Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Les cellules de Muller sont les principales cellules gliales de la rétine. Ils jouent un rôle très important dans le maintien des neurones hautement métaboliquement actifs de la rétine. Notre laboratoire a mis au point une technique pour isoler les cellules de Muller des yeux de souris. Cette technique permettra d’étudier le rôle des cellules de Muller dans différentes maladies de la rétine, de comprendre la pathogenèse des maladies, mais aussi de développer des cibles thérapeutiques.

[Narrateur] Euthanasiez la souris de manière éthique selon les méthodes approuvées par votre établissement. Énucléez les yeux en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitaire pour induire l’expulsation, suivie d’une extraction de l’œil en positionnant les bras de la pince à épiler à l’arrière de l’œil, puis d’une traction douce de la zone orbitaire. Placez les yeux dans 10 ml de la solution pour les yeux à cellules de Muller et laissez-les reposer toute la nuit, ou pendant environ 18 heures à température ambiante. Après 18 heures, décantez la solution pour les yeux en la versant hors du tube à jeter. Lavez les yeux avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS réchauffée. Décantez à nouveau le PBS en le versant hors du tube à jeter. Placez ensuite les yeux dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 10 ml de la solution de trypsine. Placez le plat dans un incubateur et incubez pendant 1,5 à 2 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après l’incubation, transférez les yeux dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant environ cinq ml de milieu de croissance cellulaire primaire Muller complet. Il convient de noter que la vidéo a été enregistrée à l’extérieur du capot pour une meilleure visibilité et une démonstration claire. Pour les expériences réelles, elles doivent être menées dans une hotte à flux laminaire, comme illustré. Placez les yeux sous un microscope à dissection et commencez à disséquer. Utilisez une pince à épiler de style M5S et des ciseaux Vannas pour enlever le tissu conjonctif, les muscles extraoculaires et le nerf optique. Ici, le nerf optique est coupé avec des ciseaux Vannas. Saisissez l’œil avec une pince à épiler de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata avec des ciseaux Vannas ou l’aiguille d’une seringue. Saisissez l’incision avec deux pinces à épiler de style M5S et commencez à tirer ou à déchirer la cornée de la partie postérieure de l’œil. Tirez par petits incréments pour vous assurer que l’intégrité de la rétine reste intacte. Voici une démonstration sur la façon de retirer la cornée de la partie postérieure de l’œilleton. Une fois que le cristallin et la rétine neurale sont exposés, retirez la couche pigmentée de l’œil, qui a probablement l’iris qui y adhère. Retirez ensuite la rétine neurale du cristallin. Retirez tout tissu pigmenté de la rétine neurale pour améliorer la pureté de l’isolement. Étant donné la nature collante de la rétine neurale, il est peu probable que vous enleviez tous les tissus pigmentés. Collectez toutes les rétines neurales et déchirez-les en petits morceaux. Plaquez les rétines neurales dans une fiole T25 contenant quatre ml de milieu de croissance cellulaire primaire complet de Muller. Enfin, placez le ballon dans un incubateur et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le panneau A montre une culture cellulaire de Muller saine au passage zéro et au passage un. L’absence de pigment indique l’absence de cellules EPR, qui sont le principal contaminant de l’isolement. Celui-ci est renforcé dans le panneau B par le RP65, un marqueur spécifique au RP.