Name: Modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Apprenez le clampage hilaire pulmonaire gauche chez la souris pour étudier les lésions d'ischémie-reperfusion. Cette méthode accessible isole les mécanismes cellulaires impliquant les neutrophiles et les lymphocytes B.

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Modèle murin pour l’étude des lésions d’ischémie-reperfusion pulmonaire

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<li>Nakata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+anti-HMGB1+monoclonal+antibody+on+lung+ischemia+reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).</li>
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<li>Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+lymphocytes+mediate+acute+pulmonary+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).</li>
<li>Sayah, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+are+pathogenic+in+primary+graft+dysfunction+after+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).</li>
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<li>Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+mediates+synergistic+effects+of+IL-17+and+TNF-alpha+on+CXCL1+expression+by+epithelial+cells+after+lung+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).</li>
<li>Zanotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+critical+role+of+Toll-like+receptor+4+in+lung+ischemia-reperfusion+injury+and+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).</li>
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Les auteurs ne signalent aucune divulgation pertinente.

Nous décrivons une technique de clamp hilaire qui implique l’application d’un nœud coulant sur le hile gauche qui obstrue l’artère et les veines pulmonaires et les bronches pour induire une ischémie chaude suivie d’une reperfusion. Après le clampage hilaire, le poumon gauche peut être prélevé pour diverses techniques expérimentales telles que l’histologie, la cytométrie en flux, le séquençage en vrac ou sur cellule unique et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. De plus, le sang et la rate peuvent être utilisés pour étudier les effets systémiques, tandis que le poumon droit non ischémique peut servir de contrôle interne. Dans ce protocole, nous décrivons également des méthodes détaillées pour obtenir des mesures ABG et/ou déterminer l’extravasation cellulaire.
La technique du clampage hilaire murin est essentielle à l’étude de l’IRI pulmonaire et au domaine plus large de la transplantation pulmonaire. Par exemple, en utilisant ce modèle de clamp hilaire, notre groupe a constaté que les monocytes classiques CCR2+ dérivés de la rate médient l’extravasation des neutrophiles dans le poumon après IRI18. Un autre groupe a montré que les cellules épithéliales alvéolaires de type II produisent CXCL1 (un chimioattractant des neutrophiles) de manière dépendante de la NADPH oxydase-IL-17-TNFα en utilisant un modèle de clamp hilaire19. TLR4 a joué un rôle dans le développement de l’œdème dans un modèle murin de clampage hilaire20.
Bien que la transplantation pulmonaire murine orthotopique soit plus applicable cliniquement et puisse simuler à la fois l’ischémie chaude et froide, elle introduit également un traumatisme chirurgical dû à des anastomoses vasculaires et bronchiques et à des stimuli allogéniques dus à l’incompatibilité donneur-receveur. Ainsi, le principal avantage de la technique de la pince hilaire est sa capacité à isoler les effets de l’IRI pulmonaire de ces autres facteurs. De plus, pour le microchirurgien souris inexpérimenté, la procédure de clamp hilaire est techniquement moins exigeante et peut être maîtrisée plus rapidement par rapport à la transplantation pulmonaire. L’une des limites du modèle de pince hilaire est que l’ischémie à froid est difficile à réaliser. Une ischémie froide in situ a été réalisée chez des porcs avec une perfusion de rinçage antérograde via l’artère pulmonaire gauche25, mais elle est beaucoup plus difficile chez la souris en raison de sa petite taille et de la nécessité de maintenir une normothermie pendant la chirurgie. Néanmoins, l’étude de l’ischémie chaude isolée est importante car elle est généralement plus délétère pour le fonctionnement des organes que l’ischémie froide 4,5,6. De plus, les centres de transplantation adoptent de plus en plus les greffes de poumons DCD, qui s’accompagnent de temps ischémiques chauds beaucoup plus longsque les greffes pulmonaires DBD traditionnelles7. Ainsi, l’étude détaillée des événements lors de l’ischémie chaude et de la période de reperfusion qui s’ensuit est essentielle et peut être réalisée avec ce modèle de pince hilaire.
De nombreuses variantes de la technique de la pince hilaire ont été créées au cours des deux dernières décennies. Il s’agit notamment de l’utilisation d’une pince microvasculaire atraumatique 8,9,10,11,12,13, d’un garrot de Rumel 14,15 et d’une attache avec un nœud coulant autour du hile16. Nous décrivons notre adaptation de la technique du nœud coulant chez la souris. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres techniques de clamp hilaire est qu’elle permet de fermer la poitrine pendant la période d’ischémie, ce qui minimise les pertes de liquide insensible, en particulier dans les protocoles avec des périodes d’ischémie plus longues. Cela ne peut pas être accompli lorsqu’une pince ou un garrot est placé sur le hile.
En ce qui concerne la sélection animale, nous avons choisi de développer ce modèle chez la souris par opposition aux modèles de rats ou de grands animaux, comme le porc. Le raisonnement est double : notre laboratoire possède une vaste expérience dans la microchirurgie de la souris avec la transplantation pulmonaire orthotopique de souris17. Deuxièmement, bien que les souris soient plus petites et plus difficiles à opérer techniquement que les rats, il existe actuellement plus de souches de souris transgéniques disponibles dans le commerce que de souchesde rats 26,27. Les souris se reproduisent également plus rapidement, ce qui permet un développement plus rapide de nouvelles souches, ce qui est particulièrement utile lors de l’étude des mécanismes immunitaires de l’IRI. Pour ces raisons, nous avons choisi de développer cette technique chez la souris.
À notre connaissance, il s’agit du premier article vidéo utilisant la technique de la pince hilaire du poumon gauche chez la souris avec un nœud coulant. Saito et al ont publié un article vidéo démontrant la clamp hilaraire chez le rat à l’aide d’un clamp microvasculaire22. Chez la souris, Liao et al ont publié un modèle IRI pulmonaire avec clampage de l’artère pulmonaire (PA) avec un nœud coulant, mais le poumon reste ventilé dans ce modèle car la bronche est exclue du clamp28. La technique de clampage PA a été utilisée comme modèle pour étudier l’embolie pulmonaire29, l’hypertension pulmonaire et/ou l’insuffisance ventriculaire droite30,31. Étant donné que le domaine d’étude est l’IRI pulmonaire dans la transplantation, nous avons choisi de clamper tout le hile, y compris la bronche, afin de minimiser le barotraumatisme en plus de la lésion ischémique.
A noter, 30 min d’ischémie chaude ont été choisis suivis de 1 h de reperfusion car nous nous intéressons à la dynamique des cellules infiltrantes pulmonaires dans la période très précoce post-IRI. Par exemple, des études ont rapporté une régulation positive des gènes cytoprotecteurs, tels que l’hème oxygénase 1, après seulement 30 minutes d’ischémie suivies de 2 heures de reperfusion13. On pensait auparavant que les neutrophiles étaient le type de cellule centrale infiltrant le poumon après IRI32, mais nous avons montré que les monocytes précèdent les neutrophiles dans leur arrivée dans le poumon18,24. Plus récemment, nous avons constaté que les lymphocytes B précèdent même les monocytes et pénètrent dans les poumons dans l’heure qui suit la reperfusion (données non publiées). Lors de l’adaptation de cette technique, les durées d’ischémie chaude et de reperfusion peuvent être ajustées en fonction de la question et de l’hypothèse de l’étude. Des périodes plus longues d’ischémie chaude sont possibles sans se soucier d’une perte excessive de liquide et de chaleur, car la poitrine peut être fermée pendant cette période.
Plusieurs complications peuvent survenir en périopératoire, le résultat final commun étant le décès périopératoire. Nous avons observé que l’incidence de la mort d’un animal pendant la chirurgie diminue avec les répétitions de la technique par le chirurgien. Nous estimons que les chirurgiens ont besoin d’au moins 2 mois de pratique et/ou d’au moins 20 cas pour atteindre un plateau de compétence. À ce stade, nous estimons que la mortalité peropératoire survient dans environ 1 cas sur 50. La mort chez la souris anesthésiée est souvent annoncée par des respirations agonales qui impliquent des contractions énergiques du diaphragme et de la musculature de la paroi thoracique. Au début de ces respirations agonales, la mort surviendra en 3 à 5 minutes si aucune intervention n’est prise. Plusieurs causes peuvent précipiter la mort peropératoire, dont beaucoup sont reconnaissables et évitables. Nous mettrons en évidence ci-dessous les étapes critiques de cette chirurgie et les techniques de dépannage pour obtenir un résultat réussi.
Intubation La première étape critique est l’intubation soigneuse et la sécurisation des voies respiratoires pour éviter l’extubation par inadvertance. Lors d’une chirurgie de survie, il est particulièrement important de s’assurer que les cordes vocales ne sont pas endommagées lors de l’intubation initiale, car la souris ne pourra pas respirer après l’extubation. L’avancement de l’ETT au-delà des cordons doit se faire sous visualisation directe au microscope. Si une résistance est rencontrée pendant l’intubation, l’ETT ne doit pas être avancé à l’aveuglette. Tout en gardant l’oropharynx ouvert avec le pince-moustique, il faut veiller à ne pas percer la muqueuse buccale car le sang obscurcira la vue des voies respiratoires. Le nombre de tentatives d’intubation doit être limité à moins de cinq.
Extubation accidentelle Si, à un moment donné de l’intervention, les poumons ne semblent pas se gonfler correctement, il est possible que l’ETT se soit délogé. Une autre manifestation de l’extubation accidentelle qui passe inaperçue pendant une période prolongée est le développement soudain d’une respiration agonale chez la souris. Après l’intubation initiale, il faut veiller à bien fixer l’ETT sur la circonférence du nez avec du ruban de soie, et l’ajustement du cou et du torse de la souris doit être limité. Si ni le poumon gauche ni le poumon droit ne gonflent, il se peut que l’ETT soit sorti de la trachée. Des tentatives peuvent être faites pour repousser l’ETT, mais la souris peut avoir besoin d’être réintubée rapidement pour éviter la mort prématurée de l’animal. Si un seul poumon se gonfle alors que les deux sont censés le faire, l’ETT peut être trop profond et doit être soigneusement tiré vers l’arrière et remis en place.
Mobilisation pulmonaire La mobilisation du poumon gauche doit être effectuée à l’aide d’applicateurs à embout de coton avec une légère pression sur le parenchyme pulmonaire, car les blessures par compression peuvent endommager les alvéoles et diminuer la compliance du poumon. Les poumons ne doivent pas être saisis avec des pinces ou des pinces car cela endommagerait le parenchyme pulmonaire.
Application de la pince hilaire La pince hilaire gauche doit être placée sous visualisation directe, en prenant soin de ne pas poser le nœud trop au centre (pour ne pas attraper l’oreillette gauche) ou trop périphérique (pour ne pas attraper de parenchyme pulmonaire). Attraper l’oreillette gauche avec la pince hilaire précipitera probablement la fibrillation auriculaire et la mort ultérieure. La visualisation du hile peut être améliorée en assurant une rétraction adéquate des côtes pour élargir le champ de vision. Après avoir attaché le nœud coulant, il est utile de s’assurer que la pince est complètement occlusive en effectuant une manœuvre de recrutement - en occlusant manuellement le tube de sortie reliant l’ETT au ventilateur et en s’assurant que le poumon gauche ne se dilate pas avec une pression positive. L’occlusion vasculaire est présumée avec confirmation de l’occlusion bronchique, compte tenu de la collapsibilité accrue de l’artère et des veines pulmonaires par rapport à la bronche cartilagineuse. De plus, la pince hilaire ne doit pas être attachée avec une force excessive car elle écraserait les parties cartilagineuses de la bronche principale gauche et empêcherait l’expansion du poumon gauche après la libération de la pince hilé. Une fois la pince hilaire relâchée, il est important de vérifier que le poumon est toujours capable d’être ventilé en effectuant une autre manœuvre de recrutement.
Fermeture de la poitrine Lors de la fermeture de la poitrine, les 4ème et 5ème côtes doivent être rapprochées lorsque le poumon est au maximum de son inspiration. Cela réduira au minimum la quantité d’air restant dans la cavité pleurale, ce qui entraînerait un pneumothorax une fois les côtes fermées. Les couches musculaires et la peau doivent être fermées de manière hermétique pour éviter le développement d’un pneumothorax sous tension.
Obtenir des ABG Enfin, lors de l’obtention d’ABG, il est important de clamper d’abord le hile droit afin que la mesure de l’ABG ne reflète que la fonction pulmonaire gauche22,23. Sans la pince hilaire droite, le poumon droit normalement ventilé compensera largement les dommages causés au poumon gauche ischémique et les mesures de l’ABG sembleront normales.
En résumé, la technique de clampage hilaire que nous décrivons ci-dessus est un outil précieux pour l’étude de la transplantation pulmonaire et, surtout, peut isoler l’étude de l’IRI chaude sans l’introduction d’allogénicité, de traumatisme lié à l’anastomose chirurgicale ou de stockage ischémique à froid. Notamment, cette technique décrite de serrage hilaire est facile à enseigner et largement adoptable et peut conduire à des résultats fiables et reproductibles.

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Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

L’IRI lors de la transplantation d’organe est un facteur de risque majeur de dysfonctionnement primaire du greffon et d’épisodes ultérieurs de rejet du greffon 1,2. Au cours de la transplantation, le temps d’ischémie chaude est défini comme la période de temps entre la clampage aortique croisé du donneur et le début de la perfusion froide et entre le retrait de l’organe de la glace et l’implantation de l’organe. Le temps de stockage au froid est défini comme la période de temps entre le début de la perfusion froide et le retrait de l’organe de la glace3. L’ischémie chaude est plus délétère pour la fonction ultérieure des organes que l’ischémie froide 4,5,6, et ses mécanismes sous-jacents justifient une étude plus approfondie dans des modèles précliniques. De plus, la transplantation d’organes par don après mort cardiaque (DCD) est associée à des temps ischémiques chauds plus longs que le don traditionnel après mort cérébrale (DBD)7. Bien que l’utilisation de donneurs de TDC puisse élargir le bassin de donneurs et augmenter l’utilisation des poumons, d’autres études précliniques sont nécessaires pour évaluer les effets de l’ischémie chaude sur la fonction pulmonaire post-greffe. Ci-dessous, nous décrivons un modèle d’IRI chaud chez la souris via la pince hilaire pulmonaire gauche.
Plusieurs modèles animaux de clampage hilaire pulmonaire ont été développés et adaptés au cours des dernières années et peuvent inclure l’utilisation d’un clamp microvasculaire atraumatique 8,9,10,11,12,13, d’un garrot de Rumel14,15 ou d’une ligature de suture16 comme la pince hilaire. L’essentiel de la pince hilaire est qu’elle doit être réversible et causer peu ou pas de dommages aux structures hilaires afin que la reperfusion puisse être réalisée. Ici, nous décrivons notre technique de clamp hilaire chez la souris qui consiste en une ligature de suture réversible du hile pulmonaire gauche avec un nœud coulant. Cette méthode obstrue l’entrée artérielle pulmonaire, l’écoulement veineux et le flux d’air entrant et sortant de la bronche principale. Le principal avantage d’un noeud coulant par rapport à une pince vasculaire, un clip ou un garrot est que la poitrine peut être fermée pendant des périodes prolongées d’ischémie, minimisant ainsi la perte de liquide insensible et de chaleur chez la souris. Nous fournissons un protocole pour obtenir des mesures fiables des gaz du sang artériel (ABG) et pour mesurer l’extravasation cellulaire après le clampage hilaire.
Cette technique de clamp hilaire occupe une place importante dans l’étude plus large de la transplantation pulmonaire. Par rapport aux modèles animaux de transplantation pulmonaire orthotopique, la technique de clamp hilaire peut isoler les effets de l’IRI sans l’ajout d’un traumatisme anastomotique chirurgical ou d’une allogénicité17. De plus, la technique de la pince hilaire peut être maîtrisée plus facilement et plus rapidement que la greffe de poumon de souris. En fait, en utilisant des techniques de pince hilaire, plusieurs mécanismes importants dans la pathogenèse de l’IRI ont été identifiés au cours de la dernière décennie, tels que TLR4, NADPH oxydase et le récepteurde l’adénosine A2A 14,18,19,20. Dans le protocole suivant, nous présentons une méthode fiable, enseignable et reproductible de clampage hilaire comme outil pour étudier l’IRI pulmonaire.

<table><tbody><tr><td>Medications</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % povidone-iode solution</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Pour</td></tr> désinfectant <tr><td>Buprénorphine 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Pour le contrôle de la douleur</td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>Cronus Pharma</td><td>NDC 69043-027-18</td><td>Pour le contrôle de la douleur</td></tr><tr><td>Héparine 1000 unités/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC 25021-404-01</td><td>Pour l’obtention du sang artériel</td></tr><tr><td>Isoflurane 1 %-1,5</td> %<td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Pour l’anesthésie Chlorhydrate</td>de</tr><tr><td>kétamine 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Puralube Vet pommade oculaire</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Pour prévenir la dessiccation oculaire</td></tr><tr><td>Xylazine 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Pour le contrôle de la douleur</td></tr><tr><td>Tools and Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen</td><td>McKesson</td><td>231</td><td>Pour coaguler les vaisseaux sanguins</td></tr><tr><td>Pince à moustiques incurvée</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Pour intervention chirurgicale</td></tr><tr><td>Pince fine incurvée</td><td>Outils de science fine</td><td>11274-20</td> Pour chirurgie <td> procédure</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils de science</td> fine <td>15040-11</td><td>Pour l’intervention chirurgicale</td></tr><tr><td>Installation de la pince d’intubation</td><td>Outils de science fine</td><td>18374-44, 18144-30</td><td>Pour tenir la souris verticalement par la langue pendant l’intubation. Voir la figure supplémentaire 1A.</td></tr><tr><td>Écarteurs de côtes magnétiques</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18200-01, 18200-10</td><td>Pour la rétraction de la thoracotomie. Le fixateur magnétique et l’écarteur doivent être reliés par un tube en micro latex ci-dessous.</td></tr><tr><td>Fibre optique en plastique de qualité optique sans gaine, 500&mu ; m</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td>Pour fabriquer l’introducteur pour le tube endotrachéal. Voir la figure supplémentaire 1B. Une longueur de 1,5 pouce de cette fibre optique doit avoir un morceau de ruban de soie fixé à une extrémité. Il peut ensuite être utilisé comme introducteur pour la sonde endotrachéale. L’extrémité de l’introducteur doit être légèrement incurvée.</td></tr><tr><td>Tondeuse Power Pro Ultra</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td>Pour couper</td></tr><tr><td>les cheveux Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14370-22</td><td>Pour l’intervention chirurgicale</td></tr><tr><td>Coussin chauffant pour petits animaux</td><td>K& H Pet Products</td><td>Thermo-Peep Coussin chauffant</td><td>Pour maintenir la normothermie</td></tr><tr><td>Ventilateur pour petits animaux</td><td>Harvard Appareil</td><td>55-0000</td><td>Pour la ventilation (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100 %)</td></tr><tr><td>Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 po de diamètre extérieur, 1/16 po de diamètre intérieur)</td><td>Amazon.com</td><td>https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1</td><td>Pour la rétraction de thoracotomie</td></tr><tr><td>Profil statistique Prime Critical Care Analyseur de gaz du sang</td><td>Nova Biomedical</td><td>https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour la rétraction de la thoracotomie</td></tr><tr><td>Pince droite</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td>Pour les interventions chirurgicales</td></tr><tr><td>Pinces droites Fine</td><td>Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Pour les interventions chirurgicales</td></tr><tr><td>Microscope chirurgical</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>n’est plus produit</td><td>Pour l’intubation et les interventions chirurgicales ; recommander le remplacement par des microscopes chirurgicaux Leica</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue &frac12 ; cc avec aiguille &frac12 ; pouce 29G</td><td>McKesson</td><td>942665</td><td>Pour l’injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine</td></tr> &<tr><td>frac12 ; aiguille 31G sur une seringue à tuberculine de 1 cc</td><td>McKesson</td><td>16-SNT1C2705</td><td>Pour l’aspiration du sang artériel du ventricule gauche</td></tr><tr><td>Cathéter IV 1 pouce 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Pour tube endotrachéal (ETT)</td></tr><tr><td>Soie de 1 pouce bande</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Pour coller ETT sur le nez et pour sécuriser les membres</td></tr><tr><td>Seringue 3/10 cc avec aiguille 5/16 pouce 31G</td><td>McKesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td>Pour l’injection d’anticorps dans la veine cave inférieure</td></tr><tr><td>Suture monofilament 6-0 sur une aiguille P-10</td><td>McKesson</td><td>S697GX</td><td>Pour la fermeture de la thoracotomie, de la couche musculaire et de la peau</td></tr><tr><td>Cravate en soie 6-0</td><td>Surgical Specialties Look</td><td>SP102</td><td>Pour faire un noeud coulant pour pince hilaire</td></tr><tr><td>Applicateurs pointus en coton</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Pour manipuler le poumon et pour la dissection contondante</td></tr></tbody></table>

modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

Les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) lors d’une transplantation pulmonaire sont un facteur de risque majeur de complications post-greffe, notamment le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet aigu et chronique et la mortalité. Les efforts déployés pour étudier les fondements de l’IRI ont conduit au développement d’un modèle murin fiable et reproductible de clampage hilaire du poumon gauche. Ce modèle implique une intervention chirurgicale réalisée sur une souris anesthésiée et intubée. Une thoracotomie gauche est pratiquée, suivie d’une mobilisation pulmonaire soigneuse et d’une dissection du hile pulmonaire gauche. La pince hilaire implique une ligature de suture réversible du hile pulmonaire avec un nœud coulant, qui arrête l’entrée artérielle, l’écoulement veineux et le flux d’air à travers la bronche principale gauche. La reperfusion est initiée par un retrait soigneux de la suture. Notre laboratoire utilise 30 min d’ischémie et 1 h de reperfusion pour le modèle expérimental dans les investigations actuelles. Cependant, ces périodes peuvent être modifiées en fonction de la question expérimentale spécifique. Immédiatement avant le sacrifice, des gaz sanguins artériels peuvent être obtenus du ventricule gauche après une période de 4 minutes de clampage hilaire droit pour s’assurer que les valeurs de PaO2 obtenues sont attribuées au poumon gauche blessé seul. Nous décrivons également une méthode pour mesurer l’extravasation cellulaire par cytométrie en flux, qui implique l’injection intraveineuse d’un anticorps marqué au fluorochrome spécifique de la ou des cellules à étudier avant le sacrifice. Le poumon gauche peut ensuite être prélevé pour la cytométrie en flux, l’immunohistochimie congelée ou fixe, l’immunohistochimie intégrée à la paraffine et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. Cette technique de clamp hilaire permet d’étudier en détail les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’IRI. Les résultats représentatifs révèlent une diminution de l’oxygénation du poumon gauche et des signes histologiques de lésions pulmonaires après clampage hilaire. Cette technique peut être facilement apprise et reproduite par le personnel avec ou sans expérience en microchirurgie, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et cohérents et de servir de modèle largement adoptable pour l’étude de l’IRI pulmonaire.

Après clampage hilaire gauche, la pression partielle d’oxygénation dans le sang artériel (PaO2) attribuée au poumon gauche est de ~100 mmHg, significativement plus faible par rapport aux ~500 mmHg après thoracotomie simulée (Figure 7A, n = 6-7). Il convient de noter que des thoracotomies simulées ont été réalisées chez des souris B6 avec une mesure ABG prise après 4 minutes de clampage hilaire droit, représentant des valeurs attribuées au poumon gauche seul. La coloration H&amp;E du poumon gauche clampé hilaire a montré une infiltration de cellules inflammatoires remplissant les voies respiratoires et un engorgement des vaisseaux sanguins avec des érythrocytes, alors que ces résultats sont absents dans le poumon gauche naïf (Figure 7B, n = 2). Ces résultats démontrent une lésion tissulaire immédiate et une infiltration cellulaire après une période d’ischémie et de reperfusion.
Comme nous l’avons vu à l’étape 6, les neutrophiles intravasculaires et interstitiels peuvent être différenciés par une injection intraveineuse d’anticorps anti-Ly6G marqués par la FITC 5 minutes avant le sacrifice, suivie d’un marquage de tous les neutrophiles avec des anticorps APC-Ly6G18,24. Des graphiques représentatifs montrent que ~75 % des neutrophiles sont intravasculaires (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) et ~25 % sont interstitiels (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) après clampage hilaire du poumon gauche (Figure 7C, n=4). Ces résultats démontrent un moyen fiable d’évaluer l’extravasation des neutrophiles et peuvent être adaptés à d’autres types de cellules en fonction des anticorps utilisés (c’est-à-dire anti-Ly6C pour les monocytes, anti-CD19 pour les lymphocytes B). Cette technique est utile pour l’étude de la dynamique cellulaire après l’IRI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2.jpg"> Figure 1 : Intubation chez la souris. (A) Souris avec la poitrine gauche et l’abdomen rasés. (B) Sonde endotrachéale reliée à la tubulure du ventilateur. (C) Une fois l’intubation confirmée, collez le tube sur la circonférence du nez de la souris. (D) Souris intubée avec tube d’entrée et de sortie depuis et vers le ventilateur pour petits animaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig02.jpg"> Figure 2 : Thoracotomie gauche. (A) Incision cutanée sur le 4e espace intercostal (ICS). (B) Couches musculaires divisées sur le 4ème espace intercostal. (C) Faire une petite incision juste au-dessusde la 5 ème côte. (D) Extension de l’incision vers l’avant et vers l’arrière dans la4e ICS. (E) Poumon visualisé dans le 4eICS. (F-G) Écarteurs de côtes placés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig03.jpg"> Figure 3 : Pince hilaire gauche. (A) Poumon gauche mobilisé à l’aide de cotons-tiges. (B) Ligament pulmonaire inférieur (LPI) visualisé. (C) Avec le poumon gauche retourné vers l’avant, une cravate de soie est placée à l’arrière du hile. (D) Avec la gauche retournée vers l’arrière sur la cravate de soie, le hile antérieur est visualisé. (E) Attache d’instrument du nœud coulant sur le hile gauche. (F) Nœud coulant sur le hile. (G) Avec l’occlusion manuelle de l’écoulement, le poumon gauche ne se gonfle pas, ce qui indique que la pince hilaire a réussi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig04.jpg"> Figure 4 : Relâchement de la pince hilaire gauche et fermeture de la poitrine gauche. (A) Une fois le noeud coulant relâché, le poumon gauche est regonflé. (B) Fermeture des côtes avec une morsure juste au-dessus de la 4e côte et (C) une morsure juste au-dessus de la 6e côte. (D-E) Poitrine fermée par une maille attachée à la fin de l’inspiration. (F) Fermeture de la peau avec points de suture interrompus (après fermeture de la couche musculaire avec point de courant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig05.jpg"> Figure 5 : Laparotomie, thoracotomie bilatérale à clapet et prélèvement de sang artériel. (A) Souris ajustée en position couchée. (B) Incision cutanée pratiquée sur la ligne médiane de l’abdomen. (C) Laparotomie s’étendant de la xiphoïde au pubis, avec extension à gauche et à droite le long de la côte la plus inférieure. (D-E) Ouverture du diaphragme pour pénétrer dans la cavité thoracique, avec extension de l’incision du diaphragme à gauche et à droite le long de la côte la plus inférieure (ligne pointillée). (F) Thoracotomie bilatérale à clapet avec incisions dans les lignes axillaires antérieures (ligne pointillée) vers l’apex du thorax. (G) Lobe accessoire du poumon droit s’étendant dans le thorax gauche postérieur à la veine cave inférieure. (H) Lobe de l’accessoire mobilisé et renvoyé vers la poitrine droite. (I) Aspiration du sang artériel du ventricule gauche (encadré : différence de couleur entre les ventricules droit et gauche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig06.jpg"> Figure 6 : Injection intraveineuse dans la veine cave inférieure. (A) Rotation viscérale médiale droite pour exposer la veine cave inférieure (VCI). (B) Injection de solution dans la VCI. (C) Application d’une pression sur la VCI pour obtenir l’hémostase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig07.jpg"> Figure 7 : Résultats représentatifs de l’oxygénation pulmonaire, de l’histologie et de l’extravasation des neutrophiles après clamp hilaire gauche. (A) Pression partielle d’oxygène dans le sang artériel d’une souris C57BL/6 ayant subi une thoracotomie simulée par rapport à la clamp hilaire. Les résultats sont présentés sous forme de ± moyenne SEM, n = 6-7. p calculées par le test U de Mann-Whitney. **P &lt;0,01. (B) Coloration H&amp;E d’une section pulmonaire fixée au formol et incluse dans la paraffine d’une souris C57BL/6 qui a subi une thoracotomie simulée par rapport à une pince hilaire. La barre d’échelle représente 250 μm. (C) Figure représentative de la distribution des neutrophiles Ly6G+ intravasculaires (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) par rapport aux neutrophiles Ly6G+ extravasculaires (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) dans une souris C57BL/6 après clamp hilaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Introducteur pour sonde endotrachéale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/Supplemental_Figure_1_updated.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le protocole décrit une méthode réalisable, fiable et reproductible de clampage hilaire pulmonaire gauche qui peut être utilisée pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion pulmonaire dans des modèles murins.

Modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire

Ischemia reperfusion injury (IRI) during lung transplantation is a major risk factor for post-transplant complications, including primary graft ...

Nous nous intéressons à l’étude des effets des lésions d’ischémie-reperfusion sur les résultats après une transplantation pulmonaire dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les neutrophiles qui pénètrent dans les poumons contribuent aux lésions d’ischémie-reperfusion, ou IRI. Nous avons récemment découvert que les lymphocytes B pénètrent dans les poumons et qu’ils jouent un rôle dans le recrutement des neutrophiles après l’IRI.La transplantation du poumon gauche chez la souris est techniquement difficile et nécessite une formation dédiée à temps plein sur plusieurs mois pour obtenir des résultats cohérents. De plus, il introduit une allergénicité et un traumatisme anastomotique chirurgical. Ainsi, nous avons besoin d’une technique plus accessible qui puisse isoler l’étude des lésions d’ischémie-reperfusion.En utilisant notre modèle de clamp hilaire, nous avons constaté que les lymphocytes B pénètrent dans le poumon tôt après une lésion d’ischémie-reperfusion, et qu’ils recrutent des monocytes classiques dans un récepteur de lymphocytes B de manière dépendante de TLR4. Cela se traduit finalement par une augmentation de l’extravasation des neutrophiles dans les poumons. Notre protocole implique une ligature de suture réversible du hile pulmonaire gauche avec un nœud coulant.La nature souple et discrète de la suture permet la fermeture de la poitrine, ce qui est utile pour étudier de plus longues périodes d’ischémie chaude, car la fermeture de la poitrine minimise les pertes de chaleur et de liquide insensible chez la souris.

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Un traumatisme chirurgical induit une réponse inflammatoire. Les cytokines et les ligands endogènes sont connus pour moduler la taille infarctus du myocarde après une ischémie et la reperfusion. Nous présentons une version modifiée à thorax fermé modèle murin d'ischémie et la reperfusion en utilisant les pondérations suspendus pour minimiser les effets de la thoracotomie.

Un murin à thorax fermé Modèle d&#39;ischémie myocardique et la reperfusion

Nous introduisons une méthode chirurgicale pour induire expérimental d'ischémie / reperfusion (I / R) des blessures pour simuler un infarctus du myocarde (IM) dans les modèles de souris qui permet une plus grande clarté dans le positionnement de la ligature sur l'artère interventriculaire antérieure gauche (LAD) d'augmenter la reproductibilité d'expériences MI chez la souris.

Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

Un modèle de pince hilaire de foie de rat unique a été développé pour étudier l'impact des molécules pharmacologiques dans l'amélioration ischémie-reperfusion. Ce modèle comprend la canulation directe de la fourniture de portail au segment hépatique ischémique via une branche de la veine porte, permettant une livraison directe hépatique.

Méthode de Direct segmentaire livraison intra-hépatique L&#39;utilisation d&#39;un modèle hilaire de foie de rat Clamp

Ici nous décrivons une procédure chirurgicale montrant comment réaliser la ligature permanente de l'artère coronaire descendante gauche-antérieure chez les souris. Ce modèle est d'une grande pertinence pour étudier la pathophysiologie de l'infarctus du myocarde et les processus biologiques concomitants.

Modèle d'infarctus myocarde de Murine utilisant la ligation permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche

Nous décrivons en détail un modèle de tumeur de métastases de foie de cancer côlorectal médicalement pertinent (CRLM) et l'influence de la reperfusion d'ischémie de foie (I/R) dans la croissance de tumeur et la métastase. Ce modèle peut aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la promotion induite par la chirurgie de la croissance métastatique du foie.

Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Le modèle d’ischémie-reperfusion myocardique du cœur de rat est amélioré en utilisant un rétracteur auto-fabriqué, un tube de polychlorure de vinyle et une méthode de nouage unique. L’électrocardiogramme, le chlorure de triphényltétrazolium et la coloration histologique, ainsi que les résultats de l’analyse de la survie en pourcentage ont montré que le groupe modèle amélioré a des taux de réussite et de survie plus élevés que le groupe modèle déjà existant.

Modèle de rongeur amélioré de l’ischémie myocardique et de la lésion de reperfusion

Un modèle chirurgical murin pour créer une lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire gauche (IR) tout en maintenant la ventilation et en évitant l’hypoxie.

Un modèle murin d’intubation orotrachéale et de chirurgie de reperfusion d’ischémie pulmonaire ventilée

Présenté ici est une procédure chirurgicale pour la ligature permanente de l’artère coronaire gauche chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et la réponse inflammatoire associée après un infarctus du myocarde.

Ligature de l’artère coronaire gauche: un modèle murin chirurgical d’infarctus du myocarde

Cette étude décrit un modèle de lésion pulmonaire aiguë suite à une ischémie-reperfusion viscérale lors d’un clampage croisé de l’aorte supra-cœliaque par laparotomie chez le rat. Il permet d’étudier à la fois les effets cliniques et biologiques du clampage aortique ainsi que l’impact de l’ischémie-reperfusion sur les organes sous-jacents et les lésions pulmonaires à distance.

Modèle de lésion pulmonaire aiguë à la suite d’une ischémie-reperfusion viscérale par clampage croisé de l’aorte supra-cœliaque chez le rat

Nous décrivons les modèles de lésions rénales ischémie-reperfusion induite modérée et sévère dans laquelle les souris subissent unilatérale pédicule rénal serrage suivie par néphrectomie controlatérale simultanée ou différée, respectivement. Ces modèles donnent systématiquement lieu à une insuffisance rénale et une fibrose post-traumatique, mais la gravité des blessures et la survie dépendent de fond, l'âge et chirurgical de la souris.

Ischémie-reperfusion modèle de lésions rénales aiguës et post blessures fibrose chez la souris

Apprenez le clampage hilaire pulmonaire gauche chez la souris pour étudier les lésions d'ischémie-reperfusion. Cette méthode accessible isole les mécanismes cellulaires impliquant les neutrophiles et les lymphocytes B.

Modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire

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