Name: Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez la mesure du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant à l'aide d'un capteur protéique sensible et de la cytométrie en flux. Cette méthode permet d'étudier les réponses dynamiques du parasite aux fluctuations de nutriments.

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pHluorin2-PTS1 a été cloné en pLEW100v5 par Twist Bioscience qui a fourni la construction dans un vecteur de clonage à haute copie ; pLEW100v5 était un cadeau du Dr George Cross. L’antisérum contre T. brucei aldolase est disponible sur demande auprès du Dr Meredith T. Morris, de l’Université de Clemson. Les travaux des laboratoires JCM et KAC ont été partiellement soutenus par un prix des National Institutes of Health (R01AI156382). Le SSP a été soutenu par le NIH 3R01AI156382.

Développement d’une sonde à base de pHluorin2 pour le pH glycosomal chez Trypanosoma brucei

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La perception environnementale et les mécanismes de réponse du trypanosome africain sont mal compris. Les changements dans la disponibilité des nutriments sont connus pour déclencher diverses réponses chez le parasite, y compris l’acidification des glycosomes. Ici, nous avons décrit une méthode pour étudier la réponse du pH glycosomal aux perturbations environnementales dans les cellules vivantes à l’aide d’un capteur de protéines héréditaires, pHluorin2, et de la cytométrie en flux.
Il y a pl...

Les kinétoplastides parasites, comme la plupart des organismes vivants, dépendent du glucose comme composant fondamental du métabolisme central du carbone. Ce groupe comprend des organismes médicalement importants, tels que le trypanosome africain, Trypanosoma brucei ; le trypanosome américain, T. cruzi ; et les parasites du genre Leishmania. Le métabolisme du glucose est essentiel à la croissance du parasite dans les stades du cycle de vie pathogène. Par exemple, lorsqu’il est privé de glucose, la forme sanguine (BSF) du trypanosome africain meurt rapidement. Notamment, la glycolyse est la seule source d’ATP à ce stade de l’infection1. Les parasites Leishmania dépendent également du glucose de l’hôte humain, le stade du cycle de vie de l’amastigote qui réside dans les macrophages de l’hôte dépendant de cette source de carbone pour sa croissance2.
Bien que ces parasites aient des modes de vie distincts impliquant différents insectes vecteurs, ils partagent de nombreux points communs dans la façon dont ils réagissent et consomment le glucose. Par exemple, ces parasites localisent la plupart des enzymes glycolytiques dans des peroxysomes modifiés appelés glycosomes. Cet organite spécifique au kinétoplastide est apparenté aux peroxysomes de mammifères sur la base de mécanismes de biosynthèse conservés et de morphologie 3,4,5,6.
La compartimentation de la plupart des enzymes de la voie glycolytique dans le glycosome offre des moyens spécifiques au parasite de réguler la voie. À l’aide d’une sonde de pH chimique, nous avons établi que la privation de nutriments déclenche une acidification rapide des glycosomes parasitaires de forme procyclique (PF) qui entraîne une altération de l’activité enzymatique glycolytique par exposition d’un site de liaison régulateur allostérique sur l’enzyme glycolytique clé hexokinase 7,8. Dans nos travaux précédents, la sonde chimique nécessitait une livraison constante pour être utilisée, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications. De plus, les difficultés à maintenir la distribution de la sonde dans le glycosome dans le BSF ont limité l’utilité de l’approche pour étudier le pH glycosomal à ce stade de vie.
Dans cette étude, nous avons utilisé le biocapteur de protéines fluorescentes pHluorin2 pour surveiller le changement de pH glycosomal chez BSF T. brucei en réponse à des signaux environnementaux, y compris la privation de glucose9 (Figure 1). Les résultats de ce travail suggèrent que le FPS T. brucei acidifie rapidement les glycosomes en réponse à la famine de manière réversible, comme nous l’avons observé chez les parasites PF. Nous espérons que ce biocapteur améliorera notre compréhension de la régulation glycolytique chez T. brucei et les parasites apparentés.

<table><tbody><tr><td>Fioles de culture tissulaire de 50 mL (non traitées, stériles)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Fiole de culture tissulaire (non traitée, stérile)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &micro ; L plaque à fond plat 384 puits</td><td>BrandTech&nbsp ;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Cellule T humaine Amaxa Nucléofector&nbsp ; Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>Logiciel FlowJo</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, plaque à fond plat</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 plugin d’ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux CytoFLEX</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique Sciences 16 % Paraformaldéhyde Solution aqueuse, grade EM, 10 mL Ampoule</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>logiciel statistique</td></tr><tr><td>Nigericin (sel de sodium)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>Produit abandonné OP2</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine, 0,1 % (p/v) dans H2O</td><td>Sigma Life Science</td><td>CAS :25988-63-0</td><td>Robot de pipetage pour le dosage HTS</td></tr><tr><td>Thiazole Red (TO-PRO-3)</td><td>biotium</td><td>#40087</td><td>Nous avons usiné un support de plaque acrylique personnalisé afin que cette marque de plaque puisse être détectée et utilisée sur notre CytKick Max Auto Échantillonneur</td></tr><tr><td>valinomycine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>Robot de pipetage pour le dosage HTS</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour l’étalonnage du pH</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour l’étalonnage du pH</td></tr></tbody></table>

mesure des changements dynamiques du ph glycosomal chez trypanosoma brucei vivant

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Le métabolisme du glucose est essentiel pour le trypanosome africain, Trypanosoma brucei, en tant que processus métabolique essentiel et régulateur du développement du parasite. On sait peu de choses sur les réponses cellulaires générées lorsque les niveaux de glucose environnementaux changent. Dans les parasites de la circulation sanguine et de la forme procyclique (stade d’insecte), les glycosomes abritent la majeure partie de la glycolyse. Ces organites sont rapidement acidifiés en réponse à la privation de glucose, ce qui entraîne probablement la régulation allostérique des enzymes glycolytiques telles que l’hexokinase. Dans les travaux précédents, la localisation de la sonde chimique utilisée pour effectuer les mesures de pH était difficile, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications.
Cet article décrit le développement et l’utilisation de parasites qui expriment pHluorin2 localisée glycosomiquement, un biocapteur de pH protéique héréditaire. pHluorin2 est une variante ratiométrique de la pHluorin qui présente une diminution de l’excitation dépendante du pH (acide) à 395 nm tout en produisant simultanément une augmentation de l’excitation à 475 nm. Les parasites transgéniques ont été générés en clonant le cadre de lecture ouvert de pHluorin2 dans le vecteur d’expression du trypanosome pLEW100v5, permettant l’expression inductible de protéines à l’une ou l’autre étape du cycle de vie. L’immunofluorescence a été utilisée pour confirmer la localisation glycosomale du biocapteur pHluorin2, en comparant la localisation du biocapteur à la protéine résidente glycosomale aldolase. La réactivité de la sonde a été calibrée à différents niveaux de pH en incubant des cellules dans une série de tampons dont le pH variait de 4 à 8, une approche que nous avons déjà utilisée pour étalonner une sonde de pH à base de fluorescéine. Nous avons ensuite mesuré la fluorescence de pHluorin2 à 405 nm et 488 nm en utilisant la cytométrie en flux pour déterminer le pH glycosomal. Nous avons validé les performances des parasites transgéniques vivants exprimant pHluorin2, en surveillant le pH dans le temps en réponse à la privation de glucose, un déclencheur connu de l’acidification glycosomale chez les parasites PF. Cet outil a une gamme d’applications potentielles, y compris potentiellement utilisé dans le criblage de médicaments à haut débit. Au-delà du pH glycosomal, la sonde pourrait être adaptée à d’autres organites ou utilisée dans d’autres trypanosomatidés pour comprendre la dynamique du pH dans le cadre de cellules vivantes.

Localisation de pHLuorin2-PTS1 dans les glycosomes chez BSF T. brucei Pour évaluer la localisation subcellulaire de la pHluorin2-PTS1, les parasites ont été soumis à des tests d’immunofluorescence. Signal du transgène colocalisé avec des antisérums élevés contre une protéine résidente des glycosomes, l’aldolase (TbAldolase) (Figure 2A). Le coefficient de corrélation moyen de Pearson de colocalisation entre l’anti-TbAldolase et la pHluorin2-PTS1 était de 0,895, ce...

Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Le métabolisme du glucose est essentiel pour Trypanosoma brucei, mais on sait peu de choses sur la façon dont les cellules détectent et réagissent aux changements de taux de glucose dans l’environnement. Nous avons développé des parasites exprimant un biocapteur de pH qui nous permet de surveiller le pH glycosomal des parasites vivants, ce qui aidera à comprendre les réponses dynamiques des parasites aux fluctuations des nutriments. Un défi pour cette expérience serait la disponibilité d’un cytomètre en flux équipé d’un lecteur de plaques de microtitration, ainsi que des ensembles de filtres appropriés pour mesurer la fluorescence des biocapteurs.De plus, T. brucei est un organisme du groupe de risque deux, de sorte que le cytomètre doit être hébergé dans une installation de niveau de biosécurité deux. Il a été découvert que le niveau de pH des glycosomes peut affecter la glycolyse car l’hexokinase et la phosphofructokinase sont sensibles au pH. Cependant, les sondes de pH utilisées précédemment ne ciblaient pas avec précision le glycosome sous forme sanguine.Un meilleur outil était nécessaire pour étudier la relation entre le pH glycosomal et la glycolyse à ce stade de vie du para

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains est difficile à étudier par les techniques traditionnelles de biologie cellulaire telles que la microscopie électronique et la microscopie à fluorescence.  Comme moyen d’observer le comportement dynamique des organites, un système rapporteur d’organites fluorescents a été utilisé en conjonction avec la cytométrie en flux pour surveiller la dynamique des glycosomes en temps réel chez les parasites vivants.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

L’ajout d’une étiquette à une protéine est un moyen puissant de mieux comprendre sa fonction. Ici, nous décrivons un protocole permettant de marquer de manière endogène des centaines de protéines de Trypanosoma brucei en parallèle afin que le marquage à l’échelle du génome soit réalisable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Les trypanosomes africains cultivés in vitro subissent une variation antigénique à un faible taux, de sorte que les populations sont constituées de parasites exprimant un variant dominant de type glycoprotéine de surface (VSG) et d’une petite population de variants « commutés ».  Ce protocole décrit une méthode rapide de détection et de quantification de ces populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Cette méthode de séparation des trypanosomes dans le sang dépend de leur charge de surface étant moins négatif que les cellules de sang de mammifères. Sang contaminé est placé et traité sur une colonne d’échangeur d’anions. Cette méthode, plus raccord diagnostique pour la trypanosomiase africaine, fournit parasites purifiées à des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques et de la biologie moléculaire.

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Les télomères sont essentiels pour la stabilité des chromosomes et le G-télomères surplombent la structure est essentielle pour la télomérase médiée par le maintien des télomères. Nous avons récemment adopté deux méthodes pour détecter les télomères G-faux structure...

L&#39;examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei</em

Cet article détaillera le protocole de mesure de l'activité calpaïne dans les cellules fixes et de vie en utilisant la cytométrie de flux.

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

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Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

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