Name: Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Apprenez l'isolement de cellules stromales à partir d'os, moelle osseuse et thymus murins et humains. Ces protocoles optimisés pour la multiomique unicellulaire facilitent la recherche avancée sur l'hématopoïèse.

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Nous avons bénéficié de l’assistance technique d’experts de l’installation de cytométrie en flux HSCI-CRM du Massachusetts General Hospital et de la plateforme Bauer de l’Université Harvard. T.K. et K.G. ont été soutenus par le Conseil suédois de la recherche et C.M. par la Fondation allemande pour la recherche. Nous remercions Sergey Isaev et I-Hsiu Lee pour leur aide dans l’analyse des données de séquençage de l’ARN unicellulaire.

Optimisation de l’isolement des cellules stromales du thymus et de la moelle osseuse

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

D.T.S. est administrateur et actionnaire d’Agios Therapeutics et d’Editas Medicines. fondateur, directeur, actionnaire et membre du conseil consultatif scientifique de Magenta Therapeutics et LifeVault Bio, actionnaire et fondateur de Fate Therapeutics et Garuda Therapeutics, et administrateur, fondateur et actionnaire de Clear Creek Bio, consultant pour FOG Pharma, Inzen Therapeutics et VCanBio, et bénéficiaire d’un financement de recherche parrainé par Sumitomo Dianippon. D.T.S et K.G sont les inventeurs de US20220143099A1 de brevets.

Les cellules stromales dans les organes hématopoïétiques sont essentielles à la production normale de sang et les perturbations du stroma hématopoïétique peuvent entraîner de graves altérations de l’entretien hématopoïétique et de la réponse au stress 9,23,24. La connaissance des cellules stromales hématopoïétiques est essentielle pour comprendre les maladies hématologiques 7,9,10,24 et pour la capacité de développer des traitements pour les combattre25,26. La séparation reproductible du stroma hématopoïétique du parenchyme est cependant un défi, en particulier avec l’avènement des multiomiques unicellulaires qui nécessitent des préparations d’échantillons de haute qualité tout en maximisant le rendement et la variété des cellules stromales. Les protocoles décrits ici ont été optimisés pour être compatibles avec la plupart des applications multiomiques en aval tout en répondant aux défis de l’isolement des cellules stromales hématopoïétiques 1,2,19.
Le premier problème à prendre en compte pour l’isolement des cellules stromales hématopoïétiques est les conditions de dissociation. Une dissociation optimale est essentielle pour libérer les cellules du stroma du tissu afin de refléter l’hétérogénéité complète du compartimentdu stroma 1,2. Le choix du bon mélange de dissociation dépend de la portée de l’expérimentation et des protocoles en aval. Nous vous recommandons de préparer les mélanges de dissociation aussi frais que possible et de les conserver sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Certains composants sont difficiles à dissoudre, comme la dispase, et peuvent nécessiter plus de temps pour le mélange par pipette. Le vortex n’est pas recommandé car il peut perturber la conformation native des enzymes de digestion, conduisant finalement à leur inactivation. Il est important de noter que l’EDTA inhibe l’activité enzymatique et doit être évité pendant les étapes de digestion active, mais peut être utilisé pour arrêter la réaction si le tampon contenant l’enzyme ne peut pas être éliminé rapidement. En plus du mélange d’enzymes lui-même, deux points sont essentiels à une dissociation efficace des tissus, (1) un broyage et une coupe minutieux pour augmenter la surface et (2) un temps d’incubation suffisant avec les enzymes de digestion. Le tissu thymique humain est, par exemple, nettement plus difficile à dissocier que le tissu murin et les temps de digestion doivent donc être plus longs. Si l’ajustement n’est pas fait pour les tissus humains, le rendement stromal et la variété cellulaire seront diminués (Figure 2A). Les enzymes de dissociation nécessitent une température optimale de 37 °C qui influence inévitablement l’expression des gènes27. Bien qu’une dissociation à froid ou à basse température soit souhaitable pour conserver les états cellulaires, il n’existe actuellement aucune combinaison d’enzymes de dissociation active à froid adaptée aux os et à la moelle osseuse. Pour tout tissu nécessitant une digestion, l’hétérogénéité et le pourcentage de contribution acquis à partir de différents types de cellules changeront invariablement avec le temps de digestion, la composition du cocktail enzymatique et le traitement. En aval de ces étapes initiales, l’hétérogénéité et la représentation seront encore limitées par les étapes de filtration telles que la taille des buses pendant le tri et la capture des types de cellules difficiles (par exemple, les adipocytes du stroma) et les diamètres des canaux des dispositifs fluidiques. Ainsi, lorsque nous comparons des ensembles de données, nous devons garder à l’esprit que ces différences dans les protocoles peuvent avoir un impact sur la représentation des sous-populations. Il s’ensuit logiquement que nous devons être vigilants pour que les étapes de traitement soient égales lors de la mesure de l’impact des perturbations dans les systèmes stromaux.
Alors que le coût du séquençage a été et est en baisse, les technologies de cellules uniques sont souvent limitées par le nombre de cellules pouvant être analysées. Pour optimiser la capacité de chaque kit de réactifs, la déplétion magnétique des cellules hématopoïétiques a été utilisée dans la mesure du possible. Cela permet d’éviter un grand nombre de cellules contaminantes qui sont beaucoup plus nombreuses que le stroma dans les fractions d’échantillons de moelle osseuse et thymique. Cependant, si le matériel de départ est limité, comme dans le cas du tissu thymique post-greffe, la perte accrue et non spécifique de cellules que les stratégies de déplétion magnétique entraînent invariablement peut la rendre déconseillée. De plus, lors de la préparation et de la digestion des tissus, le broyage, la découpe et la libération enzymatique des composants de la matrice extracellulaire génèrent une grande quantité de débris. Ce type de contaminant, s’il est laissé dans l’échantillon pour l’analyse, peut causer des problèmes de colmatage lors du traitement en aval, provoquer des puits négatifs pour le tri de l’indice de cellule unique et gonfler fortement les pourcentages de porte mère dans l’analyse. La coloration à la calcéine a été utilisée pour obtenir des résultats positifs pour les cellules/cellules vivantes. Calcein est disponible en différentes couleurs, ce qui le rend très adaptable à votre matrice de coloration. Lorsque vous travaillez avec du calcéin, veillez à ne pas soumettre le colorant à des cycles répétés de congélation-décongélation (c’est-à-dire préparez-le toujours frais et conservez-le à température ambiante après la dissolution).
La possibilité de multiplexer des échantillons basés sur des anticorps codés à barres avec des oligos d’ADN28 permet d’augmenter l’utilité des réactions de séquençage de cellules uniques sur des plateformes telles que 10x Genomics. Les anticorps de hashtagging conçus pour le multiplexage d’échantillons ont des cibles différentes pour les molécules de surface cellulaire ou la membrane nucléaire et une spécificité pour la souris et l’homme. Bien que le système de hashtag cellulaire ait été utilisé avec succès pour plusieurs tissus, des expériences combinant des mélanges d’enzymes de digestion avec l’utilisation ultérieure de hashtags peuvent conduire à une récupération considérablement réduite. Nous avons tenté d’inclure des étapes de lavage supplémentaires après la dissociation et ajouté de l’EDTA pour inhiber l’activité des enzymes de digestion. Cependant, même avec ces étapes, attendez-vous à une identification par hashtag plus faible que les cellules hématopoïétiques. Il a été constaté qu’avec les protocoles de digestion enzymatique, les taux de capture des hashtags se situaient entre 30 % et 70 %. Cela se produit malgré le fait que le même clone d’anticorps avec un conjugué fluorochrome a marqué >90% des cellules stromales de la même population. Tout plan expérimental associant la digestion enzymatique des tissus avec le hashtag doit être testé et des précautions doivent être prises pour assurer l’inhibition enzymatique.

Chez l’adulte en bonne santé, la production de novo de cellules sanguines se produit dans la moelle osseuse et le thymus. Les cellules stromales à ces sites sont essentielles au maintien de l’hématopoïèse, mais le stroma constitue moins de 1% du tissu 1,2,3,4. L’obtention d’isolats purs d’hématopoïèse soutenant le stroma constitue donc un défi important, en particulier pour la multiomique unicellulaire qui nécessite un traitement rapide pour obtenir des échantillons de haute qualité. Les composants de différents cocktails de digestion peuvent interférer avec certaines étapes de l’analyse multiomique 5,6. Les protocoles présentés ici détaillent l’isolement d’une grande variété de cellules stromales à partir de la moelle osseuse et des tissus thymiques.
Les perturbations des constituants stromaux dans la moelle osseuse et le thymus entraînent une perturbation profonde du développement des cellules sanguines et peuvent entraîner des tumeurs malignes 7,8,9. L’hématopoïèse soutenant le stroma est endommagée à la suite d’un conditionnement cytotoxique et d’une greffe de moelle osseuse, ce qui entraîne une réduction de la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance qui soutiennent les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)2,10,11. De plus, le vieillissement affecte les cellules stromales de la moelle osseuse et du thymus, contribuant probablement aux phénotypes hématopoïétiques âgés. Le thymus est le premier organe à subir une involution importante associée à l’âge. La graisse et le tissu fibreux commencent à remplacer le stroma de soutien des lymphocytes T dès le début de la puberté12,13. Dans la moelle osseuse, la teneur en adipocytes augmente avec l’âge et les niches vasculaires et endostatives sont significativement remodelées 14,15,16.
Pour permettre l’étude du stroma de soutien à l’hématopoïèse dans plusieurs états de stress et dans le cas du thymus des tissus humains et murins, nous avons optimisé les protocoles de digestion précédemment publiés 1,2,8,17,18. Ces protocoles garantissent une isolation efficace et reproductible des cellules, et ils sont compatibles avec le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et d’autres types de multiomique.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-aminoactinomycine D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de lignée anti-humaine 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 souris</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>Mâles ou femelles, 8-12 </td></tr><tr><td>semaines Calcein&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtres à cellules stériles, blanc, taille des mailles : 70 &micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&nbsp ; 2500 U/mL</td></tr><tr><td>Souris Easysep streptavidine RapidSpheres Kit d’isolement</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>Qualifié One Shot</td></tr><tr><td>Human Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&nbsp ;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>Research Grade</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protecteur Inhibiteur de RNase</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD11b-Biotine</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD3-Biotine</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD45.2-Biotine</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD45R/B220-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin</td><td></td><td>Biolegend 108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris pour rat Ter119-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris pour rat Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris pour rat Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&nbsp ;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004107</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Le séquençage unicellulaire a permis de cartographier des populations cellulaires hétérogènes dans le stroma des organes hématopoïétiques. Ces méthodologies fournissent une lentille à travers laquelle étudier l’hétérogénéité jusqu’alors non résolue à l’état d’équilibre, ainsi que les changements dans la représentation du type cellulaire induits par des stress extrinsèques ou au cours du vieillissement. Ici, nous présentons des protocoles par étapes pour l’isolement de populations de cellules stromales de haute qualité à partir du thymus murin et humain, ainsi que de l’os et de la moelle osseuse murins. Les cellules isolées par ces protocoles conviennent à la génération d’ensembles de données multiomiques unicellulaires de haute qualité. Les impacts de la digestion des échantillons, de l’appauvrissement de la lignée hématopoïétique, de l’analyse/tri FACS et de la façon dont ces facteurs influencent la compatibilité avec le séquençage unicellulaire sont discutés ici. Avec des exemples de profils FACS indiquant une dissociation réussie et inefficace et des rendements de cellules stromales en aval dans l’analyse post-séquençage, des indications reconnaissables pour les utilisateurs sont fournies. La prise en compte des exigences spécifiques des cellules stromales est cruciale pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles qui peuvent faire progresser les connaissances dans le domaine.

Ces protocoles produisent des variétés de cellules stromales reproductibles du thymus et de la moelle osseuse adaptées à l’analyse cytométrique en flux, ainsi qu’à la multiomique unicellulaire, comme le séquençage de l’ARNsc. Le tissu thymique murin subit un remodelage important en réponse à des facteurs de stress, tels que le conditionnement cytotoxique qui précède la greffe de moelle osseuse ou le processus naturel de vieillissement. En conséquence, la cellularité thymique est considérablement réduite dans ces deux contextes (Figure 1A). Alors qu’un thymus d’une souris de type sauvage de 8 semaines contient environ 100 millions de cellules, on peut s’attendre à ce que la cellularité d’une souris de 2 ans soit la moitié de cela, et qu’un thymus 4 jours après l’irradiation et la greffe de moelle osseuse puisse être aussi faible que 5 000 000 cellules (Figure 1A).
Le conditionnement cytotoxique permettra d’ablater préférentiellement les cellules hématopoïétiques, de sorte que le compartiment stromal sera enrichi proportionnellement (Figure 1B). Cependant, la faible cellularité globale rendra difficile l’isolement d’un nombre suffisant de cellules stromales thymiques. Il peut donc être nécessaire de regrouper les animaux pour obtenir des numéros de cellules compatibles avec les applications multiomiques en aval et pour minimiser les pertes de matière dans la mesure du possible. Pour effectuer la multiomique sur des cellules stromales thymiques, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de cellules CD45-Ter119- vivantes et uniques (Figure 1C) garantira qu’un nombre suffisant de cellules peut être trié dans la plupart des conditions de stress.
Pour préserver l’hétérogénéité du compartiment du stroma, nous ne trions généralement pas sur un seul marqueur positif du stroma, mais nous éliminons les cellules hématopoïétiques. L’inclusion de marqueurs positifs des cellules stromales est toujours recommandée pour l’analyse afin de s’assurer qu’une bonne dissociation des tissus a été obtenue. Cependant, l’isolement de FACS est imparfait, et comme déterminé par scRNAseq, 30 à 50 % des cellules triées seront d’origine hématopoïétique (Figure 1D,E). Cela peut être amélioré en appauvrissant magnétiquement les cellules CD45+ avant le FACS ; cependant, cela n’est pas recommandé dans des conditions de cellularité thymique réduite (Figure 1A), car la perte de matière qui accompagne le traitement supplémentaire impliqué dans l’appauvrissement magnétique entraîne des rendements de stroma trop faibles pour les applications en aval.
Pour l’isolement du stroma thymique humain, l’étape la plus critique est la digestion enzymatique. Si l’étape de dissociation est précipitée, le rendement global des cellules stromales, ainsi que la représentation du sous-type des cellules stromales, seront sévèrement diminués (Figure 2A). Il est également recommandé de toujours inclure les marqueurs de l’endothélium thymique et de l’épithélium pour s’assurer que la digestion des tissus a été optimale, car le simple fait de présenter un point négatif pour les marqueurs hématopoïétiques ne sera pas suffisant pour évaluer la libération réelle des cellules stromales. Ceci est illustré par la figure 2A, où le pourcentage de cellules négatives pour les marqueurs hématopoïétiques est plus élevé dans l’échantillon digéré pendant 30 minutes par rapport à l’échantillon incubé pendant 90 minutes. Cependant, comme on le voit dans la porte consécutive, le rendement des cellules endothéliales et épithéliales est très faible dans le protocole de digestion plus court (Figure 2A).
Pour l’isolement FACS des cellules stromales thymiques humaines pour les applications multiomiques, la coloration avec un cocktail d’anticorps de la lignée hématopoïétique, ainsi qu’avec des anticorps CD4 et CD8 est suggérée, en plus du marqueur pan-hématopoïétique CD45 et du marqueur érythroïde CD235a (Figure 2B) pour améliorer l’enrichissement des cellules stromales. Ainsi, pour l’analyse multiomique humaine du stroma thymique, les cellules CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- vivantes et uniques doivent être triées par FACS (Figure 2B). Comme on l’a vu pour le scRNAseq d’échantillons murins, cela entraîne toujours une contamination de 30 à 50 % des cellules hématopoïétiques, mais cela donne toujours une résolution acceptable du compartiment stromal du thymus humain (Figure 2C, D).
Pour l’os et le stroma BM, la même stratégie a été utilisée que pour le tissu thymique ; Les cellules stromales sont isolées par contrôle sur les cellules négatives pour les marqueurs hématopoïétiques, et d’autres marqueurs de cellules stromales sont inclus comme contrôles de la digestion (Figure 3). La dissociation des tissus calcifiés comme l’os entraîne une accumulation importante de débris. L’ajout de calcéine comme colorant de viabilité permettra d’exclure la plupart de ces débris, qui, autrement, gonflent faussement les nombres triés et diminuent les fréquences de population fermées (figure 3). Ceci est illustré par les graphiques FACS comparant le gating sur toutes les cellules et le gating uniquement sur Calcein+ (Figure 3). Comme on le voit pour les cellules stromales thymiques humaines, le pourcentage de cellules hématopoïétiques négatives pour les marqueurs n’est pas une lecture fiable de l’efficacité de la dissociation des os et des tissus BM (Figure 3). Bien que la porte CD45-Ter119- puisse contenir une abondance de cellules dans un échantillon où l’étape de digestion a échoué, une analyse plus approfondie des marqueurs typiques des cellules stromales osseuses et BM CD31, CD140a et CD51 démontre clairement une faible libération du stroma (Figure 3 et Figure 4).
Pour l’isolement par FACS des cellules stromales osseuses murines et BM, l’utilisation de la stratégie de déclenchement est suggérée comme dans la figure 3, où nous ne trions que CD45-Ter119-Calcein+ mais surveillons les propriétés de diffusion directe et latérale et l’expression des marqueurs cellulaires stromaux de la population triée pour assurer une digestion optimale (Figure 3A). La combinaison de l’appauvrissement cellulaire de la moelle osseuse positif à la lignée hématopoïétique avant le FACS et du tri sur les portes montrées permet d’obtenir un séquençage unicellulaire des cellules qui sont &gt;90% de stroma. Un exemple d’un tel séquençage de l’ARNsc (Figure 5A,B) illustre cette faible contamination hématopoïétique après annotation des cellules analysées par transcriptome (exemples de gènes marqueurs hématopoïétiques Figure 5C). Ceci contraste fortement avec les préparations stromales thymiques où la déplétion des cellules magnétiques n’a pas été effectuée avant l’étape de tri en raison de la quantité limitée de matériel de départ dans le tissu thymique post-transplantation (Figure 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg"> Figure 1 : Analyse par cytométrie en flux et séquençage de l’ARN unicellulaire du stroma thymique murin. (A) Quantification du nombre de thymocytes chez des souris âgées de 8 semaines (contrôle), des souris de 8 semaines irradiées létalement et transplantées 4 jours auparavant (transplantation) et des souris âgées de 2 ans (âgées). (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux démontrant l’enrichissement en sous-types de cellules stromales 4 jours après l’irradiation létale et la transplantation. (C) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour trier le stroma thymique murin pour l’analyse multiomique unicellulaire. (D) UMAP du thymus murin indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (E) UMAP montrant des gènes marqueurs hématopoïétiques murins dans des échantillons de thymus. (F) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques murines dans des échantillons de scRNAseq de thymus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg"> Figure 2 : Analyse par cytométrie en flux et séquençage de l’ARN unicellulaire du stroma thymique humain. (A) Graphiques FACS montrant des résultats représentatifs de l’impact de différents temps de digestion sur la libération des populations de cellules stromales thymiques humaines. (B) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour trier le stroma thymique humain pour l’analyse multiomique sur cellule unique. (C) UMAP du thymus humain indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (D) UMAP montrant des gènes marqueurs hématopoïétiques humains dans des échantillons de thymus. (E) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques humaines dans des échantillons de scRNAseq de thymus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg"> Figure 3 : Les marqueurs stromaux de la moelle osseuse murine et la Calcein sont utiles pour estimer l’efficacité de la dissociation. (A) Analyse par cytométrie en flux représentative des cellules stromales de la moelle osseuse murine CD45-Ter119- bloquées sur toutes les cellules et des cellules Calcein+. Le contrôle CD31- ultérieur a montré une proportion plus élevée de cellules CD140a+CD51+ lors de la sélection des cellules Calcein+. (B) Analyse par cytométrie en flux représentative d’un échec de la digestion osseuse avec des cellules CD140a+CD51+ manquantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg"> Figure 4 : Stratégie de déclenchement du stroma de la moelle osseuse. (A) Stratégie de contrôle de la cytométrie en flux pour trier le stroma de la moelle osseuse murine pour la multiomique unicellulaire. (B) Analyse par cytométrie en flux représentative d’un échec de la digestion de la moelle osseuse avec des cellules CD140a+CD51+ manquantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg"> Figure 5 : Séquençage de l’ARN unicellulaire de la moelle osseuse avec composition cellulaire stromale et hématopoïétique. (A) UMAP de l’os murin et de la moelle osseuse indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (B) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques dans des échantillons d’os murins et de moelle osseuse. (C) UMAP des gènes marqueurs hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse murine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

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