Name: Méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Découvrez un test fluorescent acellulaire pour confirmer la chélation du fer par de nouveaux composés. Cette méthode simple et économique utilise la calceine pour le dépistage en recherche contre le cancer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Dosage fluorescent pour la détection de nouveaux chélateurs du fer

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Sulfate de fer (II) d’ammonium</td><td>hexahydraté Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>autrement connu sous le nom</td>de</tr><tr><td>FAS Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Défériprone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>sans magnésium ni calcium</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 plaques de puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>n’importe quelle plaque de 96 puits optiquement transparente fonctionnera</td></tr></tbody></table>

méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Pour la méthode présentée à l’étape 2, cette première expérience (Figure 1) a permis d’établir la gamme linéaire du lecteur de plaque de fluorescence de microtitration lors de la détection des émissions fluorescentes de Calcein. Nos résultats représentatifs montrent une large gamme linéaire de fluorescence de Calcein de 0 à 100 μM. L’ANOVA avec l’analyse post-hoc LSD démontre qu’il existe des différences statistiquement significatives dans la RFU moyenne pour toutes les concentrations de Calcein par rapport à un contrôle de 0 μM de Calcein. Dans d’autres expériences, la calcéine 1 μM a été utilisée (étapes 3 et 4) car elle produit des différences statistiquement significatives par rapport au contrôle 0 μM et se situe dans la plage qui est couramment appliquée aux cellules sous forme de calcéine AM en cytométrie en flux13.
Pour la méthode présentée à l’étape 3, nous démontrons que lorsque du fer sous forme de Fe2+ est ajouté dans une plage de 0-1000 μM (sous forme de FAS) à 1 μM de calcéine, les ions Fe2+ entraînent une diminution linéaire de la fluorescence de la calcéine (RFU). Cela permet d’observer l’extinction de la fluorescence de la calcéine basée sur Fe2+ . La calcéine, en tant que chélateur de fer faible, lie le fer, ce qui réduit la sortie fluorescente. Dans la figure 2, les concentrations de 8,9 μM FAS et plus ont montré une diminution significative, p&lt;0,001, de la fluorescence de la calcéine par rapport à 1 μM de calcéine seule. L’utilisation de 8,9 μM de FAS correspondait à une réduction de 33 % de la fluorescence de la calcéine (RFU moyenne). Pour une expérience plus poussée (étape 4), on a utilisé du FAS de 10 μM car il se situait dans la plage d’extinction par fluorescence de Calcein.
Pour la méthode présentée à l’étape 4, la connexité de la calcéine pour les ions Fe2+ par un chélateur de fer peut être observée sur la figure 3. Le fer sous forme de Fe2+ diminue la fluorescence de la calcéine à partir du contrôle 1 μM et le chélateur du fer défériprone augmente cette fluorescence jusqu’à un pic, libérant l’extinction du fer de la calcéine et augmentant la fluorescence (RFU moyenne). La défériprone (utilisée à titre d’exemple) à des concentrations allant de 0,97 à 512 μM a entraîné des augmentations statistiquement significatives de la fluorescence, comme observé avec l’analyse post-hoc de l’ANOVA et de la LSD (p&lt;0,001). Le changement de pli le plus important a été un changement de 3 fois de la RFU moyenne à 62,5 μM de chélateur par rapport au contrôle de 1 μM de calcéine AM et de 10 μM FAS. Au-dessus de 512 μM de défériprone, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre le chélateur et le témoin de 1 μM de Calcein et 10 μM de FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> Figure 1 : Concentrations de calcéine et fluorescence (RFU) déterminées à l’aide d’un lecteur de plaque de microtitration fluorescente. Les concentrations de calcéine de 0 à 100 μM incubées pendant 30 min et déterminées en fluorescence (RFU) sont indiquées ici. Les données montrent la moyenne de 8 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est notée par ** où p&lt;0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). L’UFR moyenne de calcein de chaque concentration est comparée au contrôle du PBS et du calcéine 0 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> Figure 2 : L’augmentation de la concentration de SAF entraîne une diminution linéaire de la fluorescence de la calcéine. La concentration de FAS a été augmentée de 0 à 1000 μM, ce qui a entraîné une diminution linéaire de la fluorescence de 1 μM de calcéine après 30 minutes d’incubation dans le PBS Les données présentées sont la moyenne de 5 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est notée par ** où p&lt;0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). L’UFR moyenne de Calcein de chaque concentration de SAF et de 1 μM de Calcein est comparée au témoin de 1 μM de Calcein 0 μM de SAF dans le PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> Figure 3 : Augmentation des concentrations de défériprone. La concentration de défériprone a été augmentée de 0 à 1000 μM avec l’incubation de 1 μM de calcéine, 10 μM de FAS dans le PBS. La fluorescence a été mesurée sur un lecteur de microplaques multimodal. Les données présentées sont la moyenne de 5 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est indiquée par ** où p&lt;0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). La RFU moyenne est comparée à 1 μM de calcéine dans le PBS avec 10 μM de FAS et 0 μM de défériprone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentration (μm)</td>
			<td>Volume à partir de (stock de 1 mM)</td>
			<td>Volume de PBS</td>
			<td>Volume total</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>950 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>975 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>990 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Préparation du stock secondaire de Calcein.

Méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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