Name: Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Découvrez une méthode de bioluminescence pour surveiller les oscillations circadiennes dans des organoïdes intestinaux humains tridimensionnels. Cette approche révèle des rythmes robustes dans les entéroïdes différenciés et perturbés dans les conditions enrichies en cellules souches.

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Les entéroïdes intestinaux humains ont été obtenus dans le laboratoire du Dr Michael Helmrath au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC). Ce travail a été soutenu par R01 DK11005 (CIH) et le financement pilote du Centre de cancérologie de l’Université de Cincinnati. Nous sommes reconnaissants du soutien en imagerie de l’Université de Cincinnati Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

Toutes les expériences utilisant des tissus humains pour la génération d’EIH ont été approuvées par un CEE du CCHMC (IRB#2014-0427). Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.
REMARQUE : Pour illustrer la procédure décrite dans ce protocole, nous avons utilisé des entéroïdes intestinaux humains (HIE) Bmal1-luc . Ces entéroïdes ont subi une transduction lentivirale stable22 avec le plasmide rapporteur pABpuro-BluF, qui contient le promoteur Bmal1 fusionné à la luciférase, montrant l’activité du promoteur Bmal1 21.
1. Transduction lentivirale
<ol><li>Effectuer la transduction lentivirale22 dans des conditions enrichies en cellules souches pour les HIE. Plus précisément, assurez-vous de la formation de sphéroïdes dans les EHI dans les 3 à 4 jours suivant leur passage dans le milieu de croissance intestinale, ce qui crée des conditions enrichies en cellules souches.</li>
	<li>Après la transduction lentivirale22, effectuer une sélection d’antibiotiques avec 2 μg/mL de puromycine, récupérer les HIE résistants à la puromycine et les faire passer avec une densité relativement élevée (c’est-à-dire 1 puits dans 2 puits) pour 2-3x. Si le taux de croissance des HIE est lent, ajoutez 10 μM inhibiteurs de ROCK (Y-27632) et 10 μM inhibiteurs de GSK-3 (CHIR-99021) au milieu de croissance des organoïdes intestinaux.</li>
</ol>2. Préparation d’organoïdes pour le dosage de la bioluminescence
<ol><li>Jour 1 : Passage des HIE à des plats ronds de 35 mm.<ol><li>En bref, pour l’expansion des HIE, mélangez les HIE avec une matrice de culture 3D à facteur de croissance réduit (DFG) et ensemencez-les sur des plaques de 24 puits avec trois gouttelettes de 10 μL de matrice de culture 3D par puits. Ajoutez 350 μL de milieu de culture HIE et changez-le tous les deux jours. REMARQUE : La densité de HIE dans la matrice de culture 3D est essentielle pour la croissance des entéroïdes. Approximativement, le nombre de sphéroïdes doit dépasser plus de 50 dans chaque gouttelette. Si le nombre est faible, le taux de croissance de l’EIH est affecté négativement.</li>
		<li>Lorsque les HIE se développent suffisamment (environ 7 jours après le post-passage), collectez les HIE de quatre puits dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
		<li>Lavez les HIE avec le PBS froid à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 × g) pendant 40 secondes pour éliminer les débris et l’excès de matrice de culture 3D à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Ajoutez 0,5 mL de PBS froid dans la pastille et appliquez une turbulence physique en seringue jusqu’à 10x avec une seringue d’insuline de 1 mL pour dissocier les HIE.</li>
		<li>Faites tourner les HIE dissociés à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse comme à l’étape 2.1.3 et retirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation avec la pastille HIE sur de la glace pour qu’il refroidisse pendant environ 3 min.</li>
		<li>Ajoutez la matrice de culture GFR 3D dans le tube de microcentrifugation et mélangez-la avec la pastille HIE. REMARQUE : Calculez la quantité de matrice de culture 3D en fonction du nombre de boîtes rondes de 35 mm qui seront utilisées pour l’expérience. Nous ensemenceons généralement 30 μL de gouttelettes de matrice de culture 3D par plat rond.</li>
		<li>Ensemencez le mélange d’EIH et de la matrice de culture 3D au centre de la boîte ronde de 35 mm et incubez la boîte à 37 °C pendant 20 min pour solidifier la matrice de culture 3D. REMARQUE : La densité des EIH d’ensemencement doit être déterminée expérimentalement. Sur la base de l’intensité de la bioluminescence, on peut déterminer le nombre d’EIH au cours de ce processus.</li>
		<li>Ajoutez 2 ml de milieu de croissance organoïde intestinal préchauffé dans chaque plat et incubez les plats dans un incubateur deCO2 jusqu’à l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3 : Initiation de la différenciation<ol><li>Pour amorcer la différenciation des EHI, retirer le milieu de croissance et ajouter 2 mL de milieu de différenciation préchauffé. REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les recettes du milieu de différenciation HIE23.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 4 : Aucun processus supplémentaire n’est requis.</li>
	<li>Jour 5 : Remplacer le milieu des entéroïdes par 2 mL de milieu de différenciation préchauffé.</li>
	<li>Jour 6 : Synchronisation de l’horloge et enregistrement de la bioluminescence<ol><li>Pour synchroniser l’horloge moléculaire des entéroïdes, ajoutez 2 μL de 100 μM de dexaméthasone (Dex) pour porter la concentration finale à 100 nM dans chaque boîte, puis incubez les boîtes dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2) pendant 1 h24.</li>
		<li>Pendant la réinitialisation du Dex, préparez le luminomètre d’incubation. Vérifiez le CO2 et la température du luminomètre d’incubation et réglez-les à 5 % et 37 °C, respectivement. REMARQUE : Il est suggéré d’essuyer l’intérieur du luminomètre à incubation avec de l’alcool à 70% avant et après chaque utilisation de la machine pour le garder stérile.</li>
		<li>Après la synchronisation de l’horloge, remplissez les entéroïdes avec 3 mL de milieu de différenciation préchauffé contenant 200 μM de D-luciférine. REMARQUE : Comme la luciférine est sensible à la lumière, le milieu contenant de la luciférine doit être enveloppé dans du papier d’aluminium et préchauffé dans un bain de chaleur à 37 °C avant de l’appliquer sur le plat.</li>
		<li>Placez les plats dans une table à plat à 8 puits du luminomètre d’incubation et couvrez la table d’échantillon avec son couvercle. Placez deux chambres d’humidificateur avec un mouchoir humide ou une éponge sur le dessus de la table d’échantillons. Il s’agit d’un processus unique. REMARQUE : Une fois l’expérience commencée, le couvercle du luminomètre à incubation doit être maintenu fermé jusqu’à la fin de l’expérience. Assurez-vous de mouiller suffisamment les mouchoirs/éponges.</li>
		<li>Fermez le couvercle de la machine et lancez le programme de mesure de la bioluminescence pendant le nombre de jours et la résolution souhaités.<ol><li>Sur le logiciel, sélectionnez les paramètres de condition en cliquant sur l’onglet Condition et ajustez les paramètres sur ce panneau : nombre de plats, temps de mesure, traitement en arrière-plan et type de filtre. REMARQUE : Pour cette démonstration, nous avons sélectionné tous les plats de A à H ; temps de mesure par défaut, qui est déterminé par le logiciel en fonction du nombre de plats ; temps d’attente pour le traitement en arrière-plan et le type de filtre F0. Comme il existe trois options de filtre, trois couleurs luminescentes peuvent être mesurées simultanément.</li>
			<li>Après avoir saisi tous les paramètres appropriés en fonction de l’expérience, enregistrez les paramètres en cliquant sur OK.</li>
			<li>Pour commencer à exécuter le test, cliquez sur l’onglet Exécuter | Bouton Démarrer (icône en forme de triangle vert). Observez les données brutes, filtrées par le bruit ou déconnectées en effectuant les sélections appropriées en haut de l’écran du logiciel pendant l’exécution des expériences. Cliquez sur les onglets Brut, Filtré par le bruit ou Tendance pour observer les données sélectionnées.</li>
			<li>Observez les signaux jusqu’à 5 jours. REMARQUE : Après 5 jours de surveillance dans un luminomètre en incubation, les entéroïdes peuvent commencer à mourir en raison de l’épuisement du support. Pour éviter toute perturbation circadienne possible pendant l’expérience, nous n’effectuons pas de changement de milieu pendant la durée de l’expérience.</li>
			<li>À la fin de l’expérience, arrêtez l’exécution en cliquant sur le bouton Arrêter (icône carrée bleue), accédez à l’onglet Fichier , puis cliquez sur Enregistrer sous. Enregistrez les données au format Kronos ; exportez les données vers une feuille de calcul dans la section Fichier en cliquant sur l’option Fichier , puis en sélectionnant Exporter au format Excel sous Fichier pour une analyse plus approfondie.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Optimisation des entéroïdes intestinaux humains pour les études du rythme circadien

<ol><li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li>
<li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%3A+Influence+on+physiology%2C+pharmacology%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacokinet+Pharmacodyn%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li>
<li>Reppert, S., Weaver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li>
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<li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le test de bioluminescence offre plusieurs avantages pour l’étude des rythmes circadiens, ce qui nécessite la collecte de données à partir d’expériences à long terme. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de surveiller l’expression génique ou la protéine d’intérêt au fur et à mesure que les cellules se déplacent et prolifèrent. Sans faire d’ajustements inutiles ni perturber les fonctions des cellules, les événements cellulaires intéressés ou l’expression des gènes peuvent être enregistrés à l’aide de la lecture de la bioluminescence, qui fournit des données fiables en temps réel. Il est important de noter que le test de bioluminescence génère un bruit de fond minimal par rapport aux tests de fluorescence, car il est effectué dans l’obscurité constante25. De plus, le test de bioluminescence est préférable pour la surveillance à long terme, car l’excitation continue pour le test de fluorescence pendant plusieurs jours peut provoquer une phototoxicité et un photoblanchiment élevés. Cependant, en raison de l’absence d’excitation lumineuse, le test de bioluminescence fournit un signal plus faible que les protéines de fluorescence26. La courte demi-vie de la luciférase la rend préférable pour les études circadiennes, et elle peut être encore raccourcie par l’ajout de séquences déstabilisantes supplémentaires12.
Bien qu’ils offrent plusieurs avantages pour la surveillance des cellules vivantes, les tests de bioluminescence présentent certaines limites. Bien que le test de bioluminescence fournisse une lecture robuste pour l’expression temporelle des gènes ou la surveillance des protéines à partir d’une population de cellules, sa résolution spatiale est limitée, ce qui rend moins réalisable les expériences de collecte de données de localisation des protéines à partir de cellules uniques. Compte tenu de ses avantages et de ses inconvénients, le test de bioluminescence est supérieur aux autres méthodes, en particulier pour les études circadiennes ; Il offre moins de toxicité et une sensibilité élevée, ce qui le rend idéal pour la surveillance à long terme.
Plusieurs facteurs critiques doivent être pris en compte lors de la phase de préparation expérimentale. Tout d’abord, la mise en œuvre d’une stratégie de sélection appropriée pour la transduction lentivirale est essentielle ; dans notre cas, nous avons effectué une sélection de 2 μg/mL de puromycine pendant 2 semaines. Une exécution inadéquate de la sélection peut entraîner un nombre insuffisant d’entéroïdes hébergeant le plasmide rapporteur, ce qui entraîne des niveaux d’expression de la luciférase incohérents. Une densité de semis optimale est tout aussi importante ; Une densité excessive peut induire un épuisement prématuré des nutriments pendant l’expérience, car il n’y a pas de remplacement du milieu après le début de l’enregistrement par bioluminescence. À l’inverse, une faible densité d’EIH peut entraîner une réduction de la production de bioluminescence, influençant ainsi la robustesse de la lecture. Assurer un environnement approprié pour les entéroïdes pendant la surveillance est fondamental pour la fiabilité des résultats expérimentaux. Le maintien de conditions optimales, y compris les niveaux deCO2, de température et d’humidité, est essentiel pour le maintien des HIE, favorisant la robustesse des processus cellulaires dans les entéroïdes. Les écarts par rapport à la température optimale et aux niveaux de CO2 peuvent affecter le métabolisme cellulaire et les voies de signalisation, influençant potentiellement les rythmes circadiens. Des niveaux d’humidité adéquats sont tout aussi importants, car ils permettent d’éviter la dessiccation et de maintenir l’intégrité structurelle des entéroïdes. Ainsi, une attention méticuleuse aux conditions environnementales est essentielle pour la précision du modèle expérimental et des études circadiennes impliquant des entéroïdes.
La synchronisation de l’horloge est essentielle pour les études circadiennes car elle aligne l’horloge circadienne interne des cellules individuelles, garantissant qu’elles sont dans un état unifié et coordonné. Cette synchronisation est nécessaire à l’observation et à l’analyse précises de la rythmicité circadienne à l’échelle d’une culture entière. Dans ce protocole, nous avons effectué une synchronisation d’horloge avec 100 nM de dexaméthasone (Dex). Il pourrait y avoir des inquiétudes quant à l’effet de Dex sur la structure ou la fonction cellulaire. Des recherches antérieures suggèrent que les corticostéroïdes améliorent la fonction de la barrière épithéliale dans les entéroïdes27. Cependant, il est important de souligner que ce phénotype est observé après le traitement des entéroïdes avec 10 μM de prednisolone pendant 12 h. Nous nous attendons à ce qu’un traitement court de 1 h à la dexaméthasone n’induise pas de changements significatifs en ce qui concerne la structure et la fonction des cellules à l’intérieur des entéroïdes.
Le suivi de l’activité de bioluminescence de la culture organoïde au lieu de la culture unicellulaire homologue possède des atouts uniques. Tout d’abord, plusieurs types de cellules interagissent les uns avec les autres dans une culture organoïde comme dans un tissu in vivo , alors qu’une culture cellulaire 2D typique surveille l’expression des gènes intéressés dans une sorte d’environnement isolé composé d’un seul type de cellule. La culture d’organoïdes fournit des résultats plus réalistes avec des interactions multicellulaires et des voies de signalisation. L’interaction intercellulaire est essentielle, en particulier pour les études de différenciation et de voies intercellulaires, qui nécessitent une culture cellulaire hétérogène28. Nos résultats indiquent que les HIE dans la condition différenciée présentent des oscillations circadiennes robustes mais des rythmes circadiens perturbés dans la condition enrichie en cellules souches. Ces données suggèrent un remodelage potentiel de la machinerie de l’horloge circadienne des cellules souches adultes aux cellules différenciées. En résumé, les organoïdes avec un rapporteur bioluminescent circadien permettent d’étudier les rythmes circadiens dans un système multicellulaire in vitro , découvrant les fonctions des rythmes circadiens d’une manière plus pertinente sur le plan physiologique.

Horloge circadienne Tous les organismes, des bactéries aux mammifères, ont une relation complexe et dynamique avec leur environnement. Dans cette relation, l’adaptation aux changements environnementaux est essentielle à la survie des organismes. La plupart des organismes possèdent des rythmes circadiens qui leur permettent d’adapter et d’optimiser leurs fonctions aux cycles diurnes d’environ 24 h. L’horloge circadienne est un réseau hiérarchique d’horloges centrales et périphériques qui travaillent en coopération pour maintenir l’homéostasie physiologique et maintenir les organismes synchronisés avec les changements quotidiens 1,2. Chez les mammifères, l’horloge centrale ou maîtresse située dans le noyau suprachiasmatique (SCN) reçoit des signaux externes, tels que la lumière, et transmet l’information aux horloges périphériques via une interaction avancée de voies de signalisation neuronales et humorales3. En plus de l’horloge centrale, les tissus périphériques possèdent leur propre mécanisme d’horloge circadienne autonome cellulaire, maintenu par une boucle de rétroaction négative transcriptionnelle-traductionnelle (TTFL) régulant les gènes contrôlés par l’horloge (CCG) spécifiques aux tissus4,5. Cette machinerie moléculaire produit une rythmicité d’environ 24 heures dans les événements cellulaires et physiologiques, tels que les expressions géniques, les voies de signalisation, les réponses immunitaires et la digestion. L’horloge circadienne est présente dans presque toutes les cellules de mammifères, et il a été démontré que jusqu’à 50% des modèles d’expression des gènes présentent une rythmicité circadienne6. Compte tenu de l’abondance des CCG, la perturbation de ce mécanisme d’horloge peut entraîner des problèmes physiologiques critiques. Par conséquent, des recherches sur les rythmes circadiens sont nécessaires pour élucider les mécanismes biologiques essentiels et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Système de rapporteur luciférase Dans les études circadiennes, la surveillance en temps réel est essentielle pour une meilleure compréhension des comportements et des réponses cellulaires, car elle permet de suivre les changements temporels dans l’expression des gènes et/ou les niveaux de protéines, fournissant ainsi des informations sur les mécanismes moléculaires régulés par l’horloge circadienne. De plus, la surveillance en temps réel permet aux chercheurs d’étudier les effets des changements environnementaux sur les mécanismes moléculaires 7,8. Il existe de nombreuses techniques pour les études de surveillance en temps réel, y compris le test de bioluminescence, qui est largement utilisé pour suivre l’expression des gènes ou les niveaux de protéines au fil du temps. Le test de bioluminescence est une méthode de détection des processus biologiques en utilisant la production de lumière comme lecture. Dans cet essai, une enzyme oxydative qui produit une bioluminescence (par exemple, la luciférase) est transfectée de manière transitoire ou stable dans les cellules d’intérêt, et la lecture de la bioluminescence est mesurée en présence d’un substrat (par exemple, la luciférine) au fil du temps. Par exemple, l’enzyme luciférase produit une bioluminescence en oxydant le substrat luciférine en présence d’ATP9. En raison de sa courte demi-vie, 3-4 h10, la luciférase de luciole est un outil puissant pour les études circadiennes en termes de surveillance dynamique en temps réel avec un bruit de fond minimal 11,12,13. Pour l’insertion d’ADN avec un promoteur marqué à la luciférase ou un cadre de lecture ouvert (ORF), le système d’administration de gènes lentiviraux est une méthode fiable qui offre une efficacité de transduction élevée, une intégration stable et une faible immunogénicité. La transduction stable d’un rapporteur bioluminescent fournit une expression robuste dans les cellules en division et non divisées, générant des données cohérentes pour les études circadiennes14.
Organoïde comme modèle Les lignées cellulaires bidimensionnelles immortalisées traditionnelles ont joué un rôle déterminant dans les études biologiques, allant de la découverte des mécanismes moléculaires fondamentaux des rythmes circadiens au criblage de médicaments. Malgré la commodité de l’utilisation de lignées cellulaires homogénéisées, elles manquent de structures multicellulaires et d’interactions intercellulaires. En revanche, les organoïdes sont des structures multicellulaires in vitro 3D « semblables à des organes » qui imitent la structure d’un organe dans une boîte en présentant une similitude avec l’architecture tissulaire in vivo et la multicellularité, y compris les types de cellules dérivées, progénitrices et différenciées15,16. Possédant des caractéristiques d’auto-organisation, de multicellularité et de fonctionnalité fait des organoïdes un modèle in vitro remarquable représentant les processus cellulaires et physiologiques se produisant dans les tissus réels17. Différents types d’organoïdes peuvent être dérivés de cellules souches pluripotentes par différenciation dirigée ou de cellules souches adultes prélevées dans divers organes, notamment l’intestin grêle, le cerveau, le foie, les poumons et les reins18,19. Étant donné que les structures organoïdes possèdent une architecture et une fonction réelles de type tissulaire avec une multicellularité et une interaction dynamique de cellule à cellule, elles sont supérieures aux lignées cellulaires homogénéisées pour comprendre les événements cellulaires qui se produisent dans les tissus in vivo. Les organoïdes sont également facilement manipulables et peuvent être cultivés dans des conditions contrôlées, ce qui les rend utiles pour les études circadiennes20.
L’objectif principal de ce travail est d’introduire une méthode de surveillance en temps réel utilisant un test de bioluminescence spécifiquement conçu pour l’étude des rythmes circadiens dans les organoïdes 3D multicellulaires. La surveillance en temps réel des événements cellulaires à l’aide d’une technique de test de bioluminescence a été largement réalisée pour des cultures cellulaires dépourvues de la complexité multicellulaire et des communications intercellulaires qui existent dans les tissus réels. Les organoïdes 3D offrent des opportunités uniques pour étudier les fonctions des rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro. Par exemple, on pourrait étudier les rythmes circadiens dans les organoïdes dont la composition cellulaire est modifiée ou les organoïdes dérivés des tissus malades des patients. Ce protocole permet l’utilisation d’un test de bioluminescence pour étudier différents aspects des rythmes circadiens dans un modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique, les organoïdes, ce qui nous aidera à mieux comprendre les rôles des rythmes circadiens dans les organes périphériques.

<table><tbody><tr><td>35 x 10 Boîtes de culture tissulaire Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringues à insuline IV microfines</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1Bb</td><td>Mfrn : BD 329424</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>Inhibiteur de GSK-3</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciférine (sel de potassium)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I Human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9020</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance réduit (DFG) Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoïde de croissance (humain)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>06010</td><td>se compose d’un milieu basal humain IntestiCult OGM, 50 ml et d’un supplément d’organoïdes, 50 ml. Mélanger les deux dans un rapport de 1:1 pour l’utiliser comme milieu de croissance organoïde intestinal</td></tr><tr><td>Kronos Dio Luminometer Machine</td><td>ATTO Corporation</td><td>AB-2550</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>pABpuro-BluF reporter plasmide</td><td>Addgene</td><td>46824</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans calcium et magnésium</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254/10</td><td>Inhibiteur de ROCK</td></tr></tbody></table>

surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

La plupart des organismes vivants possèdent des rythmes circadiens, qui sont des processus biologiques qui se produisent sur une période d’environ 24 heures et régulent un répertoire varié de processus cellulaires et physiologiques allant des cycles veille-sommeil au métabolisme. Ce mécanisme d’horloge entraîne l’organisme en fonction des changements environnementaux et coordonne la régulation temporelle des événements moléculaires et physiologiques. Auparavant, il a été démontré que les rythmes circadiens autonomes sont maintenus même au niveau de la cellule unique en utilisant des lignées cellulaires telles que les fibroblastes NIH3T3, qui ont joué un rôle déterminant dans la découverte des mécanismes des rythmes circadiens. Cependant, ces lignées cellulaires sont des cultures homogènes dépourvues de multicellularité et de communications intercellulaires robustes. Au cours de la dernière décennie, des travaux approfondis ont été réalisés sur le développement, la caractérisation et l’application d’organoïdes 3D, qui sont des systèmes multicellulaires in vitro qui ressemblent à des structures et des fonctions morphologiques in vivo . Cet article décrit un protocole de détection des rythmes circadiens à l’aide d’un rapporteur bioluminescent dans les entéroïdes intestinaux humains, ce qui permet d’étudier les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro.

L’enregistrement par bioluminescence a été effectué pour évaluer la rythmicité circadienne des entéroïdes intestinaux humains (HIE) dans deux conditions distinctes : des conditions enrichies en cellules souches à l’aide d’un milieu de croissance organoïde intestinal (Figure 3) et des conditions induisant la différenciation, ce qui a été réalisé en remplaçant le milieu de croissance organoïde intestinal par un milieu de différenciation. Le jour de l’expérience, nous avons synchronisé les horloges circadiennes en effectuant un traitement de 1 h avec de la dexaméthasone à 100 nM. Par la suite, nous avons remplacé le milieu par 3 mL de milieu de croissance organoïde intestinal ou un milieu de différenciation complété par 200 μM de D-Luciférine et avons initié le suivi de l’activité de bioluminescence. Après une période d’enregistrement de 4 à 5 jours, nous avons effectué une analyse par transformée de Fourier rapide (FFT) pour déterminer la période des rythmes circadiens observés. La figure 3 montre la dynamique temporelle de l’activité du promoteur Bmal1 dans les conditions susmentionnées. Dans des conditions différenciantes, la bioluminescence de Bmal1-luc a montré des oscillations circadiennes robustes avec une périodicité moyenne de 22,92 h. En revanche, les HIE ont montré des rythmes circadiens perturbés dans des conditions enrichies en cellules souches (Figure 3). Ces données montrent que les HIE dans des conditions enrichies en cellules souches ne présentent pas d’oscillations circadiennes robustes. En d’autres termes, il faudrait évaluer l’impact des conditions de croissance par rapport aux rythmes circadiens avant d’étudier les fonctions dépendantes de l’horloge circadienne dans les organoïdes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du protocole. Les HIE sont passés dans des boîtes de 35 mm le jour 1 et cultivés avec 2 mL de milieu de croissance jusqu’au jour 3. Le troisième jour après le passage, le milieu est remplacé par 2 mL de milieu de différenciation préchauffé pour amorcer la différenciation des entéroïdes. Le changement de milieu est répété avec 2 ml de milieu préchauffé le jour 5 pour prévenir l’épuisement nutritionnel. Le 6e jour, les entéroïdes sont traités avec de la dexaméthasone 100 nM pendant 1 h pour la synchronisation de l’horloge circadienne. Au bout d’une heure, le milieu est remplacé par 3 ml de milieu contenant de la D-luciférine à 200 μM, et les paraboles sont installées dans le luminomètre d’incubation. Après avoir enregistré l’expression de la bioluminescence pendant 4 à 5 jours, l’expérience est terminée et les données générées sont exportées sous forme de feuilles de calcul pour une analyse plus approfondie. Abréviation : HIE = entéroïde intestinal humain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig02.jpg"> Figure 2 : Une image représentative des EIH en milieu de croissance. L’image a été prise par un microscope à grand champ avec un objectif 25x. Barre d’échelle = 1 mm. Abréviation : HIE = entéroïde intestinal humain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig03.jpg"> Figure 3 : Enregistrements de bioluminescence des HIE dans des conditions d’enrichissement en cellules souches et de différenciation. (A) Données d’enregistrement de bioluminescence brutes et (B) sans tendance des HIE Bmal1-luc dans des conditions d’enrichissement en cellules souches (rouge) et de différenciation (noir). (C) Période d’oscillations Bmal1-luc dans les HIE dans des conditions de différenciation. La période est calculée à l’aide de l’analyse FFT ; n = 3 pour les HIE Bmal1-luc sous condition enrichie en cellules souches et n = 4 pour les HIE Bmal1-luc sous condition de différenciation. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Abréviations : HIE = entéroïde intestinal humain ; FFT = Transformée de Fourier rapide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Recettes de milieux de différenciation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nom du réactif</td>
			<td>Compagnie</td>
			<td>Numéro de catalogue</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Commentaires</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avancé</td>
			<td>Technologies de la vie</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
			<td>Ajouter comme dernier composant. Si vous préparez un support de 50 ml, après avoir ajouté tous les autres composants, remplissez le reste jusqu’à 50 ml avec Advanced DMEM/F12 à la fin.</td>
		</tr><tr><td>A 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Supplément B-27 (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gastrin I Humain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9020</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 millions de kilomètres</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Supplément N-2 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-acétyl-L-cystéine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1 million d’euros</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>NOGGIN Conditionné Moyen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
			<td>Fabriqué en laboratoire</td>
		</tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF murin recombinant</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>R-SPONDIN Milieu conditionné</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10%</td>
			<td>Fabriqué en laboratoire</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition des milieux de différenciation HIE23.

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Notre champ de recherche actuel est d’étudier les rôles des rythmes circadiens dans la prolifération et la différenciation des cellules épithéliales intestinales. Nous essayons de déterminer si l’horloge circadienne régule la prolifération cellulaire et la différenciation des cellules souches intestinales. Ce protocole présente une méthode de surveillance en temps réel pour les études circadiennes dans des organoïdes tridimensionnels à l’aide d’un test de bioluminescence.Contrairement à la réalisation de tests de bioluminescence dans une culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle, cette approche nous permet d’étudier les rythmes circadiens et leurs fonctions dans un modèle organoïde plus pertinent sur le plan physiologique. Nos résultats montrent des rythmes circadiens perturbés dans des conditions enrichies en cellules souches tout en démontrant des oscillations circadiennes robustes dans les organoïdes intestinaux humains différenciés, suggérant un remodelage de la machinerie de l’horloge circadienne des cellules souches aux cellules différenciées. L’utilisation d’organoïdes dérivés de patients avec des rapporteurs bioluminescents circadiens nous aidera à faire progresser notre compréhension des rythmes circadiens dans les organes périphériques et différents états pathologiques.

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