Name: Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Apprenez à isoler des cellules de Müller gliales rétiniennes primaires de souris. Cette méthode permet d'étudier leur rôle dans les maladies rétiniennes et de développer des cibles thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), le fonds R01 EY029751-04 du National Eye Institute (NEI). Nous tenons à remercier la Dre Sylvia B. Smith, car ce protocole a été modifié sur la base de son protocole d’isolement des cellules de Müller.

Toutes les expériences sur des animaux étaient conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été réalisées conformément à notre protocole sur les animaux approuvé par le comité de l’Institute for Animal Care and Use (IACUC) et aux politiques de l’Université d’Oakland (numéro de protocole 2022-1160)
1. Préparation du milieu et de la solution
<ol><li>Préparez la solution oculaire à cellules de Müller en complétant le milieu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, détails dans le tableau des matériaux) avec de la pénicilline/streptomycine à la dilution de 1:1000. Par exemple, pour 10 ml de DMEM, ajoutez 10 μL de pénicilline/streptomycine. REMARQUE : Il s’agit d’un simple milieu sans sérum préparé. Réchauffez également l’ensemble du milieu dans un bain-marie à 37 °C avant de l’utiliser pour des travaux de culture cellulaire.</li>
	<li>Préparez un milieu de croissance cellulaire primaire complet en complétant le DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS, inactivé par la chaleur) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Par exemple (500 ml de média DMEM + 50 ml de FBS + 5 ml de pénicilline/streptomycine).</li>
	<li>Préparez une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % avec de la collagénase IV à une concentration de 200 U/mL (la trypsine-EDTA est utilisée pour dissoudre la quantité calculée de poudre de collagénase IV afin d’atteindre la concentration nécessaire).</li>
</ol>2. L’énucléation
<ol><li>Euthanasier éthiquement la souris en utilisant l’inhalation de CO2 conformément aux directives de l’IACUC.<ol><li>Brièvement, placez le ou les animaux dans la chambre de CO2 pour introduire 100 % de CO2 à un taux de remplissage de 30 à 70 % de la chambre vol/min avec du CO2 afin d’atteindre l’objectif d’une perte de conscience rapide en 2 à 3 minutes avec une détresse minimale pour les souris.</li>
		<li>Étant donné que les souris sont à un jeune âge (~10 jours), effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire pour assurer une euthanasie appropriée.</li>
	</ol></li>
	<li>Après avoir stérilisé la zone de travail avec de l’éthanol à 70 %, placez la souris sur un sous-tampon stérile.</li>
	<li>Extrayez les yeux en plaçant les bras de la pince à épiler à l’arrière de l’œil, en tirant doucement sur la zone orbitaire et en isolant les yeux en appliquant une pression avec une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitaire pour provoquer une proptose. REMARQUE : Stérilisez les outils de dissection avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution saline tampon phosphate avant la dissection.</li>
	<li>Assurez-vous que le nerf optique est toujours connecté à l’œil en incubant lentement l’œil. Assurez-vous de tirer le nerf optique (identifié visuellement comme un cordon blanc) derrière l’œil. REMARQUE : Cette étape n’a pas besoin d’être effectuée au microscope et peut être effectuée sur une paillasse stérilisée.</li>
</ol>3. Traitement des yeux énucléés
<ol><li>Couvrez un tube à centrifuger de 15 ml avec du papier d’aluminium et remplissez le tube avec 10 ml de la solution pour les yeux à cellules Müller.</li>
	<li>Placez les yeux disséqués dans le tube de 15 mL contenant la solution pour les yeux à cellules de Müller et laissez-les reposer toute la nuit, soit environ 18 h, à température ambiante.</li>
	<li>Après 18 h, décantez la solution pour les yeux et rincez-les brièvement avec 2 à 3 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) réchauffée (37 °C).</li>
	<li>Décantez le PBS et placez les yeux dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de solution de trypsine. (préparé à l’étape 1.3). REMARQUE : La trypsine est utilisée sur l’ensemble de l’œil énucléé, agissant comme un agent dissociatif pour faciliter la séparation cellulaire des couches rétiniennes pendant la dissection. La rétine disséquée contient de nombreuses cellules, y compris des cellules EPR, qui sont collantes et sont les plus susceptibles de contaminer la culture cellulaire de Müller14. L’examen microscopique a clairement montré qu’après 5 jours d’isolement (lors du premier changement de milieu), les cellules EPR se sont détachées de la plaque et sont mortes13. Le milieu utilisé pour l’isolement de l’EPR est le DMEM/F-12, avec une composition différente de celle du DMEM (utilisé dans l’isolement des cellules de Müller), contenant du pyruvate de sodium et une faible teneur en glucose.</li>
	<li>Placez le plat dans un incubateur et incubez pendant 1,5 à 2 h à 37 °C et 5% de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, transférez les yeux dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant environ 5 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.</li>
</ol>4. Dissection
REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée dans l’environnement stérile de la hotte de culture. Par conséquent, il est essentiel de stériliser soigneusement les surfaces de la hotte avec de l’alcool à 70%, ainsi que tous les outils et le microscope de dissection. Il convient de noter que la vidéo a été enregistrée à l’extérieur du capot pour une meilleure visibilité et des démonstrations plus claires.
<ol><li>Placez un petit morceau de tissu de laboratoire stérilisé dans la boîte pour aider à stabiliser les yeux pendant la dissection. Placez les yeux sous un microscope à dissection pour commencer la dissection. REMARQUE : L’utilisation de tissu de qualité laboratoire facilite la manœuvre des yeux dans une boîte remplie de liquide (milieu complet), assurant une dissection précise.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux Vannas et une pince à épiler de type M5S pour enlever le tissu conjonctif, les muscles extraoculaires et le nerf optique.<ol><li>Saisissez l’œil avec une pince à épiler de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata avec des ciseaux Vannas ou une aiguille de seringue. REMARQUE : Il y a une ligne circulaire bleu clair entre la partie antérieure et postérieure de l’œil appelée ora serrata, qui peut être utilisée comme point de repère pour une direction précise pendant la dissection.</li>
		<li>Saisissez l’incision à l’aide d’une pince à épiler de type M5S et tirez ou déchirez la cornée de la partie postérieure de l’œil. Tirez par petits incréments pour vous assurer que l’intégrité de la rétine reste intacte. REMARQUE : Ces étapes consistent à retirer la partie antérieure de l’œil (cornée, iris et cristallin) de la partie postérieure de l’œilleton (rétines neurales et pigmentées).</li>
		<li>Pour maintenir l’intégrité des couches rétiniennes, tirez doucement et retirez l’épithélium pigmenté rétinien de la rétine neurale. La rétine neurale doit être exempte de toute tache noire pour assurer autant que possible la pureté de l’isolement, car la couche RPE est généralement collante et attachée à la rétine neuronale.</li>
		<li>Coupez la rétine neurale disséquée en petits morceaux avant de la rassembler dans une plaque pour assurer une répartition homogène des cellules sur la plaque.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez les rétines neurales dans une fiole T25 contenant 4 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.</li>
	<li>Enfin, placez le ballon dans un incubateur et incubez à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
</ol>5. Culture de cellules gliales primaires de Müller
<ol><li>Ne déplacez pas le flacon pendant 3 à 5 jours pour favoriser la croissance cellulaire.</li>
	<li>Changez de milieu après le cinquième jour et tous les deux jours par la suite jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.</li>
</ol>6. Passage des cellules gliales primaires de Müller
<ol><li>Aspirer le milieu de culture cellulaire Müller, puis appliquer 2 mL de lavage dans du PBS et aspirer le PBS. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (1x), ou assez pour couvrir l’assiette.</li>
	<li>Incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Assurez-vous que les cellules sont détachées de la plaque au microscope. Ensuite, prélever la suspension cellulaire et ajouter 4 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet préchauffé (37 °C) (préparé à l’étape 1.2) dans le tube de prélèvement.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 7 min à 300 x g. Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet. Étant donné que le nombre de cellules peut varier en fonction du nombre d’yeux disséqués, il est donc préférable de compter les cellules avant l’ensemencement et l’incubation. La densité de semis recommandée est de 3,0 x 106 cellules dans une fiole T75. REMARQUE : Les cellules peuvent être traversées jusqu’à 4-5 fois. Cependant, les résultats d’expérience les plus cohérents se trouvent après 1 à 2 passages.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
REMARQUE : Utilisez le protocole d’immunofluorescence pour colorer et valider la spécificité des cellules de Müller. Voici un bref aperçu du protocole d’immunofluorescence. Cette étape est effectuée après le premier passage12.
<ol><li>Ensemencez les cellules dans une lame de chambre de culture cellulaire (30 000 cellules par puits pour une lame de chambre à 8 puits).</li>
	<li>Cultivez les cellules isolées pendant 24 à 48 h dans un milieu de culture cellulaire Müller complet (préparé à l’étape 1.2) à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Aspirez le média et lavez la lame de la chambre avec 250-300 μL de 1x PBS sur chaque puits lorsque les cellules sont confluentes à 80-90%.</li>
	<li>Fixez la lame pendant 10 à 15 minutes dans 250-300 μL de paraformaldéhyde à 4 % sur chaque puits, suivie d’un lavage avec PBS/TX-100 (5 min chacun/3x).</li>
	<li>Ajouter un tampon de blocage pendant 1 h à 37 °C (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Aspirez la solution bloquante, puis ajoutez les anticorps primaires spécifiques des cellules de Müller pour confirmer la pureté des cellules isolées à l’aide de la glutamine synthétase et de la vimentine 5,12. Incuber pendant 3 h à 37 °C (en utilisant une concentration d’anticorps de 1:100-1:200 dans un tampon de blocage dans un volume de 150-200 μL/lame). Lavez la diapositive avec des lavages PBS/TX-100 (5 et 10 min chacun). REMARQUE : Ces anticorps ont été choisis car ils sont caractéristiques de l’identification des cellules de Müller et de la garantie du succès et de la pureté de la culture de cellules de Müller.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps secondaire (avec une concentration d’anticorps allant de 1:1000 dans un tampon de blocage dans une lame de 150 à 200 μL) et incuber pendant 1 h à 37 °C. Ensuite, lavez avec PBS/Triton X-100, trois fois (5 à 10 minutes chacune).</li>
	<li>Appliquez une goutte de support de montage DAPI pour étiqueter les noyaux avant de recouvrir la lame avec une lamelle. Évitez les bulles d’air lors de la mise en place de la lamelle.</li>
	<li>Utilisez un microscope fluorescent pour vérifier la lame et capturer des images (voir la table des matériaux). REMARQUE : Les cellules sont localisées avec DAPI à ex/em 359/461 à un grossissement de 10x pour localiser les cellules ; Un grossissement plus élevé peut capturer des cellules. D’autres longueurs d’onde dépendraient de la couleur choisie. Couleur verte (GFP)- ex/em 488/510. Couleur rouge (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer qui soit pertinent pour le contenu de cet article.

L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans des publications antérieures et notre protocole modifié que nous avons utilisé dans une publication récente1 2,13. Bien que les étapes soient simples, l’isolement réussi des cellules de Müller nécessite le respect de restrictions spécifiques et d’exigences essentielles. Après de nombreuses tentatives d’essais et d’erreurs pour optimiser ce protocole, de multiples facteurs influençant son succès ont été identifiés.
L’âge idéal de la souris, tel qu’observé dans nos expériences, s’est avéré être entre 5 et 11 jours afin de faire croître les cellules isolées jusqu’à quatre passages. La culture est également influencée par le nombre d’yeux isolés et cultivés. Pour l’isolement simple, au moins deux yeux sont nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour pouvoir croître et se multiplier. Un autre aspect important est la durée entre l’énucléation et le placage ; Par conséquent, cette étape doit être effectuée relativement rapidement. Il a été observé que la manipulation prolongée du tissu oculaire a un effet néfaste sur la capacité des cellules à adhérer au ballon et à se multiplier. Pour s’assurer que la proximité des cellules isolées est suffisamment proche pour favoriser la prolifération, nous conseillons d’utiliser une fiole T25. Une fois le premier passage effectué, les cellules peuvent être plaquées sur un T75. De plus, les cellules ne doivent pas être perturbées après l’isolement et l’ensemencement en retirant le flacon de culture tissulaire de l’incubateur ou en changeant le milieu pendant au moins 5 jours. Enfin, les cellules ne peuvent être évacuées qu’environ quatre fois avant de cesser d’adhérer. Bien que cette procédure soit simple et facile à réaliser, elle présente certaines limites, notamment l’âge des souris, le nombre limité de passages cellulaires, etc.
Il n’y a pas beaucoup de protocoles pour l’isolement des cellules de Müller, mais il existe quelques différences notables entre ce protocole et les protocoles disponibles 5,14. Tout d’abord, le temps entre l’énucléation et l’isolement est significativement différent. D’autres protocoles suggèrent une dissection peu de temps après l’énucléation, généralement dans les 10 minutes. Alors que le protocole actuel suggère une période de repos d’au moins 18 h, car cela a fourni les meilleurs résultats pour l’isolement dans ce protocole. Une autre différence significative entre ce protocole et d’autres protocoles est le point où les yeux sont traités avec des enzymes. Dans ce protocole, les yeux sont traités avant que toute dissection ne soit réalisée, avant même l’ablation du tissu conjonctif et des muscles extraoculaires. Alors que d’autres protocoles isolent les rétines de l’œil avant le traitement enzymatique. De plus, la recette des enzymes est également différente. Dans ce protocole, la solution enzymatique se compose de trypsine et de collagénase de type IV. Dans des protocoles similaires, la papaïne et la DNase sont utilisées pour la digestion des tissus. De plus, le récipient de culture est différent, ce protocole suggère de cultiver sur un T25 puis sur un T75 après le premier passage. Alors que d’autres protocoles utilisent des boîtes de Pétri ou des plaques multi-puits. Enfin, ce protocole suggère de ne pas déranger le ballon (pendant 5 à 7 jours) pour favoriser la croissance cellulaire. Alors que dans d’autres protocoles, le changement de support est effectué après une journée.

Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine1. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés contribuent à diverses maladies rétiniennes, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et le glaucome 2,3. Les MC peuvent être des sources cellulaires endogènes pour la thérapie régénérative dans la rétine1. Elles comprennent également une partie importante de la rétine, et des preuves solides suggèrent que chez plusieurs espèces, ces cellules peuvent être stimulées pour remplacer les neurones manquants2. Ils collaborent avantageusement avec les neurones, et les extrémités des cellules de Müller à ramification conique dégainent densément les vaisseaux sanguins et relient les composants neuronaux de la rétine. Afin de maintenir le développement neuronal et la plasticité neuronale, les cellules de Müller agissent comme un substrat mou pour les neurones, les protégeant des traumatismes mécaniques3. De plus, dans des circonstances pathologiques, les cellules de Müller peuvent se différencier en progéniteurs neuraux ou en cellules souches qui répliquent ou régénèrent les photorécepteurs et les neurones perdus 2,3,4. Les cellules de Müller conservent les caractéristiques des cellules souches rétiniennes, y compris différents niveaux de potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation 5,6. La cellule gliale de Müller possède une lignée rétinienne significative qui produit des facteurs neurotrophiques, absorbe et recycle les neurotransmetteurs, tamponne spatialement les ions et maintient la barrière hémato-rétinienne afin de maintenir la rétine en homéostasie 7,8,9. Cela met en évidence le potentiel des cellules de Müller en tant qu’outil prometteur dans les thérapies cellulaires pour traiter les maladies liées à la dégénérescence rétinienne. Les cellules de Müller sont les cellules gliales primaires réparties dans toute la rétine, se connectant à la fois aux neurones et aux vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle protecteur crucial, fournissant un soutien structurel et métabolique essentiel pour maintenir la viabilité et la stabilité des cellules rétiniennes. Malheureusement, très peu de protocoles sont trouvés dans la littérature pour l’isolement des cellules primaires de Müller de la rétine10,11.
Nous présentons une approche améliorée pour isoler et cultiver de manière fiable des cellules primaires de Müller de souris. Ce protocole a été utilisé dans notre groupe pour isoler les cellules de Müller des souris C57BL/6 de type sauvage et des souris transgéniques 12,13. Des souris âgées de 5 à 11 jours, sans préférence sexuelle, sont utilisées pour ce protocole. Les cellules ont été traversées jusqu’à 4 fois ; cependant, à P4, ils cessent d’adhérer au ballon et il devient difficile de cultiver une culture saine. La culture est souvent contaminée par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), de sorte que les cellules doivent être passées au moins une fois avant d’effectuer des expériences supplémentaires sur la lignée cellulaire. Le passage permet une meilleure isolation des contaminants. Par conséquent, le protocole présenté offre un moyen rapide et efficace d’isoler les cellules de Müller de souris, qui peuvent ensuite être utilisées comme une plate-forme fiable pour rechercher des cibles thérapeutiques et évaluer des traitements potentiels pour les maladies de la rétine14.

<table><tbody><tr><td>Bécher : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&nbsp ;</td><td>Worthington&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Pipettes de transfert graduées jetables :3,2 mL</td><td></td> stériles <td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media pour développer M&uuml ; cellules LLER°</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Pour milieu de culture cellulaire Muller complet</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i Incubateur CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok avec aiguille attachée 21 G x 1 1/2 po, stérile, à usage unique, 3 mL</td><td>B-D</td><td></td><td></td>309577</tr><tr><td>Micro tube à centrifuger : 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Stylo Strep gibco</td><td></td><td>15140-122</td><td>Pour M&uuml complet ; Milieu de culture cellulaire ller</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer salin (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td>Pince</tr> à <tr><td>épiler à action positive AP, style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Iris Standard Droit 11,5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall St8 ThermoScientific</td><td></td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale, #11, Acier inoxydable</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture en suspension 60 mm x 15 mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire : 100 x 20 mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes : 15 ml</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Tornado : 50 ml</td> Pince à épiler <td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>5MS, 8,2 cm, droite, 0,09 x 0,05 mm Pointes</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler Positive Action Style 5, Biologique, Dumostar, Finition polie, 110 mm OAL</td><td>Microscopie électronique Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Sous-coussin, Modéré : 23 » x 36"</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Ciseaux à ressort - 2.5mm Tranchant</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp ;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction barrière des cellules de Müller isolées Pour confirmer la viabilité, la morphologie et les qualités distinctives des cellules de Müller isolées, les cellules ont été examinées au microscope optique. Des images P0 et P1 ont été enregistrées (Figure 1A). Pour vérifier la contamination des cellules de Müller isolées par des cellules EPR et confirmer leur pureté, une coloration par immunofluorescence (FI) a été réalisée à l’aide d’anticorps spécifiques du marqueur de cellule EPR, RPE65. Des cellules pigmentées rétiniennes humaines (ARPE -19) ont été utilisées comme contrôle positif. Les cellules EPR colorées au RPE65 (rouge et bleu pour la coloration nucléaire) sont illustrées à la figure 1B (panneau inférieur). Les anticorps spécifiques de RPE65 n’ont pas coloré les cellules de Müller isolées (Figure 1B, panneau supérieur). Le fait que le RPE65 ait coloré les cellules ARPE-19 (en rouge) et n’ait pas coloré les cellules isolées indique que les cellules isolées ne sont pas des cellules RPE. La présence de pyruvate et d’un faible taux de glucose dans le milieu crée des conditions défavorables à la croissance des cellules EPR. Par conséquent, même en cas de contamination des cellules EPR, elles finiront par se détacher du flacon.
De plus, pour confirmer l’identité des cellules isolées, une coloration par immunofluorescence des cellules de Müller pour des marqueurs spécifiques des cellules de Müller a été utilisée pour confirmer l’isolement réussi des cellules de Müller. La protéine de filament intermédiaire du cytosquelette appelée vimentine a été utilisée12,13. De plus, la glutamine synthétase (GS), qui catalyse la réaction de condensation du glutamate et de l’ammoniac pour former de la glutamine, en tant que fonction clé des cellules gliales de Müller rétiniennes, a également été utilisée5.
Collectivement, les cellules isolées ont été colorées négatives pour RPE65 (rouge, figure 1B), positives pour la vimentine (vert, figure 1C) et GS (vert, figure 1D). La coloration IF confirme l’isolement réussi (pureté et spécificité) des cellules de Müller isolées. La figure 1E est un contrôle négatif pour la vimentine (panneau supérieur) et GS (panneau inférieur), confirmant la spécificité des anticorps.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> Figure 1 : Validation de l’isolement cellulaire de Müller (pureté et spécificité). (A) Image de microscopie optique pour les passages : passage zéro(P0)et(P1)morphologie. (B) l’immunocoloration RPE65 combinée à la coloration nucléaire DAPI. (C) Immunomarquage à la vimentine avec coloration nucléaire DAPI à fort grossissement. (D) Immunomarquage GS au même grossissement élevé. (E) des contrôles négatifs pour confirmer la spécificité de la coloration de la vimentine et des anticorps GS. Barre d’échelle = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

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Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

Cette vidéo montre la culture de cellules gliales de Müller (MG) isolées de rétines de souris. Les rétines sont dissociées en une suspension unicellulaire à l’aide d’enzymes digestives. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu avec un facteur de croissance qui favorise la prolifération des cellules MG et la mortalité des cellules neuronales. Les cellules neuronales mortes sont éliminées pendant le passage et les cellules MG sont cultivées pour une analyse plus approfondie.

Etablissement d’une culture de cellules gliales de Müller obtenue à partir de rétines de souris

Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l'isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Nous décrivons ici l’isolement de cellules gliales-entérique de la sous-muqueuse intestinale à l’aide des incubations EDTA séquentielles pour chélater les cations divalents, puis incubation dans une solution de récupération non enzymatique cellulaire. Placage de la suspension de cellules qui en résultent sur le poly-D-lysine et de la laminine se traduit par une culture fortement enrichie des cellules gliales sous-muqueux analyse fonctionnelle.

Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Cet article présente un protocole détaillé pour isoler les cellules primaires de Müller de la rétine chez le rat Sprague-Dawley (SD) néonatal. La procédure comprend l’énucléation des globes oculaires, la dissection du tissu rétinien, l’extraction et l’identification des cellules, ainsi que des considérations clés pour la culture cellulaire ultérieure.

Isolement et culture de cellules primaires de Müller rétiniennes chez des rats Sprague-Dawley (SD)

Apprenez à isoler des cellules de Müller gliales rétiniennes primaires de souris. Cette méthode permet d'étudier leur rôle dans les maladies rétiniennes et de développer des cibles thérapeutiques.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

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