hydrogel granulaire pour étudier la motilité et la croissance de Vibrio cholerae et E. coli. Cette méthode révèle les effets de la taille des pores sur la propagation cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

R.K.B. remercie le soutien du programme présidentiel de bourses de recherche postdoctorale. Ce matériel est également basé sur des travaux soutenus par le programme de bourses de recherche d’études supérieures de la NSF DGE-2039656 (à A.M.H.). A.S.D.-M. et H.N.L. reconnaissent le soutien du Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund de l’Université de Princeton. Nous remercions également le laboratoire de Bonnie Bassler pour avoir fourni des souches de V. cholerae. S.S.D. remercie le soutien des subventions de la NSF CBET-1941716, DMR-2011750 et EF-2124863, ainsi que du Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, de la New Jersey Health Foundation, du Pew Biomedical Scholars Program et du Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Bio-impression de bactéries dans des matrices d’hydrogel pour l’étude de la motilité et de la croissance

<ol><li>Persat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+world+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanical world of bacteria.</a> Cell. 161 (5), 988-997 (2015).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flowing+biofilms+as+a+transport+mechanism+for+biomass+through+porous+media+under+laminar+and+turbulent+conditions+in+a+laboratory+reactor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system.</a> Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).</li>
<li>Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+changes+in+the+bacterial+community+structure+along+a+vertical+oxygen+gradient+in+flooded+paddy+soil+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).</li>
<li>Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+intestinal+bacteria+with+components+of+the+intestinal+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).</li>
<li>Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+translocation%3A+Overview+of+mechanisms+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).</li>
<li>Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+in+bacterial+pathogens%3A+For+motility+and+a+whole+lot+more%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).</li>
<li>Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+the+gut+compress+the+colonic+mucus+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).</li>
<li>Harman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneous+motility+of+the+Lyme+disease+spirochete+in+gelatin+mimics+dissemination+through+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Siitonen, A., Nurminen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+is+a+colonization+factor+in+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).</li>
<li>Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+chemotaxis+in+tissue+penetration+of+oral+epithelial+cell+layers+by+Treponema+denticola%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola.</a> Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).</li>
<li>O’Neil, H. S., Marquis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+flagella+are+used+for+motility%2C+not+as+adhesins%2C+to+increase+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion.</a> Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).</li>
<li>Gill, C. O., Penney, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+bacteria+into+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Penetration of bacteria into meat.</a> Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).</li>
<li>Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+aerobic+bacteria+into+meat%3A+A+mechanistic+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding.</a> Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).</li>
<li>Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+enhancement+of+bacterial+motility+increases+tumor+penetration%3A+Motility+enhances+bacterial+tumor+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).</li>
<li>Toley, B. J., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+is+critical+for+effective+distribution+and+accumulation+of+bacteria+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue.</a> Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).</li>
<li>Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydration-controlled+bacterial+motility+and+dispersal+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).</li>
<li>de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+as+inoculants+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils.</a> Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).</li>
<li>Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+motility+in+the+survival+and+spread+of+Pseudomonas+fluorescens+in+soil+and+in+the+attachment+and+colonisation+of+wheat+roots%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots.</a> FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).</li>
<li>Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+biology+and+crop+productivity%E2%80%94a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Research%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere biology and crop productivity—a review.</a> Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Retention+of+Bacteria+in+Porous+Media+with+Residual+NAPL+Entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment.</a> Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Residence+Time+of+Bacteria+in+Granular+Media+Containing+Distributed+Contaminant+Sources%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources.</a> Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).</li>
<li>Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+transport+of+bacteria+through+saturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).</li>
<li>Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+effect+of+chemotaxis+and+growth+on+microbial+distributions+in+organic-amended+aquifer+sediments%3A+Observations+from+laboratory+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies.</a> Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).</li>
<li>Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+confinement+on+the+spreading+of+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of confinement on the spreading of bacterial populations.</a> PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).</li>
<li>Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysical+threshold+for+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A biophysical threshold for biofilm formation.</a> eLife. 11, e76380(2022).</li>
<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+scaling+laws+for+microgel+yielding+near+jamming%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming.</a> Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+and+activity+regulate+bacterial+motion+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media.</a> Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+migration+of+bacteria+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemotactic migration of bacteria in porous media.</a> Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+smoothing+of+collective+migration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemotactic smoothing of collective migration.</a> eLife. 11, e71226(2022).</li>
<li>Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+open-source+syringe+extruder+optimized+for+extrusion+and+retraction+during+FRESH+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting.</a> HardwareX. 9, e00170(2021).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+growth+kinetics+of+Vibrio+cholerae+in+presence+of+gold+nanoparticles%3A+Effect+of+size+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).</li>
<li>Martínez-Calvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+instability+and+roughening+of+growing+3D+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+approach+for+3D+bacterial+printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward approach for 3D bacterial printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+cell+ordering+in+confined+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).</li>
</ol>

La plateforme expérimentale utilisée pour imprimer en 3D et imager les communautés bactériennes dans cette publication fait l’objet d’une demande de brevet déposée par l’Université de Princeton au nom de Tapomoy Bhattacharjee et S.S.D. (numéro de demande PCT PCT/US/2020/030213).

Étapes critiques du protocole Il est important de s’assurer que lors de la préparation de chaque matrice d’hydrogel, la matrice est fabriquée dans un environnement stérile. Sinon, une contamination peut se produire, qui se manifeste par exemple par des microcolonies (petits sphéroïdes) dans la matrice après plusieurs jours. Pendant le processus de mélange, il est important que toutes les particules d’hydrogel granulaires sèches soient dissoutes. De plus, lors de l’ajustement du pH de chaque matrice d’hydrogel avec le NaOH, les granulés commenceront à gonfler, ce qui augmentera la viscosité de la matrice d’hydrogel, ce qui rendra le mélange plus difficile. L’utilisation du batteur sur socle aidera à s’assurer que le NaOH est bien mélangé à la matrice d’hydrogel. Lors du chargement de chaque suspension bactérienne, des poches d’air peuvent se former dans l’aiguille. Pour éviter ce problème, assurez-vous que la pointe de l’aiguille se trouve toujours dans la suspension bactérienne dans le tube à centrifuger et non au bas du tube ou près de la surface supérieure. Une autre façon de surmonter ce problème est de cultiver de grands volumes de cellules et donc d’avoir de plus grands volumes de suspension bactérienne pour l’impression.
Limitations Actuellement, lors de l’impression, la faible viscosité de la suspension bactérienne limite les géométries pouvant être imprimées et conduit souvent à la formation d’un biofilm et à sa croissance sur le dessus de la surface de la matrice d’hydrogel en raison des cellules traces. Il existe quelques méthodes potentielles pour surmonter cette limitation, notamment l’augmentation de la viscosité de la suspension bactérienne ou l’optimisation des paramètres de l’imprimante 3D. Pour augmenter la viscosité de la suspension bactérienne, on peut mélanger la suspension bactérienne avec un autre polymère - par exemple, l’alginate, qui a déjà été utilisé pour l’impression 3D de bactéries sur des surfaces planes38. Les paramètres de l’imprimante peuvent être optimisés pour permettre la rétraction du piston de la seringue lors du retrait de l’aiguille de la matrice d’hydrogel granulaire, ce qui aurait le potentiel d’empêcher les cellules de se déposer lors du retrait de l’aiguille de la matrice d’hydrogel.
L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes ou alternatives La méthode décrite ici permet d’imprimer des colonies bactériennes dans des matrices d’hydrogel granulaires. Les matrices d’hydrogel granulaires permettent d’étudier l’impact des facteurs environnementaux externes (par exemple, la taille des pores, la déformabilité de la matrice) sur la motilité et la croissance des bactéries. De plus, alors que dans ce travail, LB est utilisé comme milieu de croissance liquide pour gonfler la matrice d’hydrogel, la matrice d’hydrogel peut être gonflée avec d’autres milieux de croissance liquides, y compris des milieux contenant des antibiotiques. Les méthodes précédentes d’étude des bactéries dans des environnements confinés étaient limitées par la durée de l’expérience, la taille du maillage du polymère et la rigidité de la matrice d’hydrogel environnante37,38. Il existe déjà des protocoles pour fabriquer des matrices d’hydrogel granulaires à partir de différents polymères, de sorte que le potentiel d’étude des impacts de différentes conditions environnementales sur la motilité et la croissance des bactéries est vaste. Cette méthode permet d’étudier les bactéries dans des environnements de contrôle qui récapitulent plus facilement les environnements que les bactéries habitent dans le monde réel, tels que le mucus de l’hôte ou le sol. Une autre limitation de nombreuses autres méthodes est l’opacité de la matrice environnante ; cependant, cette approche utilisant des matériaux optiquement transparents offre la possibilité d’explorer, par exemple, le contrôle optogénétique et la structuration des bactéries en 3D.
Au-delà de l’étude de la motilité et de la croissance, la méthode d’impression 3D décrite ici surmonte les limites de nombreuses autres méthodes de bio-impression qui nécessitent le dépôt d’une bio-encre sur un substrat et sont donc limitées dans la hauteur du matériau vivant qu’elles peuvent produire. À l’avenir, ce protocole de bio-impression pourra être étendu pour fabriquer des matériaux biohybrides en mélangeant des polymères avec des cellules formant un biofilm. Les matrices d’hydrogel granulaires permettent d’imprimer en 3D des matériaux vivants plus épais et à plus grande échelle et des géométries plus complexes que de nombreuses autres méthodes actuelles de bio-impression de bactéries. Bien que ce travail n’ait utilisé que V. cholerae et E. coli, d’autres espèces, telles que Pseudomonas aeruginosa, ont également été imprimées en3D avec succès 37. Au-delà de l’impression, l’imprimante peut être adaptée pour effectuer un échantillonnage contrôlé des bactéries après leur croissance afin de voir s’il y a eu des changements génétiques, par exemple.

Les bactéries habitent souvent des environnements poreux 3D divers et complexes allant des gels muqueux dans l’intestin et les poumons au sol dans le sol 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. Dans ces contextes, le mouvement bactérien par motilité ou croissance peut être entravé par des obstacles environnants, tels que des réseaux de polymères ou des empilements de grains minéraux solides, influençant la capacité des cellules à se propager dans leur environnement26, à accéder aux sources de nutriments, à coloniser de nouveaux terrains et à former des communautés de biofilms protectrices27. Cependant, les études de laboratoire traditionnelles utilisent généralement des géométries très simplifiées, en se concentrant sur des cellules dans des cultures liquides ou sur des surfaces planes. Bien que ces approches fournissent des informations clés sur la microbiologie, elles ne récapitulent pas entièrement la complexité des habitats naturels, ce qui entraîne des différences spectaculaires dans les taux de croissance et le comportement de motilité par rapport aux mesures effectuées dans des contextes réels. Par conséquent, une méthode pour définir les colonies bactériennes et étudier leur motilité et leur croissance dans des environnements poreux 3D plus proches de bon nombre de leurs habitats naturels est absolument nécessaire.
L’inoculation de cellules dans un gel de gélose puis la visualisation de leur propagation macroscopique à l’œil nu ou à l’aide d’une caméra fournit un moyen simple d’y parvenir, comme l’ont proposé Tittsler et Sandholzer en 193628. Cependant, cette approche souffre d’un certain nombre de défis techniques clés : (1) alors que la taille des pores peut, en principe, être modifiée en faisant varier la concentration d’agarose, la structure des pores de ces gels est mal définie ; (2) La diffusion de la lumière rend ces gels troubles, ce qui rend difficile la visualisation des cellules à l’échelle individuelle avec une résolution et une fidélité élevées, en particulier dans les grands échantillons ; (3) Lorsque la concentration de gélose est trop importante, la migration cellulaire est limitée à la surface plane supérieure du gel ; (4) La rhéologie complexe de ces gels rend difficile l’introduction d’inoculums avec des géométries bien définies.
Pour remédier à ces limites, le laboratoire de Datta a développé une approche alternative utilisant des matrices d’hydrogel granulaires - composées de particules d’hydrogel biocompatibles coincées gonflées dans une culture bactérienne liquide - comme « boîtes de Pétri poreuses » pour confiner les cellules en 3D. Ces matrices sont des solides mous, auto-cicatrisants, à limite d’élasticité ; ainsi, contrairement aux gels réticulés utilisés dans d’autres procédés de bio-impression, une microbuse d’injection peut se déplacer librement à l’intérieur de la matrice le long de n’importe quel chemin 3D prescrit en réorganisant localement les particules d’hydrogel29. Ces particules se redensifient ensuite rapidement et s’auto-réparent autour des bactéries injectées, soutenant les cellules en place sans aucun traitement nocif supplémentaire. Ce procédé est donc une forme d’impression 3D qui permet d’organiser des cellules bactériennes - dans une structure 3D souhaitée, avec une composition de communauté définie - au sein d’une matrice poreuse aux propriétés physico-chimiques réglables. De plus, les matrices d’hydrogel sont complètement transparentes, ce qui permet de visualiser directement les cellules à l’aide de l’imagerie.
L’utilité de cette approche a déjà été démontrée de deux manières. Dans une série d’études, des cellules diluées ont été dispersées dans la matrice de l’hydrogel, ce qui a permis d’étudier la motilité des bactéries individuelles30,31. Dans une autre série d’études, les communautés multicellulaires ont été imprimées en 3D dans des gels à l’échelle centimétrique à l’aide d’une buse d’injection montée sur une platine de microscope programmable, ce qui a permis d’étudier la propagation des collectifs bactériens dans leur environnement32,33. Dans les deux cas, ces études ont révélé des différences jusqu’alors inconnues dans les caractéristiques de propagation des bactéries habitant des environnements poreux par rapport à celles de la culture liquide/sur des surfaces planes. Cependant, étant donné qu’elles étaient montées sur une platine de microscope, ces études antérieures étaient limitées à de petits volumes d’échantillons (~1 ml) et, par conséquent, à des échelles de temps expérimentales courtes. Ils étaient également limités dans leur capacité à définir des géométries d’inocula avec une haute résolution spatiale.
Ici, la prochaine génération de cette plate-forme expérimentale qui répond à ces deux limites est décrite. Plus précisément, des protocoles sont fournis par lesquels on peut utiliser une imprimante 3D modifiée avec un extrudeur de seringue attaché pour imprimer en 3D et imager des colonies bactériennes à grande échelle. De plus, des données représentatives indiquent comment cette approche peut être utile pour étudier la motilité et la croissance des bactéries, en utilisant les exemples de Vibrio cholerae et d’Escherichia coli planctonique. Cette approche permet de maintenir les colonies bactériennes sur de longues périodes et de les visualiser à l’aide de diverses techniques d’imagerie. Par conséquent, la capacité de cette approche à étudier les communautés bactériennes dans les habitats poreux 3D a un énorme potentiel de recherche et d’application, ayant un impact sur le traitement et l’étude des microbes dans l’intestin, la peau, les poumons et le sol. De plus, cette approche pourrait être utilisée à l’avenir pour imprimer en 3D des matériaux vivants à base de bactéries dans des formes autoportantes plus complexes.

<table><tbody><tr><td>Cuvettes de 1 mL</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer lock de 1 mL</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules de polystyrène fluorescent carboxylé 100 nm (FluoSpheres)&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td> F8803</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 15 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée 20 G</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire 25 mL</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>Imprimante 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’impression 3D</td><td>Cura</td><td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes à centrifuger</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Carbomer Particules d’hydrogel granulaire</td><td>Lubrizol&nbsp ;</td><td>Carbopol 980NF</td><td>granulés secs de copolymères d’acide acrylique/acrylate d’alkyle réticulé</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (capacité du tube de 2 ml)</td><td>Centrifugeuse VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>(capacité du tube de 50 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall (marque) ST 8 (modèle)</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>A1R+ laser inversé à balayage Fond</td><td></td></tr><tr><td>de verre boîte de Pétri</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB (Bouillon Lubria)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 &times ; 1,25 mm, 150 mm de long, Capuchon à douille entièrement fileté</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 &times ; 1,25 mm, Laiton Thin Hex Nut</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue open-source</td><td></td><td>Replistruder 4</td> <td>sur mesurehttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (ronde de 60 mm)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Rhéomètre à cisaillement</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

impression 3d de bactéries pour étudier la motilité et la croissance dans des milieux poreux 3d complexes

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Les bactéries sont omniprésentes dans les environnements poreux tridimensionnels complexes (3D), tels que les tissus et les gels biologiques, ainsi que les sols et les sédiments souterrains. Cependant, la majorité des travaux antérieurs se sont concentrés sur l’étude de cellules dans des liquides en vrac ou sur des surfaces planes, qui ne récapitulent pas entièrement la complexité de nombreux habitats bactériens naturels. Ici, cette lacune dans les connaissances est comblée en décrivant le développement d’une méthode pour imprimer en 3D des colonies denses de bactéries dans des matrices d’hydrogel granulaires coincées. Ces matrices ont des tailles de pores et des propriétés mécaniques réglables ; ils confinent physiquement les cellules, les soutenant ainsi en 3D. Ils sont optiquement transparents, ce qui permet de visualiser directement la propagation bactérienne dans leur environnement à l’aide de l’imagerie. Comme preuve de ce principe, ici, la capacité de ce protocole est démontrée par l’impression 3D et l’imagerie de Vibro cholerae non mobile et mobile, ainsi que d’Escherichia coli non mobile, dans des matrices d’hydrogel granulaires coincées avec des pores interstitiels de différentes tailles.

Ce protocole décrit une procédure d’impression tridimensionnelle (3D) de colonies bactériennes pour étudier leur motilité et leur croissance dans des matrices d’hydrogel poreuses 3D complexes qui s’apparentent davantage à leurs habitats naturels que les cultures liquides conventionnelles ou les boîtes de Pétri.

Impression 3D de bactéries pour étudier la motilité et la croissance dans des milieux poreux 3D complexes

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Les bactéries sont omniprésentes dans des environnements complexes, tridimensionnels et poreux tels que les tissus et les gels biologiques, ainsi que les sols et les sédiments souterrains. Ici, nous développons une méthode pour imprimer en 3D des colonies denses de bactéries dans des matrices d’hydrogel granulaires coincées afin d’étudier leur croissance et leur motilité dans des environnements complexes. Des études ont révélé des différences jusqu’alors inconnues dans les caractéristiques de propagation des bactéries habitant des environnements poreux par rapport à celles des cultures liquides sur des surfaces planes.Le développement de l’utilisation de matrices d’hydrogel granulaires composées de particules d’hydrogel biocompatibles coincées gonflées dans une culture bactérienne liquide sous forme de boîtes de Pétri poreuses pour confiner les cellules en 3D. Les études précédentes étaient limitées à de petits volumes d’échantillons d’environ un ml, et donc à des échelles de temps expérimentales courtes, et étaient également limitées dans leur capacité à définir des géométries d’inoculums avec une haute résolution spatiale. Nous avons établi que les caractéristiques de propagation cellulaire des bactéries dépendent de la taille des pores et de la motilité de la cellule.

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Source : Scheidweiler, D., et al. Combiner des dispositifs fluidiques avec la microscopie et la cytométrie en flux pour étudier le transport microbien dans des milieux poreux à l’échelle spatiale. J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo démontre l’utilisation d’un dispositif microfluidique pour quantifier la motilité bactérienne via une matrice poreuse composée de piliers disposés aléatoirement. Des bactéries marquées par fluorescence sont introduites dans l’appareil, imagées au microscope au fur et à...

Évaluation de la motilité bactérienne à l’aide d’un dispositif microfluidique

Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Cet article décrit une méthode de transformation d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante 3D bactérienne qui peut faciliter l’impression de biofilms à motifs. Tous les aspects nécessaires de la préparation du bioimprimeur et de la bio-encre sont décrits, ainsi que des méthodes de vérification pour évaluer la formation de biofilms.

Modelage tridimensionnel de biofilms d’ingénierie avec une Bioimprimeur de bricolage

Un protocole pour la génération de paysages chimiques dynamiques par photolyse dans des configurations microfluidiques et millifluidiques est présenté. Cette méthodologie est appropriée pour étudier divers processus biologiques, y compris le comportement motile, l'absorption des nutriments, ou l'adaptation aux produits chimiques des micro-organismes, à la fois au niveau de la cellule unique et au niveau de la population.

Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

Les courbes révolutionnaires sont des outils efficaces pour étudier le transport des bactéries dans les médias poreux. Ici, nous introduisons des outils basés sur des dispositifs fluidiques en combinaison avec la microscopie et le comptage cytométrique de flux pour obtenir des BTCs.

Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales

Le goulot d'étranglement pour la microscopie électronique 3D cellulaire est l'extraction de caractéristiques (segmentation) dans des cartes très complexes de densité 3D. Nous avons développé un ensemble de critères, qui fournit des précisions sur l'approche de segmentation (manuel, semi-automatique ou automatique) est le mieux adapté pour différents types de données, fournissant ainsi un point de départ pour la segmentation efficace.

De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

Le collagène est une composante essentielle de l'ECM, et fournit des indices essentiels pour plusieurs processus cellulaires allant de la migration vers la différenciation et la prolifération. Pourvu ici est un protocole pour l'intégration des cellules dans les hydrogels de collagène 3D, et une technique plus avancée pour générer des matrices de collagène randomisées ou alignées à l'aide de microcanaux PDMS.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Ce protocole décrit comment préparer une matrice mixte 2D, constituée de gélatine et de collagène I, et une prise de collagène I 3D pour étudier les invadosomes linéaires. Ces protocoles permettent l'étude de la formation linéaire d'invadosome, l'activité de dégradation matricielle et les capacités d'invasion des cellules primaires et des lignées cellulaires cancéreuses.

Matrices 2D et 3D pour étudier la formation et l&#39;activité invadosome linéaire

Cartilage et peau analogues ont été bioprinted à l’aide d’un bioink de nanocellulose-alginate basé. Les bioinks ont été cellularized avant l’impression via une unité de mixage passive seule étape. Les constructions ont été démontrées pour être uniformément cellularized, ont la grande viabilité et présentent des marqueurs de différenciation favorables.

Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization

Ce protocole décrit la production du filament polycaprolactone (PCL) avec des microsphères de (PLA) d’acide polylactique embarqués qui contiennent decellularise matrices (DM) pour l’impression 3D de tissus structuraux des constructions de génie.

Nouveau procédé d’impression 3D Decellularise Matrices

Découvrez l'impression 3D de colonies bactériennes dans des matrices d'hydrogel granulaire pour étudier la motilité et la croissance de Vibrio cholerae et E. coli. Cette méthode révèle les effets de la taille des pores sur la propagation cellulaire.

Impression 3D de bactéries pour étudier la motilité et la croissance dans des milieux poreux 3D complexes

Explorer plus de vidéos