Un flux de travail pour l’évaluation quantitative des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes de l’écorce de Populus trichocarpa

[Présentateur] Un flux de travail pour l’évaluation quantitative des microbiomes bactériens endophytes et épithétiques de l’écorce de Populus trichocarpa. Ici, nous avons conçu et testé un flux de travail détaillé pour étudier le microbiome colonisant les tissus internes ou les surfaces de l’écorce de Populus trichocarpa. Ce flux de travail décrit en détail l’échantillonnage des microbiomes endophytes et épithétiques de l’écorce de Populus trichocarpa, le traitement des matériaux collectés, l’extraction de l’ADN génomique, l’amplification par PCR des régions cibles, la préparation de banques d’ADN et le séquençage des microbiomes bactériens endophytes et épithétiques via la technologie de séquençage de nouvelle génération. Nous fournissons également une brève procédure analytique pour les données de séquençage obtenues. Ce flux de travail éprouvé fournira une approche efficace pour étudier empiriquement les communautés de microbiome endophytes et épithétiques de l’écorce de Populus trichocarpa et d’autres espèces forestières. Cultivez des jeunes arbres de Populus trichocarpa âgés de trois mois dans une chambre de croissance, coupez les segments de tige de 10 centimètres de long de Populus trichocarpa de deux à 12 centimètres au-dessus de la surface du sol stérilisé à l’aide d’un sécateur stérilisé. Placez les segments de tige dans une boîte de Pétri carrée stérilisée. Essuyez à plusieurs reprises l’épiderme de la tige sur la boîte de Pétri carrée stérilisée avec du coton stérile à 0,1 %. Préadolescent 20. Conservez chaque morceau de coton contenant des micro-organismes et des échantillons épithétiques dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre à moins 80 degrés centigrades. Après avoir essuyé la surface de la tige, ouvrez l’écorce avec un scalpel stérile, retirez l’écorce et placez-la dans une boîte de Pétri carrée. Coupez l’écorce retirée de la tige en segments d’environ un centimètre avec un scalpel stérile. Stérilisez les surfaces des segments en les trempant dans de l’alcool à 70 % pendant deux minutes, puis trempez les segments dans de l’hypochlorite de sodium avec 0,1 %, Tween 80 pendant cinq minutes. Enfin, stérilisez les segments dans de l’alcool à 70 % pendant 30 secondes. Ensuite, lavez tous les échantillons trois fois avec de l’eau distillée stérile et placez-les sur une paillasse propre pour un séchage à l’air. Conservez chaque échantillon endophytique d’écorce de tige stérilisé dans un tube à centrifuger stérile de deux millilitres à moins 80 degrés centigrades. Placez les sections d’écorce de tige dans des tubes durs stériles de cinq millilitres et ajoutez trois billes d’acier stérilisées dans chaque tube. Congelez les tubes durs contenant les échantillons dans de l’azote liquide pendant 10 minutes. Écrasez les échantillons d’écorce pendant cinq minutes à l’aide d’un batteur à billes. Ensuite, congelez à nouveau le tube dur dans de l’azote liquide pendant une minute et répétez l’étape de battage des billes pendant cinq minutes. Ajoutez l’écorce de tige broyée de Populus trichocarpa et les communautés bactériennes épithétiques adhérentes au coton, 0,25 gramme chacune, à chacun des tubes de billes, puis ajoutez 60 microlitres de solution C1 fournie par un kit commercial, et doucement mélangée par inversion. Ensuite, homogénéisez les échantillons endophytes et épithétiques à l’aide d’un batteur de billes en quatre cycles d’une minute. Après chaque analyse, placez les échantillons sur de la glace pendant 30 secondes. Centrifuger les tubes à 10 000 fois la gravité pendant une minute, extraire les échantillons endophytes et épithétiques à l’aide d’un kit en suivant les instructions du fabricant, ajouter 30 microlitres de solution C6 au centre de la membrane filtrante blanche et incuber à 25 degrés centigrades pendant cinq minutes. Centrifuger à 10 000 fois la gravité à température ambiante pendant une minute. Mesurez les concentrations de l’ADN génomique extrait d’échantillons épithétiques et endophytes à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Diluez chaque échantillon d’ADN avec du ddH2O stérile à deux nanogrammes par microlitre pour obtenir la matrice d’ADN pour l’amplification par PCR. Amplifiez la région V5 à V7 du gène de l’ARNr bactérien 16S à l’aide de l’amorce directe 799F et de l’amorce inverse 1193R. Pendant ce temps, amplifiez la région V4 du gène de l’ARNr bactérien 16S à l’aide de l’amorce directe 5115F et de l’amorce inverse 806R. Mélangez soigneusement chaque échantillon et centrifugez-le pour éliminer les bulles. Effectuez l’amplification de la région V5 à V7 ou V4 des gènes de l’ARNr bactérien 16S sur un thermocycleur. Chargez cinq litres d’un microlitre de chaque échantillon d’Amplicon sur un gel d’agarose à 1 % et effectuez une électrophorèse à 120 volts pendant 30 minutes. Visualisez le gel sous des lampes UV pour valider la réussite de l’amplification PCR. Pour chaque échantillon, mélangez trois répétitions des produits d’amplification PCR dans un tube PCR. Déterminer la concentration des produits amplifiés à l’aide d’une trousse commerciale selon les instructions du fabricant. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques. Tracez une courbe d’ADN standard et utilisez-la pour calculer les concentrations d’ADN des produits amplifiés. En fonction de leur concentration mesurée, mélanger les produits PCR obtenus des échantillons endophytes ou épiphytes de l’écorce de Populus trichocarpa en concentration égale pour construire la banque Amplicon. Effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide d’un appareil d’électrophorèse. Préparez brièvement un gel d’agarose à 1,3 %, 1,3 gramme de poudre d’agarose dans 100 millilitres d’un tampon TAE. Retirez les rayons après la solidification du gel et placez le gel dans un réservoir d’électrophorèse avec un tampon TAE une fois. Ensuite, ajoutez une unité de volume de six fois le tampon de chargement orange à cinq unités de volume de chaque produit PCR avec 100 microlitres de l’échelle chargés dans chaque puits. Ajoutez 30 microlitres de l’échelle d’ADN dans un puits. Après avoir connecté les fils positif et négatif, effectuez une électrophorèse de 80 volts pendant 50 minutes. Excisez des fragments d’ADN du gel d’agarose à l’aide d’un scalpel propre et tranchant. Pesez la tranche de gel et transférez-la dans un tube incolore. Ajoutez un tampon pour immerger la tranche de gel. Effectuez l’extraction du gel à l’aide du kit d’extraction de gel en suivant les instructions du fabricant. Déterminer la concentration de la bibliothèque d’Amplicon purifiée sur un fluorimètre à l’aide d’un kit commercial en suivant le protocole du fabricant pour le profilage de séquençage. Lire des tubes d’essai standard et d’échantillons à l’aide d’un fluorimètre et confirmer la qualité de la bibliothèque en visualisant une seule bande. Analysez et annotez les séquences du gène de l’ARNr 16S à l’aide du CHAM II. Effectuer des annotations taxonomiques à l’aide de la Silver Database selon des séquences de référence. Visualisez ces résultats à l’aide du package ggplot2 dans R. De l’ADN génomique de haute qualité des microbiomes bactériens endophytes et épithétiques de l’écorce de Populus trichocarpa a été obtenu. L’amplification par PCR des 12 échantillons a permis d’obtenir des bandes uniques fortes de la bonne taille. La bibliothèque Amplicon a été construite avec un seul pic qui répondait aux exigences de pré-séquençage. Pour les microbiomes endophytes, des lectures de haute qualité ont été obtenues en utilisant les paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R respectivement. La paire d’amorces 799F/1193R a donné beaucoup moins de lectures de plantes amplifiées. Le nombre d’ASV provenant du microbiome épithétique de l’écorce de Populus trichocarpa était significativement plus élevé lors de l’utilisation des amorces 799F/1193R par rapport aux amorces 515F/806R. On a estimé que l’indice de Shannon était plus faible dans la communauté bactérienne épiphyte de l’écorce que dans la communauté bactérienne endophyte à l’aide de la paire d’amorces 799F/1193R. Les caractéristiques taxonomiques des communautés bactériennes dans les parties endophytes et épiphytes de l’écorce de Populus trichocarpa ont été explorées plus en détail à l’aide de la paire d’amorces 799F/1193R. Un flux de travail fiable et efficace, de la collecte des échantillons à l’analyse des données, a été mis en place pour quantifier la composition et la diversité des microbiomes bactériens endophytes et épithétiques de l’écorce de Populus trichocarpa. Notre protocole pourrait servir de voie pour l’étude du microbiome de l’écorce des espèces de plantes ligneuses, permettant une meilleure compréhension des caractéristiques des communautés bactériennes habitant d’autres plantes ligneuses.