La fabrication des canaux microfluidiques thermoplastique

Bonjour, je m'appelle Aida Pria et je viens de terminer mon doctorat au laboratoire de la Dre Katherine KLAS ici à l'université de Boston. Aujourd'hui, je vais démontrer la fabrication d'un dispositif microfluidique en thermoplastique par emboutissage à chaud microscopique et soudage thermique. Ensuite, je vais montrer l'isolement des acides nucléiques à l'aide d'une phase solide contenant des particules de silice, les acides nucléiques extraits pouvant ensuite être utilisés pour la détection par amplification en PCR ou tout autre module diagnostique.

Bonjour, je m'appelle Dominika Kalinski et je suis étudiante diplômante au sein du laboratoire des microdispositifs et microenvironnements biomédicaux de l'Université de Boston. Je vais parler de la formation d'un monolithe de lyse en nanotubes de carbone dans un dispositif microfluidique, ainsi que de la formation d'un monolithe d'extraction en phase solide pour l'extraction de l'ADN dans un dispositif microfluidique. Aujourd'hui, nous allons démontrer une expérience sur la production et l'application de colonnes de lyse et de colonnes d'extraction en phase solide à l'échelle microscopique intégrées dans des canaux microfluidiques en thermoplastique.

Ces colonnes peuvent être utilisées pour la lyse des cellules bactériennes et l'isolement des acides nucléiques à partir du lysat cellulaire. La première étape du processus consiste en la fabrication des dispositifs microfluidiques. En polyoléfine cyclique, nous utilisons un polymère, commercialisé sous le nom xx XX six 90 R, qui possède une température de transition vitreuse de 136 degrés Celsius et est transparent au rayonnement UV.

La transparence aux UV est très essentielle pour la chimie dirigée par la lumière utilisée dans la fabrication du monolithe poreux à l'intérieur des canaux microfluidiques. Cette plateforme microfluidique est fabriquée par emboutissage microthermique et liaison thermique. Tout d'abord, je vais démontrer le procédé d'emboutissage microthermique.

Nous commençons donc avec un moule maître, qui est un moule électroformé en nickel-cobalt, et qui présente les caractéristiques négatives ou inversées de celles nécessaires sur la plateforme microfluidique. Nous plaçons donc les palettes Zion Nex par-dessus les caractéristiques que nous souhaitons obtenir sur le substrat plastique. Le moule est ensuite placé dans une presse chaude, chauffée à 30 degrés au-dessus de la température de transition vitreuse du polymère.

Ceci est ensuite recouvert d'une autre plaque métallique, puis comprimé à une pression comprise entre 50 et 500 psi, ce qui convient bien. Après cinq minutes, nous pouvons relâcher la pression et retirer les PLA. Nous laissons refroidir légèrement, puis les deux plaques sont séparées manuellement et le moule est libéré du substrat.

Voici à quoi ressemble le substrat. Après avoir été retiré du moule, nous perceons des trous de 1,5 millimètre aux extrémités du canal afin de les utiliser comme puits d'introduction et de collecte. Ce substrat en relief est ensuite thermo-scellé à une autre pièce de plastique lisse pour former et fermer les éléments microfluidiques.

Les deux morceaux sont collés sur la plaque chauffante de cette manière. La température est réduite à la température de transition vitreuse du polymère, soit 136 Celsius. Pour le procédé de soudage thermique, les plaques métalliques sont à nouveau placées dans la presse chauffante, portée à la température de transition vitreuse, soit 136 degrés Celsius, puis pressées ensemble à 250 PSI pendant deux minutes.

À la température de transition vitreuse, le polymère commence à fondre et à s’unir, ce qui permet d’obtenir des structures microfluidiques fermées. Après deux minutes, la pression est relâchée. Voici à quoi ressemble le dispositif microfluidique final, avec ses canaux fermés et ses orifices d’accès pour l’introduction et la collecte de l’échantillon. Nous allons maintenant préparer les microcanaux en vue de la formation d’un monolithe polymère poreux.

La première étape de ce processus est une greffe. Nous modifions la chimie de surface des microcanaux et de la plateforme Xan X six 90 R. Ceci est nécessaire afin de permettre une fixation covalente du monolithe polymère poreux à l'intérieur du microcanal.

Cette modification de surface est un procédé de greffage, qui implique un rapport un pour un d'EDA par rapport au MMA avec un photoinitiateur, le benzo phéno. Ce que je fais ici consiste donc à préparer une concentration équimolaire de MMA et d'EDA dans la solution. J'ajoute 3 % de benzo phéno afin de pouvoir réticuler ce monolithe à l'intérieur du canal.

Une fois la solution de greffage préparée, nous l'introduisons dans le microcanal, où elle s'écoule par action capillaire et remplit le canal. Lorsque le canal est rempli, nous le plaçons dans un appareil de réticulation UV, où il sera réticulé pendant 10 minutes avec une énergie de 200 millijoules par centimètre carré. Après les 10 minutes d'exposition aux UV, la solution de greffage et le microcanal sont rincés avec du méthanol, en utilisant une aspiration sous vide.

Ce que je vais faire ici est de placer du méthanol à une extrémité du canal en utilisant un vide pour rincer le canal avec du méthanol. Cela permet d'éliminer toute solution excédentaire qui n'a pas été polymérisée. Il s'agit d'une comparaison entre le cyclo, l'éthanol et la cycline, tous contenant des nanotubes de carbone à une concentration de 2,27 molaire.

Le cyclin tout entier avec les nanotubes de carbone sera agité pour assurer une dispersion homogène des nanotubes de carbone dans la solution. Après le processus de greffage, la chimie de surface a été modifiée et est désormais prête pour une fixation solide du monolithe à l'intérieur du microcanal. Je vais maintenant décrire la formation du monolithe en nanotubes de carbone VICIS.

Ceci est composé de gènes, de solvants et de monomères. Les quatre éléments impliqués dans ce processus sont l'al à l'ecol, le méthacrylate de butyle et l'EDMA. De plus, nous ajoutons un initiateur photochimique afin de pouvoir former le monolithe in situ par polymérisation sous rayonnement UV.

Je vais préparer un échantillon de cent microlitres. J'effectuerai une pipette de 52,5 microlitres d'ecol. Cette opération doit être effectuée lentement, car l'ecol est visqueux.

Après l'ecol, nous ajouterons les nanotubes de carbone avec le cyclo anol. Il faut vortexer vigoureusement pendant quelques minutes afin d'assurer une dispersion adéquate. Là encore, nous devons pipeter lentement le cyclo andal et les nanotubes de carbone, car il s'agit d'une solution Abicus.

Ensuite, nous ajoutons 15 microlitres de butyl méthacrylate. Et enfin, nous ajoutons 10 microlitres de EDMA. Nous vortexons brièvement ce mélange, ajoutons notre initiateur photochimique, puis nous le soniquons.

L'initiateur photochimique que nous ajoutons au monolithe de lyse est le DM PAP. Celui-ci est ajouté à une concentration de 1,13 dans tout le volume de cette solution de cent microlitres. Après son ajout, étant donné qu'il s'agit d'un initiateur photochimique, nous devons couvrir notre solution de monolithe de lyse afin d'éviter toute exposition pendant que nous sonictons celle-ci.

Cela sera traité par ultrasons pendant 30 minutes à une amplitude de 50 % avec un cycle de travail de 50 %. Ce cycle de travail de 50 % vise à éviter la surchauffe de la solution. Il est extrêmement important de prendre la solution après la sonication et de travailler rapidement.

Cela est nécessaire afin de garantir une dispersion uniforme des nanotubes de carbone dans la solution, car nous allons pipeter la solution dans le microcanal. Ici, nous avons la solution de lyse. Juste après la sonication et en travaillant très rapidement, nous pipetons le volume dans le microcanal en utilisant l'action capillaire : la solution s'écoule alors dans le canal.

Nous plaçons ceci dans le réticulateur pendant 0,9 minute à un niveau d'énergie de 120 Millijoules par centimètre carré. Après ces 0,9 minute, nous retournons le dispositif. Ce retournement a essentiellement pour but de permettre une polymérisation plus uniforme et une répartition plus homogène des nanotubes de carbone dans le canal.

Une fois que le monolithe a été polymérisé et rincé avec du méthanol, la solution monomérique, le monolithe à l'intérieur ne sera plus transparent, mais plutôt d'un blanc vif, avec de minuscules taches noires correspondant aux nanotubes de carbone présents dans le monolithe. Le monolithe d'extraction en phase solide est fabriqué de manière similaire au monolithe de lyse contenant des nanotubes de carbone. Voici les bactéries et la culture liquide, et ici nous avons un échantillon de notre milieu.

Une fois que nous avons dilué l'échantillon, nous le pipetons dans un tube à essai et le centrifugeons. Nous décantons ensuite le milieu en veillant à ne pas perturber le culot bactérien sur la paroi du tube einor. Les bactéries sont alors resuspendues dans une solution contenant du gudo, du dium, du thio, du SDS et de la protéase K. Le thiocyanate de gu diem pipeté a le même volume que celui dans lequel les bactéries étaient suspendues.

Ici, la bactérie a été mise en suspension dans un millilitre, donc je vais remettre la bactérie en suspension dans un millilitre de thiocyanate de gu gu pour le thiocyanate de gu. J'ajoute de la protéinase K. J'ajoute 45 microlitres et des ARN. La dernière solution que j'ajoute est le SDS.

Après cela, la solution est vortexée. Après la vortexage, nous pipetterons l'échantillon bactérien dans une seringue jetable. Ici, nous utilisons une seringue jetable Excel de trois millimètres.

Cet embout possède un raccord fileté qui se connecte au tube capillaire, et nous nous brancherons à notre appareil via des ports nano. Je vais donc pipeter la solution dans la seringue jetable. Nous devons aspirer afin de vérifier qu'il n'y a pas d'air dans le système.

Vous souhaitez faire cela jusqu'à ce qu'une ou deux gouttes sortent de l'autre extrémité. Maintenant que notre solution est prête à être raccordée à notre dispositif, nous placerons notre seringue jetable sur la pompe à seringue KDS et nous relierons l'extrémité de notre raccord à notre dispositif sous licence, qui dispose de nano-ports que nous avons fixés à chaque extrémité. Cela permet une connexion ferme au dispositif.

Il s'agit de raccords filetés, et nous avons généralement tendance à fixer l'appareil avec du ruban adhésif afin de s'assurer qu'il ne se renverse pas. Ici, nous réglerons le débit à quatre ou cinq microlitres par heure. Il s'agit d'une pompe à déplacement qui va forcer la solution à traverser la seringue, le tube, cette connexion, puis le canal.

Nous recueillerons l'échantillon via ce nano-orifice de sortie. Nous pouvons collecter le polluant à l'aide d'une pipette, et ce polluant sera ensuite soumis à l'étape suivante, le processus d'extraction en phase solide, afin d'isoler l'ADN bactérien pour l'isolement des acides nucléiques. La phase solide contenant les particules de silice est conditionnée avec du guanidinium thiocyanate contenant un tampon de lyse.

Cela se fait en remplissant une seringue avec le tampon de lyse et en la fixant à la pompe à seringue, puis en faisant circuler le tampon dans le canal à un débit de 300 microlitres par heure. Suit ensuite le chargement de l'échantillon. L'échantillon correspond ici au lysat cellulaire bactérien obtenu lors de l'étape précédente de lyse.

Encore une fois, la charge, cet échantillon est chargé pendant trois minutes à un débit de 300 microlitres par heure. Après cela, le canal est lavé avec de l'éthanol à 70 %, à nouveau à un débit de 300 microlitres par heure. Cette étape de lavage élimine toutes les protéines absorbées et les contaminants, et les déchets sont collectés à partir du dispositif de collecte.

Bien utiliser une pipette après l'étape de lavage, qui élimine toutes les impuretés. L'ADN qui était lié à la silice est ensuite élué dans de l'eau. Voici donc une seringue contenant de l'eau distillée.

Il est fixé à la puce et, encore une fois, l'eau circule à un débit de 300 microlitres par heure, et nous recueillons l'échantillon à l'autre extrémité. Cette étape dure trois minutes, et nous recueillons 15 microlitres d'eluant, qui correspond simplement à de l'ADN pur dans l'eau, et est prêt pour la PCR en vue de la fabrication du dispositif thermoplastique. Le défi le plus important concerne l'aspect du collage thermique, car le collage est effectué à une température très élevée, à ou près de la température de transition vitreuse du polymère, avec l'application d'une certaine pression, et une légère variation de la pression ou de la température peut totalement obstruer le canal ou créer un joint imparfait entre les deux pièces en plastique.

Ainsi, maintenir la température et la pression optimales est très important et peut s'avérer un peu délicat. Les éléments clés qui posent difficulté dans ce processus consistent à obtenir une répartition uniforme des nanotubes de carbone dans la solution de monomère qui est polymérisée par UV in situ. Cela représente un défi similaire à celui d'une dispersion homogène des particules de silice dans le monolithe polymère poreux utilisé pour l'extraction en phase solide.