Name: Ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez la préparation de milieux anaérobies pour la culture de micro-organismes fastidieux issus de l'environnement. Cette méthode basée sur la technique Hungary modifiée facilite l'étude de la matière microbienne noire.

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Les auteurs tiennent à souligner la lignée d’information et de mentorat qui a influencé/fait évoluer ces techniques au fil des ans. Le Dr Hamilton-Brehm, en tant qu’ancien étudiant diplômé, postdoctorant et professeur actuel, a une dette de gratitude envers ceux qui ont pris le temps d’enseigner les techniques anaérobies : le Dr Mike Adams, le Dr Gerti Schut, le Dr Jim Elkins, le Dr Mircea Podar, le Dr Duane Moser et le Dr Brian Hedlund. The Nature Conservancy et American Rivers ont soutenu ce travail par le biais des subventions G21-026-CON-P et AR-CE21GOS373, respectivement. Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de Nature Conservancy ou d’American Rivers. Ce travail a été soutenu par une subvention du SIU Advanced Energy Institute, qui remercie le financement accordé par l’intermédiaire de l’Advanced Energy Resource Board. NGS a été réalisé par LC Sciences.

MÉTHODE ANAÉROBIE SIMULÉE IN SITU POUR LA CULTURE DE MICROBES ENVIRONNEMENTAUX

<ol><li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li>
<li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22MSystems%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055(2018).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+biological+%26%2334%3Bdark+matter%26%2334%3B+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissecting biological &#34;dark matter&#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li>
<li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the%27omics%27+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+unculturable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li>
<li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands%3A+Knowledge+gained+and+remaining+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184(2011).</li>
<li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%26%2334%3B+uncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating&#34; uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012(2011).</li>
<li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li>
<li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogens%3A+Reevaluation+of+a+unique+biological+group%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li>
<li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).</li>
<li>Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013).</li>
<li>Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018).</li>
<li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a%7E+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535(2020).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.%2C+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224(2019).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.%2C+an+anaerobic%2C+extremely+thermophilic%2C+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.%2C+a+hyperthermophilic%2C+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li>
<li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

La section de production moyenne de ce protocole (section 1) doit sa structure à la technique Hungate modifiée de Miller et Wolin17, qui a été largement utilisée depuis sa publication. L’aspect pratique de ce protocole élargi vient de sa nature descriptive et de son appariement avec l’acquisition in situ de micro-organismes. Des flacons de culture contenant des milieux de simulation et de respect de l’environnement ont été utilisés pour cultiver avec succès les anciens membres de la « matière noire microbienne » suivants acquis in situ : la bactérie anaérobie souterraine Thermoanaerosceptrum fracticalcis souche DRI1318, la souche SIUC1 de Caldiatribacterium inferamans (numéro d’acquisition MT023787 ; manuscrit en préparation) et Anaerothermus hephaesti SIUC3 (numéro d’identification MK618647 ; manuscrit en préparation) et la souche non caractérisée DRI14 de la bactérie anaérobie souterraine (numéro d’identification KR708540).
L’un des objectifs de ce protocole est qu’il est conçu pour être hautement adaptable aux environnements anaérobies de surface et souterrains et aux micro-organismes. Premièrement, la composition du médium est encouragée à être modifiée pour refléter la composition de l’environnement d’intérêt. Par exemple, 3 000 mg/L de NaCl peuvent être ajoutés à la recette lors de la simulation d’un environnement avec des concentrations ioniques de 3 000 mg/L pour le Na+ et le Cl- ; ou 650 mL de sable et 650 mL de schiste peuvent être placés dans le bioréacteur lors de la simulation d’un environnement avec un rapport volumique de 1:1 entre le grès et le schiste. Deuxièmement, la composition du milieu peut être modifiée pour favoriser la croissance de micro-organismes d’intérêt spécifiques. En particulier, les médias naïfs comme les trois médias de cet article sont prêts et dépendants de telles modifications. Des exemples de sources de carbone et d’énergie comprennent le fumarate18, la peptone18, la matière organique contenant de la cellulose19, l’acétate20, l’extrait de levure19,20, le xylitol (souche SIUC1), le formiate (souche SIUC3) et d’autres sources potentielles telles que le H2/CO2, le citrate et le glucose. Enfin, la composition du milieu peut être modifiée en fonction de l’étude souhaitée. Par exemple, l’intérêt principal de l’étude décrite dans la section des résultats représentatifs était de découvrir comment des microorganismes anaérobies souterrains représentatifs réagiraient à un lisier organique mixte unique (un coulis d’épis de maïs traité par OHD13,14) ; Ainsi, sa recette contenait cette source de carbone au lieu d’options plus conventionnelles. D’autres modifications potentielles pour des études spécifiques comprennent l’ajout de plastiques, d’acides et de métaux lourds, ou d’autres xénobiotiques pour les études de biorestauration ; l’ajout de polymères carbonés récalcitrants tels que la cellulose et les plastiques pour les études de produits dépolymérisés à valeur ajoutée ; et l’ajout de fumier et de déchets végétaux pour le compost à petite échelle et d’autres études agricoles.
Si l’analyse post-réductrice d’un milieu est souhaitée, comme les mesures du pH, du potentiel d’oxydoréduction (ORP) et de l’oxygène dissous (OD), cela peut être accompli indirectement en sacrifiant un nombre représentatif de bouteilles de milieu pour comprendre en toute confiance le caractère de ce lot. Lors de l’exposition d’un flacon de milieu scellé à l’air, il est fortement recommandé de prendre les lectures de l’ORP et de l’OD sous 1 minute à l’ouverture. Les mesures non dépendantes de l’oxygène (p. ex., pH) peuvent être prises de manière non urgente après l’ouverture initiale. Les micro-organismes anaérobies exigeants nécessitent généralement des valeurs ORP < -200 mV pour se développer. Si le milieu donne une valeur ORP de > -200 mV et/ou des valeurs d’OD >0,40 mg/L), on peut utiliser du Na2S (0,1-0,2 g/L) ou un autre réducteur (p. ex., citrate de titane, L-cystéine, acide ascorbique) pour réduire davantage le milieu.
La résazurine est souvent utilisée comme indicateur d’oxygène (comme dans ce protocole) ; cependant, il s’agit plus précisément d’un indicateur redox21, indiquant la présence d’oxygène indirectement lorsque l’oxygène modifie le potentiel redox d’une solution. La résazurine en solution apparaît initialement de couleur bleue. Lors de l’exposition à des agents réducteurs, la solution prend une couleur rose irréversible. Lorsque la solution est encore réduite, elle devient incolore de manière réversible et redevient rose lors de l’oxydation. Les auteurs ont observé des cas où les milieux réduits contenant de la résazurine sont passés du bleu au rose mais n’ont pas réussi à passer à l’incolore. Cependant, les auteurs ont également observé que ces milieux deviennent souvent incolores après l’autoclavage, et que l’augmentation du temps passé à faire bouillir et à rincer le milieu permet généralement à la resazurine de passer à sa forme incolore après l’ajout de réducteurs. Si vous le souhaitez, la concentration d’oxygène dans le milieu peut être vérifiée avec une sonde à oxygène dissous.
Tous les matériaux nécessaires au fonctionnement de ces bioréacteurs et des bioréacteurs en verre sur mesure eux-mêmes ne dépassaient pas ~ 5 000 $ (cela suppose que des équipements de soutien sont déjà disponibles tels que des bains-marie, des pompes et des incubateurs). Ces techniques de culture anaérobie sont économiquement économiques, par rapport aux bioréacteurs automatisés commerciaux qui peuvent commencer à 10 000 > $. De plus, de nombreux bioréacteurs commerciaux passent à des conteneurs de réacteur à usage unique, ce qui modifie la dynamique de comparaison et n’est pas rentable pour les petits laboratoires de recherche et les universités de remplacer continuellement. De plus, les systèmes commerciaux peuvent avoir des biais chimiques de fabrication (provenant des plastiques utilisés, de la graisse sur les joints d’étanchéité/raccords ou de l’eau traitée chimiquement) qui affecteront le succès de la croissance de micro-organismes fastidieux. Le faible coût, la personnalisation et la polyvalence pour collecter un échantillon environnemental anaérobie, en combinaison avec un milieu informé qui peut être inoculé, ce qui permet de générer des enrichissements pour l’étude, augmentent considérablement les chances d’acquérir des micro-organismes uniques.

La plupart des micro-organismes restent non cultivés ; Ceci est soutenu par la grande disparité entre les cellules observée par microscopie contrastée par les quelques micro-organismes cultivés avec succès à l’aide de plaques de gélose. Staley et Konopka ont nommé cette disparité « l’anomalie du grand nombre de plaques »1. La diversité non expliquée estimée est étayée par des données métagénomiques et métatranscriptomiques montrant de nombreux nouveaux genres répartis dans des courbes d’abondance de rang à partir de plusieurs environnements différents2. Les microorganismes qui ont été observés (généralement par séquençage aléatoire d’une communauté microbienne) mais qui n’ont pas été cultivés ont été appelés « matière noire microbienne »3,4.
À l’ère des micro-omiques, la culture de micro-organismes reste impérative pour évaluer pleinement les données génomiques et vérifier la fonction/phénotype des gènes présents. Le séquençage de micro-organismes cultivés reste le seul moyen d’obtenir avec certitude des génomes complets jusqu’à ce que des technologies telles que la métagénomique shotgun et les génomes assemblés par métagénome de l’environnement deviennent infaillibles5. Les évaluations génomiques associées à des micro-organismes cultivés fournissent des inférences solides pour comprendre la « matière noire microbienne ». De nombreux membres de la « matière noire microbienne » remplissent des fonctions cruciales qui ont un impact sur le cycle des nutriments et d’autres éléments et la production de produits naturels précieux, soutiennent les systèmes écologiques et fournissent des services écologiques. D’un point de vue médical, environ la moitié de tous les produits pharmaceutiques actuellement commercialisés sont des produits et des dérivés de produits issus de bactéries, et le profilage des espèces non cultivées est soupçonné de révéler les antibiotiques du futur. Pour accéder à cette majorité inculte, une variété de méthodologies de culture doit être augmentée6. Parmi les membres de la « matière noire microbienne », les micro-organismes oligotrophes anaérobies sont largement sous-déclarés et détiennent probablement des voies biochimiques précieuses sur le plan écologique et industriel7, ce qui en fait des cibles importantes de culture. Cependant, les microorganismes oligotrophes anaérobies sont plus difficiles à cultiver que leurs homologues aérobies et copiotrophes en raison des temps d’incubation souvent plus longs, des conditions fastidieuses (p. ex., des températures in vitro non standard particulières) et de l’utilisation de recettes de milieux spécialisés.
Les techniques actuelles de développement pour cultiver des membres de la « matière noire microbienne », y compris de nouveaux micro-organismes oligotrophes anaérobies, ont considérablement amélioré notre compréhension et augmenté la représentation de ces micro-organismes dans l’arbre phylogénétique. Les techniques actuelles utilisant des milieux éclairés pour la culture de nouveaux microorganismes (c.-à-d. des milieux obtenus à partir de la connaissance du ou des microorganismes d’intérêt) peuvent être séparées en trois méthodes distinctes. La première des méthodes consiste à retirer directement une section discrète de l’environnement pour la transférer dans une chambre de croissance in vitro qui contient déjà les micro-organismes d’intérêt dans une membrane. La section discrète (p. ex., l’eau de mer) fournit aux microorganismes d’intérêt l’habitat géochimique qu’ils utilisent in situ, tandis que la membrane arrête le mouvement des cellules (les cellules d’intérêt resteront à l’intérieur ; les cellules étrangères qui sont arrivées avec la section discrète resteront à l’extérieur). En incluant des composés naturellement disponibles pour cibler les micro-organismes dans leur habitat naturel, ces micro-organismes peuvent être cultivés8. La deuxième méthode utilise la métatranscriptomique ou la génomique pour élucider les capacités métaboliques, fournissant des indices pour affiner les paramètres de culture pour une conception de milieu ciblé. Cette approche fournit un profil écophysiologique qui peut être utilisé pour cibler l’enrichissement de types spécifiques de micro-organismes hors d’un environnement. Les dispositions du milieu sont adaptées aux gènes identifiés présents qui sont présumés soutenir le ou les micro-organismes ciblés afin de réduire la diversité de l’enrichissement,9,10. Une mise en garde est que l’information génomique ne déduit pas directement l’expression des gènes, contrairement à l’information transcriptomique.
La troisième méthode englobe les milieux protégés par l’environnement et simulés, distincts de la première, qui ne simule pas les milieux, mais utilise plutôt l’environnement directement comme source de milieu. Cette troisième méthode nécessite une reconnaissance environnementale de la géochimie d’un site de terrain contenant des microorganismes d’intérêt. Grâce à ces connaissances, les composants primaires et les paramètres physiques sont identifiés pour produire un milieu simulé tenant compte de l’environnement. Le milieu reçoit ensuite une perfusion directe de sédiments ou de liquides contenant des micro-organismes de l’environnement dans le milieu. Cette méthode est particulièrement utile dans les cas où le microbiologiste d’élevage n’a pas accès à des quantités suffisantes d’environnement source (comme pour la première méthode) ni à des données métatranscriptomiques ou génomiques appropriées (comme pour la seconde).
Le protocole suivant est un exemple de la troisième méthode ; il est informé par et vise à simuler des environnements d’intérêt. Trois recettes de milieux naïfs ciblant différentes cultures de micro-organismes anaérobies acquises sur le terrain sont présentées en parallèle au sein du protocole. Les trois cultures représentées sont des cultures mixtes provenant du sol (ci-après, culture mixte du sol), des cultures mixtes provenant d’un trou de forage (ci-après, culture mixte de forage) et un méthanogène isolé provenant de l’intérieur d’un trou de forage (ci-après, méthanogène isolé du trou de forage). Les identités et les quantités composées dans les recettes médiatiques partagées ici sont destinées à servir de guide de départ ; Ils peuvent et sont encouragés à être personnalisés en fonction de l’environnement du lecteur et des micro-organismes d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon de borosillicate de 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL avec embout coulissant</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture de 100 mL</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mm Sertisseuse à main</td><td>Aiguille Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 g Fisher</td><td>Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon borosilicate 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Joint en aluminium</td> Canule <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, longueur 31,5 cm</td> Canule <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, longueur 6 cm</td> Carotte <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Giddings Machine Company&nbsp ;</td><td></td><td>Assemblé à partir de pièces de l’entreprise</td></tr><tr><td>Collecteur à gaz</td><td>Swagelok</td><td></td><td>Assemblé à partir de nombreuses pièces différentes</td></tr><tr><td>Briquet</td><td>Lowe’s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gaz</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants en nitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc (pour bouteilles GL45)</td><td>Glasgeratebau OCHS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc (pour bouteilles de culture)</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante d’agitation</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo-éléments</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamines</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matériaux spécifiques au bioréacteur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 bouchon en caoutchouc</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc #7</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL avec embout Luer Lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 » Robinet à bille ardillon</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL avec embout Luer Lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de borosilicate</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr> Scientific <tr><td>5/16 » - 1/4 » adaptateur de tuyau cannelé montage d’une</td> seringue <td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mL avec embout Luer Lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 L borosillicate carbon</td><td>Allen Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connecteur de tuyau coudé pour GL14 open top cap</td><td>Ace Glass</td><td>7623-20</td><td></td></tr><tr><td>Balloon</td><td>Party City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate bioreactor</td><td>Allen Scientific Glass</td><td></td><td>Sur mesure sur demande</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Lowe’s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femelle luer lock adaptateur coupleur</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 capuchon à dessus ouvert</td><td>Ace Glass</td><td>7621-04</td><td></td></tr><tr><td>GL18 capuchon à dessus ouvert</td><td>Ace Glass</td><td>7621-08</td><td></td></tr><tr><td>GL45 capuchon à dessus ouvert</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTFE face en silicone septum pour GL14 capuchon à dessus ouvert</td><td>Ace Verre</td><td>7625-06</td><td></td></tr><tr><td>Septum en silicone recouvert de PTFE pour GL18 capuchon supérieur ouvert</td><td>Ace Glass</td><td>7625-07</td><td></td></tr><tr><td>Support d’anneau</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collier de chaîne de support</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring Collier de serrage</td><td></td> Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone ; 1/4 « id, 1/2 » od</td><td>Grainger</td><td>55YG13</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone ; 3/16 » id, 3/8 » od</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raccord de tuyau droit pour GL14 capuchon supérieur ouvert</td><td>Ace Glass</td><td>7623-22</td><td></td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à trois voies</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à deux voies</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-pompe à débit variable Ultra low flow</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher Septum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>en caoutchouc blanc pour tubes de 13-18 mm od</td><td>Ace Glass</td><td>9096-49</td><td></td></tr><tr><td>Fil</td><td>Lowe’s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zip tie</td><td>Lowe’s</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

La recherche de microorganismes anaérobies dépendante de la culture repose sur la compétence méthodologique. Ces méthodes doivent créer et maintenir des conditions de croissance appropriées (p. ex., pH et sources de carbone) pour les microorganismes anaérobies tout en permettant d’extraire des échantillons sans compromettre l’environnement artificiel. À cette fin, les méthodes qui s’inspirent d’un environnement in situ et le simulent peuvent être d’une grande aide pour cultiver des micro-organismes de cet environnement. Ici, nous décrivons une méthode anaérobie in situ informée et simulée pour la culture de micro-organismes terrestres de surface et souterrains, en mettant l’accent sur la collecte d’échantillons anaérobies avec un minimum de perturbation. Ce protocole détaille la production d’un milieu liquide anaérobie personnalisable, ainsi que l’acquisition environnementale et la croissance in vitro de micro-organismes anaérobies. Le protocole couvre également les composants critiques d’un bioréacteur anaérobie utilisé pour les simulations environnementales de sédiments et de milieux liquides anaérobies pour les cultures acquises dans l’environnement. Nous avons inclus des données préliminaires de séquençage de nouvelle génération d’un microbiome maintenu pendant la durée de vie d’un bioréacteur où la culture active s’est ajustée dynamiquement en réponse à une source de carbone expérimentale.

Nous présentons ici les résultats d’une étude de bioréacteur utilisant une méthode de préparation de milieu de culture mixte de forage et une méthode de configuration de bioréacteur comme décrit ici. Le milieu de culture mixte du forage a été modifié pour contenir comme source de carbone une boue d’épis de maïs traitée par dissolution hydrothermale oxydative (OHD)13,14. Un milieu de culture mixte de forage modifié a été pompé dans le bioréacteur pendant 44 jours à un débit de 0,4 mL/min. Le jour 23, un inoculum provenant du forage BLM-1 dans la région de la Vallée de la Mort au Nevada, aux États-Unis, a été ajouté15. Des échantillons liquides du bioréacteur ont été prélevés dans une bouteille de récupération d’échantillonnage les jours 1, 8, 15, 22, 23 (après l’inoculation), 30, 37 et 44.
Pour suivre l’état général de la culture d’inoculum (et des habitants survivants des sédiments du bioréacteur ayant survécu à l’autoclave avant l’inocuculum), des échantillons de liquide du bioréacteur ont été observés par comptage cellulaire direct. Le comptage direct des cellules du liquide échantillonné a été effectué avec un hémocytomètre Petroff-Hauser. Pour connaître l’identité des membres microbiens du bioréacteur, l’ADN a été extrait d’échantillons liquides du bioréacteur et les gènes de l’ARNr 16S ont été analysés par séquençage de nouvelle génération (NGS). Les données NGS ont été traitées en interne à l’aide de mothur conformément à la SOP16 de MiSeq.
Avant l’inoculation, le nombre de cellules directes était souvent inférieur à la limite de détection (BDL) de 1,0 × 106 cellules/ml. Le jour 23 (après l’inoculation) avait un faible nombre de cellules de 2,6 × 106 cellules/ml, tandis que les jours suivants 30, 37 et 44 avaient un nombre de cellules supérieur à 1,0 × 107 cellules/mL (figure 3). Bien que le nombre de cellules ait été b.d.l. aux jours 1, 8 et 22, l’ADN a été extrait pour le NGS à chaque point temporel, indiquant une présence basale de micro-organismes pré-inoculum dans les sédiments, même après autoclavage. Le genre principal présent (déterminé par le nombre de lectures dans chaque unité taxonomique opérationnelle (OTU)) était stable aux jours 8, 15 et 22, et a été identifié comme Geobacillus. Après l’inoculation de l’inoculum BLM-1 au jour 23, Geobacillus n’a plus dominé et de nouveaux genres majeurs sont apparus avec une multitude de genres mineurs présents, qui pour la plupart ont maintenu une présence jusqu’à la fin de l’étude (Figure 4). Nous en concluons que l’inoculum BLM-1 était une culture active et dynamiquement changeante dans le bioréacteur.
Une étude supplémentaire des données NGS a révélé des membres de la « matière noire microbienne ». Les UTO dont le nom taxonomique est attribué contenant les mots « non classé » ou « non cultivé » ont été utilisées comme substitut des UTO contenant des membres de la « matière noire microbienne ». Les données du NGS ont été recueillies pour le jour 44 (le dernier jour après l’inoculation avec des microorganismes du trou de forage BLM-1) et filtrées pour ne pas contenir d’UTO qui avaient des lectures dans les données de pré-inoculation (jours 1, 8, 15 ou 22), car ces UTO n’étaient probablement pas dans l’inoculum. Les données filtrées du 44e jour du NGS contenaient 1 844 UTO et 3 396 lectures. Parmi ceux-ci, 366 UTO (20 %) et 925 lectures (27 %) n’étaient pas classifiées au niveau de l’embranchement, et 1252 UTO (68 %) et 2357 lectures (69 %) n’étaient pas classées ou non cultivées au niveau du genre. Bien qu’à court terme, cette étude pilote soutient le potentiel d’un bioréacteur avec des milieux respectueux de l’environnement pour cultiver des membres de la « matière noire microbienne ».
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma d’un bioréacteur en borosilicate conçu sur mesure et utilisé pour la culture anaérobie. (A) Vue du bioréacteur d’un côté. (B) La rotation de A de 90° (dans le sens des aiguilles d’une montre) autour de l’axe z donne la vue). (C) Une vue de dessus du bioréacteur. La conception à double enveloppe permet de contrôler la température avec de l’eau ou de l’huile. Les deux ports de la veste peuvent être vus sur le côté droit de la vue en B. La chambre intérieure peut être remplie de sédiments de tout type ou laissée vide de sédiments pour la culture planctonique. Trois orifices d’échantillonnage (vus sur le côté droit de la vue en A) permettent d’enlever de la matière à différentes profondeurs de la colonne du bioréacteur. Les ouvertures standard 45, 18 et 14 GL peuvent être scellées à l’aide de septa en téflon ou en butyle qui maintiendront un joint étanche au gaz pendant 1 à 6 mois. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig02.jpg"> Figure 2 : Assemblage du bioréacteur actif. La verrerie présentée sur la photo de gauche à droite est (A) une tourie de 8 L, (B) un bioréacteur (voir la figure 1) et (C) une bouteille de récupération sans prélèvement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig03.jpg"> Figure 3 : Nombre direct de cellules à partir de l’étude du bioréacteur. Les populations microbiennes à l’intérieur du bioréacteur ont été surveillées à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire à hémocytomètre Petroff-Hauser de 0,02 mm. L’inoculum a été ajouté au début du jour 23. Le nombre de cellules pour les jours 1, 8 et 22 était inférieur à la limite de détection. La limite de détection effective de la numération cellulaire directe est de 1 × 106 cellules/mL. Abréviation : b.d.l. = en dessous de la limite de détection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig04.jpg"> Figure 4 : Séquençage de nouvelle génération du bioréacteur. Les UTO sont représentées dans des graphiques à barres empilées indiquant le pourcentage de lectures appartenant à des UTO uniques à chaque point temporel de l’étude du bioréacteur. Des UTO uniques ont été attribuées à leur taxonomie associée à un seuil de genre. Le genre « Autre » est défini comme tous les genres dont le nombre de lectures est inférieur à 10 % à chaque point temporel. Le nombre total de lectures d’ADN représentées est de 506 358. Le nombre de lectures pour chaque point temporel est indiqué en haut du graphique. L’inoculum a été ajouté au début du jour 23. Abréviation : OTU = Unité taxonomique opérationnelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Quantité pour la culture mixte du sol</td>
			<td>Montant pour la culture mixte en forage</td>
			<td>Quantité pour méthanogène isolé dans les trous de forage</td>
		</tr><tr><td>Eau distillée</td>
			<td>1000,0 ml</td>
			<td>1000,0 ml</td>
			<td>1000,0 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>3.600 grammes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>VADROUILLES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.000 g</td>
		</tr><tr><td>MgCl2 ∙6 h2O</td>
			<td>0,400 g</td>
			<td>0,400 g</td>
			<td>0,400 g</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0,500 g</td>
			<td>0,250 g</td>
			<td>0,500 g</td>
		</tr><tr><td>NH4cl</td>
			<td>0,268 g</td>
			<td>0,268 g</td>
			<td>0,268 g</td>
		</tr><tr><td>Na2SO4</td>
			<td>-</td>
			<td>0,284 gramme</td>
			<td>1.500 grammes</td>
		</tr><tr><td>Na2HPO4 ∙2 H2O</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0,356 g</td>
		</tr><tr><td>1 M KH2PO4 à pH 6</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>1 M H3BO3 à pH 9,4</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>Oligo-éléments</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>Vitamine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>1 mg/mL de résazurine sodique</td>
			<td>0,4 mL</td>
			<td>0,3 mL</td>
			<td>0,4 mL</td>
		</tr><tr><td>Ajustement du pH à</td>
			<td>-</td>
			<td>7.0</td>
			<td>7.0</td>
		</tr><tr><td>Ajustement du pH par</td>
			<td>-</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>KOH</td>
		</tr><tr><td>Température d’incubation</td>
			<td>25 °C</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>47 °C</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition des médias. Liste des composés et des paramètres physiques pour chaque milieu. Les médias présentés sont naïfs ; Ils ne contiennent pas de sources de carbone et d’énergie, car celles-ci peuvent être spécifiques aux micro-organismes et à l’environnement d’intérêt du lecteur et doivent être informées par eux. Voir la section de discussion pour des idées d’ajouts possibles de carbone et de sources d’énergie.
Fichier supplémentaire 1 : Configuration du collecteur de gaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

L’objectif de cet article est de détailler les meilleures pratiques pour la fabrication de milieux pour les micro-organismes anaérobies exigeants acquis dans un environnement. Ces méthodes aident à gérer les cultures anaérobies et peuvent être appliquées pour soutenir la croissance de micro-organismes insaisissables non cultivés, la « matière noire microbienne ».

Ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Nos recherches portent sur les micro-organismes terrestres de surface et souterrains, leur culture et l’étude de leurs génomes et phénotypes. Les microorganismes dans les environnements qui ne sont pas bien compris, comme ceux du sous-sol profond et de certaines zones humides, sont particulièrement importants. La plupart des micro-organismes que nous cultivons sont anaérobies, ce qui signifie que le processus de culture nécessite généralement plus de temps et d’attention que les processus pour les micro-organismes aérobies plus couramment utilisés.Nous espérons que la présentation audiovisuelle de la préparation du milieu anaérobie aidera les chercheurs novices en la matière à l’apprendre relativement rapidement et facilement. Cette préparation de médium est basée sur la technique Hungate modifiée de Miller et Wolin. La culture de microbes fastidieux est fastidieuse et problématique.Avoir plus d’outils pour les développer est le bienvenu pour la communauté scientifique. Les recherches futures en général seront similaires à nos recherches actuelles sur les micro-organismes terrestres sous-étudiés. Il y a encore beaucoup de nouveaux microbes à découvrir et à étudier.

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Environment

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Source : Ahmadi, S., et al. Un modèle de culture batch-in vitro visant à estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo démontre une méthode pour modéliser la fermentation microbienne intestinale en incubant des échantillons fécales avec des fibres fermentescibles alimentaires dans des conditions anaérobies afin d’étudier la production de métabolites par le microbiote intestin.

In vitro Modèle de culture par lots pour imiter la fermentation du côlon par le microbiote intestinal humain

Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

La culture et entretien<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dans un environnement anaérobie

Ce protocole décrit un système in vitro de fermentation par lots-culture du microbiote fécal humain, utilisant l'inuline (un prébiotique bien connu et l'un des modulateurs de microbiote les plus largement étudiés) pour démontrer l'utilisation de ce système dans l'estimation des effets de sur la composition du microbiote fécal et les activités métaboliques.

Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

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Préparation moyenne pour la culture de micro-organismes dans des conditions strictement anaérobies/anoxiques

Le protocole résume les pratiques exemplaires pour minimiser la charge microbienne dans un environnement de salle blanche et comprend des stratégies telles que la surveillance environnementale, la surveillance des procédés et les tests de stérilité des produits. Elle est pertinente pour les installations de fabrication et d’essai qui sont tenues de respecter les normes actuelles de bonnes pratiques tissulaires et les normes actuelles de bonnes pratiques de fabrication.

Stratégies de contrôle et de surveillance microbiens pour les environnements de salle blanche et les thérapies cellulaires

Le protocole présente deux méthodologies pour améliorer l’isolement des bactéries intestinales anaérobies. La première se concentre sur l’isolement d’un large éventail de bactéries à l’aide de différents milieux de culture. La seconde se concentre sur les étapes de culture d’un groupe microbien spécifique, assimilant éventuellement le myo-inositol, afin de bien comprendre sa signification écologique.

Stratégies pour améliorer l’élevage de bactéries anaérobies dans le tractus gastro-intestinal du poulet

Ce protocole décrit la conception et l’utilisation d’une puce d’isolement (iChip) pour la culture in situ de microbes récalcitrants du sol dans leur milieu naturel. Il décrit également la culture in situ de bactéries du sol productrices d’antimicrobiens. Le protocole peut être adapté pour récupérer des bactéries de diverses niches avec d’autres propriétés souhaitables.

In situ Isolement et culture de bactéries récalcitrantes du sol à l’aide d’une puce d’isolement (iChip)

Ce protocole détaille l’assemblage de réseaux de mini-bioréacteurs à utiliser pour la culture en flux continu de communautés fécales complexes dans des conditions anaérobies. Nous discutons également des méthodes d’assemblage, d’inoculation et d’échantillonnage des réacteurs pour une analyse plus approfondie.

Ensemble de bioréacteur pour la culture continue de communautés fécales complexes

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Une méthode non invasive pour<em&gt; In situ</em&gt; Détermination du succès de l&#39;accouplement chez les femelles homards américains (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Un Solid State (UAS) réacteur à flux ascendant anaérobie roman a été utilisé pour la production de biogaz à partir de matières premières fibreuses. Digestats provenant du réacteur UAS a été hydrothermique carbonisé dans HTC biochar dans un réacteur discontinu sous pression. L'intégration des deux concepts bioénergie a été appliqué dans cette étude pour augmenter la production globale de la bioénergie.

Évaluation de la digestion anaérobie intégré et hydrothermale carbonisation pour production de bioénergie

Découvrez la préparation de milieux anaérobies pour la culture de micro-organismes fastidieux issus de l'environnement. Cette méthode basée sur la technique Hungary modifiée facilite l'étude de la matière microbienne noire.

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