Name: Cultures de cellules neuronales de laplysie pour limagerie haute résolution des cônes de croissance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: Apprenez la culture de neurones bag cell d'Aplysia californica pour l'imagerie haute résolution des cônes de croissance. Ce protocole permet d'étudier la motilité neuronale et la dynamique du cytosquelette en détail.

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Nous tenons à remercier Ryan Maneri (Productions Huîtrier, LLC) pour le tournage de notre procédure et Rodney McPhail (Département des sciences biologiques, Université de Purdue) pour l&#39;aide à l&#39;édition de la vidéo de dissection. La recherche dans le laboratoire de Suter est soutenu par des subventions du NIH (R01 NS049233) et le Centre Bindley Bioscience à l&#39;Université Purdue à DMS

Solutions <ul><li> L15-ASW milieu de culture cellulaire (1L) <ul><li> 1 sachet de poudre à L15 </li><li> Ajouter 800 ml de H 2 O ultrapure </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> L-Glutamine 4 mM </li><li> Gentamicine 50 pg / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Ajuster le pH à 7,9 </li><li> Ajouter goutte à goutte CaCl2 9,3 mM (arrêt si précipités) </li><li> Ajouter H 2 O ultrapure à 1 l </li><li> Vérifiez osmolarité (950-1000 mmol / kg) avec osmomètre (pression de vapeur, Wescor # 5520) </li><li> Filtre 0,22 um en utilisant une unité de filtration à pression positive (Filtres: SVGV010RS Millipore) </li><li> Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à un mois </li></ul></li><li> Poly-L-lysine (70-150 kD) 200 pg / ml en solution stock stériles H 2 O ultrapure conservés à -20 o C </li><li> 0,5 M solution de MgCl2 </li></ul> Jour 1: Dissection de l&#39;aplysie ganglion abdominal Préparation de la solution enzymatique de dissociation <ol><li> Peser 90-10 mg de Dispase enzyme (Worthington, Cat: LS02111) dans un tube Eppendorf </li><li> Ajouter 900 pi de L15-ASW milieu de culture, et 100 pi de stériles H 2 O ultrapure </li><li> Mélanger et placer à température ambiante (RT) </li></ol> Dissection de ganglion abdominal <ol><li> Remplir une seringue de 50 ml avec 0,5 M de solution de MgCl2. </li><li> Prendre un animal de réservoir, la poignée doucement pour éviter de réponse animal encrage de la défense. </li><li> Placez le aplysie sur le côté sur une planche à dissection (styromousse bord), côté rostrale à la droite, côté caudale vers la gauche. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans les animaux juste derrière la tête et injecter toutes les solution de MgCl2 dans la cavité du corps. </li><li> Frottez doucement l&#39;animal pour disperser la solution de MgCl2 à travers la cavité du corps, attendre quelques minutes pour que l&#39;animal soit complètement anesthésiés. </li><li> Epingler la tête et la queue de l&#39;animal au conseil d&#39;administration de dissection avec deux aiguilles. </li><li> Utilisez une pince pour soulever la peau, couper à travers la peau et la couche musculaire avec de grands ciseaux vers la tête et la queue pour faire une grande ouverture sur le côté. </li><li> Trouvez le ganglion abdominale sous l&#39;ovaire forme de brosse. Utilisez une pince pour tenir les nerfs reliant environ 1 cm en avant du ganglion abdominal, couper les nerfs avec des ciseaux de dissection en avant de la position Davier et derrière le ganglion abdominal. </li><li> Ganglionnaires Placer dans la solution Dispase et incuber pour 15-16 h à 22 ° C en utilisant un bain d&#39;eau à température contrôlée. </li></ol> Jour 2: Placage de cellules sac aplysie Préparation poly-lysine lamelles <ol><li> Dans un banc de flux, préparer trois boîtes de Pétri de 35mm que le travail des plats pour la dissection du ganglion, les remplir avec 4 ml L15-ASW moyenne chacun. Transfert du ganglion abdominal de la solution de dispase à l&#39;un des plats ouvrables après 15,5 heures de digestion. </li><li> En utilisant des pinces de prendre nettoyés à l&#39;acide # 1.5 lamelles (22x22 mm) conservés dans l&#39;éthanol, enlever l&#39;alcool et de stériliser des lamelles en les flamboyants brièvement sur un bec Bunsen. Laissez-les refroidir avant de placer brièvement les lamelles dans les boîtes de culture. </li><li> Préparer une astuce bordé courbe en pliant un bout jaune sur le brûleur Bunsen (flamme que brièvement pour éviter la fusion du plastique!). </li><li> Préparer la quantité appropriée de 20 ug / ml de poly-lysine solution en diluant 200 pg / ml de solution concentrée avec des stériles H 2 O ultrapure. </li><li> Couvrir chaque lamelle avec 500 ul de 20 ug / ml de poly-lysine et incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver chaque lamelle 3-5 fois avec 500 pl stériles H 2 O ultrapure chacun. </li><li> Enlevez l&#39;eau de lamelles, remplissez chaque plat avec 4 ml de milieu de culture L15-ASW. </li></ol> La dissociation des cellules sac <ol><li> Sous un microscope de dissection, couper le ganglion abdominal de moitié des ciseaux et des pinces à dissection à l&#39;aide préalablement nettoyé avec de l&#39;éthanol à 95% (figure 1 ligne 1). </li><li> Sur une moitié du ganglion, coupé entre la grappe de cellules sac et les cellules hemiganglion (figure 1 ligne 2), et couper les extensions nerveuses restantes de l&#39;autre côté du sac de cellules (figure 1 ligne 3). Travailler sur une moitié du ganglion à un moment, laisser l&#39;autre moitié dans le plat alors que les cellules du premier groupe sont plaqués. </li><li> En utilisant deux pinces (ou une pince et des ciseaux de dissection), pôle de la cellule communiqué sac en écartant la gaine de tissu conjonctif qui entoure la grappe des piles à sac. Coupez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection, si nécessaire. Attention à ne pas presser et toucher la grappe des piles à sac de trop pendant ce processus. </li><li> Quand la plupart des tissus conjonctifs est enlevé, le transfert de la bgrappe des piles ag dans un nouveau plat de travailler avec le bout plié jaune préparée plus tôt. Soyez prudent de ne pas laisser l&#39;amas de cellules valise soit emprisonné à l&#39;intérieur de la pointe jaune ou coincés à l&#39;interface air / support. </li><li> Triturer le cluster avec pointe jaune pour éliminer les cellules sac individuel. Pour ce faire, le cluster de pipetage dans et hors de la pointe. Commencez avec de faibles forces de cisaillement et d&#39;augmenter la force si nécessaire. Toujours utiliser le plus bas force nécessaire pour retirer les neurones sans tuer trop de cellules. </li><li> Recueillir 3-5 cellules saines sac et transférez-les dans un plat avec une lamelle poly-lysine. Éviter d&#39;aspirer des cellules mortes (elles sont noires / transparentes au centre) et des débris de tissu conjonctif. </li><li> Répétez l&#39;étape 6. et au lieu d&#39;environ 15-25 neurones vivants dans le centre de chaque lamelle. Si les cellules mortes ou des débris sont transférés ainsi, retirer le matériel indésirable par le ramasser ou de le souffle dans les cellules saines. Ce processus prend environ 2-3 heures pour les deux groupes. </li><li> Une fois terminé, laisser les boîtes de culture sur le banc de débit pendant au moins 2 heures à température ambiante pour permettre aux cellules de joindre (garder banc de flux de soufflerie pour éviter les vibrations hors indésirables). </li><li> Placez les plats dans un incubateur à 14 ° C pendant la nuit, ou jusqu&#39;à une utilisation ultérieure. Cônes de croissance peut se développer dans 4-10 heures. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Figure 1. Schéma d&#39;Aplysia californica ganglion abdominal. Couleur des lignes indiquent où couper pour obtenir des amas de cellules sac." /> Figure 1. Schéma d&#39;Aplysia californica ganglion abdominal. Couleur des lignes indiquent où couper pour obtenir des amas de cellules sac. Jour 3: Mise en place de chambre pour l&#39;imagerie des cellules vivantes sac aplysie Assemblée de l&#39;imagerie de chambre <ol><li> Avant d&#39;utiliser les cellules sac pour vivre des expériences d&#39;imagerie cellulaire, d&#39;inspecter les cellules sur un microscope de faible puissance. Si les cellules n&#39;ont pas développé les cônes de croissance saine, l&#39;approvisionnement en milieu frais et laisser à température ambiante pendant 1-2 heures. </li><li> Pour alimenter plaques avec le milieu L15-ASW frais, retirer la moitié (~ 2 ml) de milieu ancienne avec une ligne vide, et ajouter 2 ml de nouveaux L15-ASW milieu par boîte de Pétri. Il est important de ne pas supprimer complètement tous les moyens de l&#39;antenne tout à la fois, car cela élimine les cellules de la lamelle. </li><li> Pour l&#39;imagerie cellulaire sac, nous assembler deux lamelles et deux entretoises en plastique dans une chambre d&#39;imagerie sandwich. La lamelle supérieure dans le sandwich est coupé plus court pour permettre un échange facile des moyennes et des réactifs. Lors du montage, des lamelles avec des cellules sac attaché doit être immergé dans L15-ASW moyenne, en tout temps pour empêcher les cellules de déloger. </li><li> Pour préparer la chambre, coupé ~ 2mm du côté droit d&#39;un mm lamelles # 1 22x22 avec le diamant stylo (coupe-verre) et la règle. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml, appliquer de la graisse sous vide poussé à deux côtés de la plus courte lamelle, et joindre entretoises en plastique de chaque côté. Appliquer de la graisse à vide au sommet de deux entretoises. </li><li> Inversez la lamelle et l&#39;entretoise, puis placer en boîte de Pétri contenant des cellules sac sur une lamelle. Aligner et appuyez doucement pour coller la lamelle de haut en bas avec la lamelle la fin inversée de deux Q-tips. </li><li> En utilisant des pinces, soulever délicatement assemblage en sandwich de la boîte de Pétri, sans le support fuite. Alignez les deux lamelles, si nécessaire, et essuyez l&#39;excédent avec un support Kimwipe. Placez le sandwich sur la partie inférieure de la porte lame de microscope et fixer le couvercle avec soin en utilisant des clips. </li><li> Nettoyez le centre de la face supérieure du sandwich avec Q-tips dans tamponné nettoyant à vitres (Sparkle est utilisé comme nettoyant pour vitres). Vite sécher le nettoyant à vitre avec une seconde, coton tige sec pour éviter les lignes série. Faites de même pour la lamelle du bas. Nettoyer sans lamelles de lignes série sont importants pour l&#39;imagerie de haute qualité. </li></ol> Sac cellules au microscope Puisque les cultures de cellules aplysie sac de neurones sont à faible densité, il est préférable si votre configuration de microscope est doté de fonctions de positionnement scène pour faciliter le passage entre les cellules. Sac cellules peut être facilement conservé à température ambiante pendant plusieurs heures sur scène lors des expériences d&#39;imagerie. Bourse à moyen périodiquement pour éviter l&#39;évaporation.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Aplysie neurones cellulaires sac fournir un milieu sans sérum système neuronal de culture cellulaire avec très peu de cellules non-neuronales. Ces neurones forment des cônes de croissance très grand approprié pour aborder un certain nombre de questions importantes de cellules biologiques. Neurones cellulaires sac peut être facilement manipulé et imagée à la température ambiante pendant plusieurs heures. Utiliser fluorescent chatoiement de microscopie (FSM), on peut analyser quantitativement les différents paramètres de F-actine et la polymé...

<table><tbody><tr><td>Couvre-objets en verre #1 22x22 mm</td><td>Outil</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objets en verre #1,5 22x22 mm</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 35 mm</td><td>Outil</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour la filtration du milieu</td><td>Outil</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Graisse à vide haute performance</td><td>Outil</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre</td><td>Outil</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Calages en plastique</td><td>Outil</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>Milieu L15</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Réactif</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Réactif</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (70-150 kD)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Réactif</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>Protéase neutre (Dispase)</td><td>Réactif</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Cônes de croissance neuronale sont les structures très mobiles à la pointe des axones qui peut détecter des signaux de guidage dans l&#39;environnement et transduire cette information dans le mouvement directionnel vers la cellule cible appropriée. Pour bien comprendre comment les informations de guidage est transmis de la surface de la cellule à l&#39;dynamique sous-jacente des réseaux du cytosquelette, on a besoin d&#39;un système modèle approprié pour l&#39;imagerie de cellules vivantes de la dynamique des protéines à résolution temporelle et spatiale élevée. Typiques des cônes de croissance de vertébrés sont trop petits pour analyser quantitativement F-actine et la dynamique des microtubules. Les neurones de la californica lièvre de mer Aplysia sont 5-10 fois plus grandes que les neurones des vertébrés, peuvent facilement être conservés à température ambiante et sont des cellules très robuste pour la micromanipulation et de mesures biophysiques. Leurs cônes de croissance ont de très défini régions cytoplasmiques et d&#39;un système bien décrit cytosquelette. Les corps cellulaires des neurones peut être microinjectés avec une variété de sondes pour étudier la motilité du cône de croissance et d&#39;orientation. Dans le présent protocole, nous démontrons une procédure pour la dissection du ganglion abdominal, la culture cellulaire des neurones sac et mise en place d&#39;une chambre d&#39;imagerie pour l&#39;imagerie de cellules vivantes des cônes de croissance.

Aplysia californica neurones de développer des cônes de croissance important dans la culture qui sont excellents pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité du cône de croissance et d&#39;orientation. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et le placage de neurones cellulaires aplysie sac ainsi que pour la mise en place d&#39;une chambre pour l&#39;imagerie de cellules vivantes.

Cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Les cônes de croissance neuronaux sont les structures hautement mobiles situées à l'extrémité des axones, capables de détecter les signaux de guidage dans l'environnement et de transduire cette information...

Dans le laboratoire factice, nous cultivons des neurones du ganglion abdominal de la mollusque marine Aplysia californica. Ces neurones émettent des cônes de croissance très volumineux, ce qui en fait un excellent système modèle pour des études à haute résolution de la motilité et du guidage des cônes de croissance, en particulier pour l'analyse des dynamiques du cytosquelette. Dans cette vidéo, nous démontrons comment réaliser une dissection d’Aplysia et une culture de cellules abdominales.Bonjour, je suis Daniel Suter du Département des sciences biologiques de l'Université Purdue. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de dissection, de culture et d'imagerie des neurones des cellules de la crête neurale. Les neurones provenant de C, her apia CAA ont été largement utilisés pour des études sur l'apprentissage et la mémoire.Étant donné qu'Apia possède un système nerveux simple et de grands neurones adaptés à l'électrophysiologie, nous utilisons ces neurones dans notre laboratoire car leurs cônes de croissance sont grands et très adaptés à l'imagerie haute résolution des dynamiques protéiques liées à la motilité et au guidage des cônes de croissance. Le protocole complet comprend les étapes suivantes.Le premier jour, l'animal est sacrifié et disséqué afin d'obtenir les ganglions abdominaux. Le deuxième jour, les plaques de culture sont préparées. Les groupes cellulaires dorsaux sont disséqués et les neurones individuels sont mis en culture.Le troisième jour, une chambre d'imagerie pour l'acquisition d'images en laps de temps des cellules par microscopie à contraste d'interférence différentielle (DIC) est mise en place, avec démonstration et commentaire. La procédure d'aujourd'hui sera réalisée par iTune Lee, étudiante diplômée dans mon laboratoire. Elle va maintenant vous montrer comment préparer des neurones de cellules souches.Commençons. Les neurones des cellules postérieures font partie du ganglion abdominal du système nerveux de la plegia ; nous allons donc disséquer l'ensemble du ganglion abdominal pour une digestion enzymatique. Ensuite, nous séparerons les deux groupes de cellules en sac du reste du ganglion.Le ganglion abdominal sera digéré dans cette solution de phase deux pendant 15 à 16 heures afin de relâcher les tissus conjonctifs. Nous devons maintenant préparer une grande seringue de 60 millilitres remplie de chlorure de magnésium à 0,5 molaire pour sacrifier l'animal, ainsi que des outils de dissection propres : une pince à dissection, des ciseaux et de grands ciseaux. Nous utilisons des Aplysia californica provenant de la côte californienne, qui pèsent environ 150 grammes.Nous conservons les animaux dans un vivier à homards pendant un maximum de trois à quatre semaines. L'animal est injecté près de la tête, dans la cavité corporelle, avec la solution de chlorure de magnésium. Frotter l'animal aide à répartir la solution et empêche les contractions.Épingler l'animal par la tête et la queue sur une planche en polystyrène à l'aide d'aiguilles de seringue. Soulever le muscle de la paroi corporelle avec une pince et ouvrir la cavité corporelle à l'aide de grands ciseaux. Ensuite, inciser la paroi corporelle sur le côté de la tête à la queue et épingler le muscle sur la planche.Ensuite, il faut localiser le ganglion abdominal sous l'ovaire, un organe jaunâtre ayant l'aspect d'un pinceau. Le ganglion abdominal peut être identifié. Détacher le ganglion en sectionnant les nerfs à l'aide des ciseaux de dissection sur les côtés antérieur et postérieur du ganglion.Ensuite, transférez le ganglion dans un tube à essai contenant un millilitre de la solution de dissociation et placez-le dans un bain-marie à 22 degrés pendant 15,5 heures. Pendant cette incubation, le tissu conjonctif se relâchera suffisamment pour que les amas cellulaires postérieurs puissent être facilement retirés. Avant de commencer la culture des cellules postérieures, nous préparerons les lamelles sur lesquelles les neurones seront cultivés.Nous cultivons des neurones de cellules dorsales sur des lamelles recouvertes de lyine, placées dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres. Elles sont ensuite immergées dans un milieu L 15 A SW, un milieu de culture riche en sels. Pour ce type de cellules, nous préparons généralement huit à dix boîtes de Pétri contenant des lamelles par animal.Abordons maintenant les outils utilisés pour la mise en place des neurones des cellules en sac. Pour la dissection des groupes de cellules en sac, nous aurions besoin de trois boîtes de Pétri sans lame de couverture, remplies de L 15 A SW, de pinces et de ciseaux stérilisés à l'alcool, ainsi que d'une pipette P 20 munie d'une pointe jaune recourbée. La pointe jaune est chauffée en la passant rapidement au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen, puis recourbée à l'aide de pinces.Veillez à ne pas écraser la partie incurvée. Sinon, l'amas de cellules bag pourrait s'y coincer par la suite. La dissection et la mise en place des cellules bag de plegia s'effectuent à température ambiante sous microscope stéréoscopique.Maintenant que l'incubation enzymatique de 15,5 heures est terminée, nous pouvons transférer le ganglion abdominal de l'espace du disque vers l'un des compartiments de travail contenant le milieu L 15 A SW. Avant de montrer comment les cellules en sac sont isolées, examinons d'abord le schéma. Pour visualiser la dissection du ganglion abdominal, nous commençons par couper le ganglion abdominal en son centre.Comme vous pouvez le voir sur cette ligne. Nous effectuons ensuite deux incisions à l'avant et à l'arrière du dos. Ainsi, l'agencement est celui que vous voyez ici.En observant maintenant à travers le stéréomicroscope, vous pouvez voir que le ganglion abdominal est sectionné au centre et que deux incisions ont été réalisées, respectivement à l'avant et à l'arrière du groupe cellulaire postérieur. Ensuite, nous utilisons une pince pour repérer une ouverture dans le tissu conjonctif et repoussons délicatement la gaine de tissu conjonctif entourant le groupe de cellules en sac. Retirez le tissu conjonctif du groupe en un seul morceau, si possible, à l’aide des ciseaux de dissection.Mais faites attention à ne pas endommager l'amas de cellules bag. À l’aide d’un embout courbé contenant du milieu, transférez délicatement l’amas de cellules bag vers un autre plat de travail. Dissociez délicatement l’amas de cellules bag à l’aide d’un embout jaune afin de détacher les cellules bag individuelles de l’amas.Pour ce faire, aspirez l'amas dans la pointe de pipette et expulsez-le sans provoquer de bulles d'air. Transférez les cellules vivantes de l'amas vers des boîtes contenant des lamelles recouvertes de poly. Les cellules mortes apparaissent noires au centre, tandis que les cellules vivantes sont blanches.Il est important de placer les cellules au centre du lamelle pour la microscopie et d'éliminer tout débris cellulaire et toutes cellules mortes dès que possible. En prélevant le matériel indésirable ou en le soufflant, les cellules saines s'attacheront rapidement à la plaque de polylysine. Environ 15 à 25 cellules par lamelle.Lorsque toutes les cellules du premier groupe ont été positionnées, on retire le tissu conjonctif du deuxième groupe et on poursuit selon la même procédure de mise en place des cellules. Une fois toutes les plaques terminées, les laisser reposer à température ambiante sur le plan de travail pendant au moins deux heures afin de permettre une bonne adhérence des cellules, tout en évitant toute vibration. Ensuite, placer les boîtes sur un plateau en polystyrène ou en plastique et les transférer dans un incubateur à 14 degrés avant toute utilisation ultérieure.Nous réalisons généralement l'imagerie des cônes de croissance plegia un ou deux jours après la mise en culture. Pour l'imagerie en conditions vitales de la dynamique des cônes de croissance neuronaux, nous fabriquons une petite chambre d'imagerie composée de deux lamelles séparées par des entretoises en plastique. La lamelle inférieure porte les neurones qui y sont attachés.Le couvre-objet supérieur est raccourci à l’aide d’un stylo à pointe de diamant afin de permettre un échange facile du milieu. Sur la platine du microscope, le sandwich de couvre-objets est ensuite placé dans un support sur mesure destiné à être monté sur le microscope. De la graisse à vide est utilisée pour maintenir les éléments de la chambre solidement assemblés sans fuite de milieu. À l’aide d’une petite seringue, de la graisse à vide est appliquée sur le couvre-objet supérieur, puis nous utilisons une pince pour positionner les entretoises et appliquer ensuite une couche de graisse à vide par-dessus.Ensuite, nous prenons l'ensemble, le retournons et l'appuyons délicatement sur la lame couvre-objet contenant les cellules, toujours immergée dans la boîte. Utilisez des coton-tiges pour aligner les lames couvre-objets et appuyer sur la lame supérieure sans la casser. Puis, nous retirons soigneusement le « sandwich » de la boîte, essuyons tout excès de milieu et le plaçons sur la base du support.Placer le préparat entre les deux lames dans le porte-objet sans fissurer la lame couvre-objet par pression. Nettoyer les deux lames couvre-objets avec un nettoyant pour verre sans trace appliqué sur un coton-tige, et nous préférons utiliser ce produit car il laisse moins de traînées sur le verre. Nettoyer la lame couvre-objet avec un mouvement circulaire en partant du centre, puis passer immédiatement un coton-tige sec pour éviter les traînées.Un verre propre et recouvert est très important pour une imagerie de haute qualité, particulièrement avec des optiques DIC. Les cultures neuronales de cellules Plegia dorsales sont des cultures de faible densité, il sera donc très utile que votre microscope dispose de fonctions de positionnement de la platine permettant un changement facile entre différentes cellules. Nous sommes maintenant prêts à observer la morphologie et la motilité du cône de croissance.Nous visualisons la croissance en morphologie et en motilité à l'aide d'une imagerie différentielle par contraste interférentiel (DIC) en laps de temps à haute résolution. L'imagerie DIC est utile pour cette application car elle fournit une vue de surface de la structure du cône de croissance dans ce film en laps de temps DIC 60 X. On peut clairement observer les trois domaines d'un cône de croissance typique.Le domaine périphérique, composé de l'affect enrich la mela podia et des op podia. La zone de transition, caractérisée par une activité de ruffling, et le domaine central, qui contient principalement des microtubules et des organites. Pour étudier les mécanismes de la direction de croissance, nous avons mis au point le test d'interaction par billes retenues (RBI). Dans ce test.Des microbilles revêtues de protéines artésiennes sont utilisées pour imiter des substrats cibles cellulaires. La bille est placée sur le domaine périphérique du cône de croissance à l’aide d’une micropipette dans la vidéo en microscopie différentielle interférentielle (DIC) en prise de vue instantanée. On peut observer un effet et un flux rétrogrades grâce à des ondes se déplaçant en sens rétrograde dans le domaine central.Les organites se déplacent sur les microtubules. Après une période initiale au cours de laquelle aucun changement significatif ne se produit, on observe un mouvement soudain en avant de la limite du domaine central vers la perle retenue. Un accompagnement par la croissance du bord antérieur et l'augmentation de la tension, en plus d'un effet d'atténuation du flux et d'allongement des microtubules, peut être observé spécifiquement le long de l'axe d'interaction avec la perle.Pour analyser la dynamique du cytosquelette dans les cônes de croissance, nous utilisons la microscopie à taches fluorescentes. Nous injectons par microinjection des sondes de tubuline et d'actine marquées fluorescentes dans le corps cellulaire neuronal et réalisons des films en prise de vue instantanée. Parmi les mouvements dynamiques du cytosquelette, la structure indiquée en rouge s'assemble le long du bord antérieur, est entraînée vers l'arrière par le flux rétrograde et recyclée dans la zone de transition.Les microtubules dynamiques, montrés en vert, explorent la périphérie par une combinaison de comportements d'assemblage et de translocation. La faible intensité de marquage donne lieu à un motif tacheté, ce qui nous permet d'analyser quantitativement divers paramètres de la dynamique du cytosquelette. Nous vous avons montré comment réaliser la dissection, la culture et l'imagerie de cellules en coin, si vous souhaitez effectuer une imagerie à haute résolution des cônes de croissance neuronale.C'est vraiment le système à utiliser en raison de la grande taille des cônes de croissance, des régions cytoplasmiques bien définies et du cytosquelette bien décrit. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l'efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de...

Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l&#39;efficacité synaptique dans le mollusque<em&gt; Aplysie</em

Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

Cette vidéo montre une évaluation in vitro de l’effondrement du cône de croissance neuronale par des agrégats de β amyloïde (Aβ). Le traitement des neurones avec des agrégats Aβ provoque une déstabilisation du cytosquelette, entraînant l’effondrement des cônes de croissance à l’extrémité des axones. Les cellules traitées sont comparées à des cellules témoins pour évaluer l’étendue de l’effondrement du cône de croissance.

Évaluation in vitro de l’β amyloïde agrégée sur l’effondrement du cône de croissance neuronale

Nous décrivons la dissection du système nerveux du lièvre marin...

Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.

Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

Ici, nous avons décrit un protocole pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux d’axone (AIS) des neurones hippocampiques qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’un ankyrin-G géant.

Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Apprenez la culture de neurones bag cell d'Aplysia californica pour l'imagerie haute résolution des cônes de croissance. Ce protocole permet d'étudier la motilité neuronale et la dynamique du cytosquelette en détail.

Cultures de cellules neuronales de l'aplysie pour l'imagerie haute résolution des cônes de croissance

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