Name: Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Découvrez la dissection précise du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) pour la biologie métabolique. Cette méthode combine microscopie, analyse d'expression génique et histologie pour améliorer l'efficacité d'extraction et la qualité des données.

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Ce travail est soutenu par le NIDDK du NIH sous le numéro d’attribution R01DK116899, l’USDA/ARS sous le numéro d’attribution 3092-51000-064-000D et un prix pilote de l’Institut de recherche cardiovasculaire du Baylor College of Medicine. Les organigrammes ont été produits à l’aide de BioRender.

Caractérisation morphologique et moléculaire du scBAT chez la souris

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<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+localization%2C+gene+expression+profiling+and+functional+characterization+of+adult+human+neck+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat.</a> Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).</li>
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<li>Mo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+supraclavicular+brown+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice.</a> JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Environmental+Temperature+and+High-Fat+Diet-Induced+Changes+in+Mouse+Supraclavicular+Brown+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue.</a> Cells. 10 (6), 1370(2021).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
<li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).</li>
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<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
<li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans ce protocole, nous présentons en détail les procédures de dissection et de traitement des scBAT pour les analyses H&E et d’expression génique. Comme le scBAT réside dans la couche intermédiaire du cou et se trouve le long des grosses veines, l’isolement de ce dépôt nécessite une technique précise. Plus précisément, pour avoir une vue claire du dépôt, nous recommandons de placer la souris sous un microscope à dissection après l’ouverture du cou. À l’aide d’une paire de pinces à pointe ultrafine pour décoller les scBAT de la glande salivaire et des veines environnantes, il faut prendre soin d’éviter de percer les veines. Un saignement excessif peut rendre plus difficile la localisation du scBAT. Pour traiter les scBAT pour la coloration H&E, nous avons adapté l’utilisation d’un protocole publié19 avec de légères modifications pour inclure l’utilisation de PFA à 4 %, d’alcools déshydrants et d’un solvant organique, le toluène, pour le traitement des tissus, comme indiqué dans la section sur le protocole. L’ensemble de la procédure prend ~6 jours et les lames colorées H&E peuvent être imagées le lendemain après la fin de la coloration.
La RT-qPCR utilisant l’ARN comme matériau de départ est la méthode la plus fréquemment utilisée pour l’analyse de l’expression génique dans le domaine de la biologie du tissu adipeux. Comme le scBAT est un dépôt BAT relativement petit par rapport à l’iBAT, il peut être difficile d’obtenir suffisamment d’ARN pour l’expression des gènes. Pour augmenter le rendement en ARN, nous recommandons d’appliquer les étapes de préparation séquentielle du lysat comme indiqué dans la section protocole, en commençant par poudrer le tissu à l’aide d’un pilon et d’un mortier pendant la congélation. En utilisant cette méthode de préparation de lysat, nous avons réussi à obtenir un échantillon d’ARN à haut rendement et de haute qualité pour l’analyse de l’expression génique du scBAT d’une souris adulte. Cette méthode de préparation de lysat peut également être appliquée pour obtenir des lysats de protéines de haute qualité à partir de scBAT pour le western blot avec l’utilisation d’un tampon de lyse des protéines.
En utilisant l’iBAT de souris, les chercheurs ont acquis des connaissances substantielles sur la fonction des MTD dans la thermogenèse et le métabolisme. L’identification récente de quelques dépôts de MTD jusqu’alors non reconnus chez la souris et l’homme, y compris scBAT, a révélé la nécessité d’études supplémentaires avant de pouvoir comprendre pleinement la contribution physiologique de la MTD chez la souris et l’homme adulte. En particulier, des études éclairant les origines, les fonctions et l’implication de ces dépôts MTD nouvellement découverts dans la thermogenèse et le métabolisme régional ou du corps entier sont justifiées.

La prévalence croissante de l’obésité aux États-Unis et dans le monde a suscité un grand intérêt pour la compréhension de son étiologie et l’identification de traitements potentiels 1,2. Le tissu adipeux joue un rôle essentiel dans le métabolisme, et la dérégulation du tissu adipeux peut entraîner le développement de l’obésité. Généralement, il existe deux types de tissus adipeux, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) peut stocker de l’énergie chimique et sécréter des facteurs endocriniens, le tissu adipeux brun (BAT) peut utiliser l’énergie chimique pour générer de la chaleur et maintenir la température corporelle dans le froid 3,4. En raison de cette capacité unique, l’activation de la BAT peut également augmenter la dépense énergétique et améliorer la sensibilité à l’insuline5.
La MTD exerce sa fonction par thermogenèse sans frisson, un processus médié par le découplage de la protéine 1 (UCP1)6. Les mammifères, y compris les souris et les humains, possèdent des quantités variables de MTD. La vision classique de la MTD est que ces tissus adipeux sont plus abondants chez les souris et les nourrissons que chez les humains adultes. iBAT, situé dans le flanc dorsal supérieur entre les omoplates, est le dépôt de BAT le plus étudié chez la souris. En appliquant des tests d’imagerie radio-isotopique et de biopsie, des études récentes ont identifié plusieurs dépôts de MTD chez l’homme adulte. Certains d’entre eux, y compris les dépôts trouvés dans le cou profond et la région sus-claviculaire, n’avaient pas été identifiés auparavant chez la souris ou d’autres animaux modèles 7,8,9,10,11. Parmi ces dépôts MTD, le scBAT est le dépôt le plus fréquemment observé chez l’homme adulte. Pour mieux comprendre l’origine et la contribution moléculaire de ces dépôts BAT nouvellement découverts chez l’homme, il est essentiel d’identifier des dépôts équivalents chez la souris qui permettent des manipulations génétiques et moléculaires pour retracer et tester le rôle fonctionnel de ces dépôts. Ainsi, nous et d’autres avons identifié quelques dépôts BAT jusqu’alors inconnus dans différents emplacements anatomiques chez la souris, notamment scBAT12,13, thoracique périvasculaire BAT14,15, périrénal BAT16 et périaortique BAT17. Le scBAT de souris ressemble anatomiquement au scBAT humain et morphologiquement à l’iBAT classique, exprimant des niveaux élevés d’UCP112.
Contrairement à l’iBAT de souris, qui peut être facilement disséquée, la scBAT est située dans la couche intermédiaire du cou de la souris, sous les glandes salivaires et le long de la veine jugulaire externe. L’isolement de ce dépôt pour les analyses histologiques et moléculaires peut être difficile. Nous décrivons ici en détail la procédure de dissection des souris postnatales et adultes et le traitement de ce dépôt pour l’histologie et l’analyse de l’expression génique.

<table><tbody><tr><td>Alcool déshydrant à 95 % (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Alcool déshydrant à 100 % (Flex 100)</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR à 96 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Binding Mini Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Lavage à haute rigueur</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Lavage à faible intensité</td> Moules <td>de base 7326804</td><td></td> <td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>(pour l’enrobage)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation sans capuchon 2 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 Instrument de PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Milieu de montage à faible viscosité</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 Solution de dilution de la DNase</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’élution</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 avec paraffine intermédiaire</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (0,5 % p/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Formule R Milieu d’infiltration paraffine</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 Hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (pour HCL-Ethanol)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI Cassettes d’enrobage</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec’s Pure Ethanol - 200 Proof (pour 70 % d’éthanol)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes 1,7 mL</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Joints Microseal 'B' (joints adhésifs)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Qualité Eau</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mortier Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (pour solution saline à 0,85 %)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop NanoDrop</td><td>Technologies</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Section de paraffine Bain de flottation</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tube Strip</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Pestle by Coors Tek Thomas</td><td>Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Pestle Pellet Motor</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Precision Model 19 Four sous vide&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>Apprêt : 36B4&nbsp ; (avant) 10 &mu ; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>Amorce : 36B4 (reverse) 10 &mu ; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Oligo de Chen lab</td></tr><tr><td>Amorce : Fabp4 (avant) 10 &mu ; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Base de données Oligo</td></tr><tr><td>Amorce : Fabp4 (reverse) 10 &mu ; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Base de données d’oligos</td></tr><tr><td>Amorce : Glut 4 (amorce directe) 10 &mu ; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Base de données Oligo</td></tr><tr><td>Amorce : Glut 4 (inverse) 10 &mu ; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Oligo de Chen lab</td></tr><tr><td>Amorce : PPARg (avant) 10 &mu ; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Base de données Oligo</td></tr><tr><td>Amorce : PPARg (réserve) 10 &mu ; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>Primer : Ppargc1a (reverse) 10 &mu ; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Oligo de Chen</td></tr><tr><td>lab Amorce : Ppargc1a(forward) 10 &mu ; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'</td><td></td><td></td><td>Base de données Oligo de Chen lab</td></tr><tr><td>Amorce : Ucp1 (avant) 10 &mu ; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Base de données Oligo</td></tr><tr><td>Amorce : Ucp1 (inverse) 10 &mu ; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’isolement d’ARN (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (décontaminant de surface)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td> inhibiteur de <td></td></tr><tr><td>la RNase (RNase Out)</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Flacon à scintillation (verre)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>Banc de séchage sur lames&nbsp ;</td><td>Electrothermique (Cole-Parmer)</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Grille de coloration en acier inoxydable</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope (pour encastrement)</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Sugiaux</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection droite à pointe superfine</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase inverse (comprend un tampon 5x premier brin et une TNT 0,1 M)&nbsp ;</td><td>Seringue Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET avec aiguille 25 G x 5/8", 1 mL</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (mélange maître d’enzymes qPCR)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Kit de coloration manuelle des lames (bocaux)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>SKU : 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

La thermogenèse médiée par le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle important dans la régulation du métabolisme, et sa morphologie et sa fonction peuvent être grandement influencées par les stimuli environnementaux chez la souris et l’homme. Actuellement, la MTD interscapulaire murine (iBAT), qui est située entre deux omoplates dans le flanc dorsal supérieur des souris, est le principal dépôt de MTD utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier la fonction des MTD. Récemment, quelques dépôts de MTD jusqu’alors inconnus ont été identifiés chez la souris, dont un analogue au tissu adipeux brun supraclaviculaire humain. Contrairement à iBAT, le tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) est situé dans la couche intermédiaire du cou et n’est donc pas accessible aussi facilement.
Pour faciliter l’étude des scBAT de souris nouvellement identifiées, un protocole détaillant les étapes de dissection des scBAT intactes de souris postnatales et adultes est présenté. En raison de la petite taille du scBAT par rapport aux autres dépôts adipeux, les procédures ont été modifiées et optimisées spécifiquement pour le traitement du scBAT. Parmi ces modifications, il y a l’utilisation d’un microscope à dissection pendant le prélèvement de tissus pour augmenter la précision et l’homogénéisation des échantillons de scBAT congelés afin d’augmenter l’efficacité de l’analyse qPCR ultérieure. Grâce à ces optimisations, l’identification, l’apparence morphologique et la caractérisation moléculaire du scBAT peuvent être déterminées chez la souris.

Contrairement à l’iBAT, qui est situé dans la couche sous-cutanée du dos entre deux omoplates, le scBAT est situé dans la couche intermédiaire du cou, s’étendant profondément entre les couches de muscle squelettique et la glande salivaire lorsqu’il se développe le long de la veine jugulaire externe (Figure 1A). La dissection de scBAT n’est pas aussi simple que l’iBAT. Nous fournissons ici une procédure détaillée comprenant des étapes cruciales pour disséquer des scBAT intacts de souris postnatales et adultes (Figure 1B,C). Après avoir ouvert le cou à l’aide du protocole fourni, une fine couche de scBAT peut être identifiée au microscope à dissection et décollée de la glande salivaire et de la veine jugulaire externe connectées à l’aide d’une paire de pinces (Figure 1D,E). Pour évaluer la morphologie du dépôt, des scBAT fraîchement isolés ont été traités en utilisant la procédure de traitement fournie combinée à une procédure de coloration H&amp;Epubliée précédemment 19 (Figure 2A). Comme le montre la figure 2B, scBAT possède des structures tissulaires typiques des dépôts BAT et est composé de nombreux petits adipocytes multiloculaires chez les souris postnatales et adultes en bonne santé. Pour évaluer les niveaux d’expression génique dans le scBAT, l’ARN a été extrait de dépôts scBAT isolés en utilisant les procédures fournies (Figure 3A). Les niveaux d’expression des gènes d’intérêt peuvent ensuite être évalués par des méthodes RT-qPCR standard (Figure 3A). Comme le montre la figure 3B, les niveaux d’expression différentiels des gènes impliqués dans la médiation de la fonction scBAT, y compris Pparg, le régulateur principal du développement de la BAT ; Fabp4 et Glut4, deux transporteurs de nutriments ; et Ucp1 et Ppargc1a, deux gènes impliqués dans la thermogenèse, peuvent être facilement déterminés. À titre de comparaison, l’ARN a été extrait d’iBAT isolé, et l’expression des gènes énumérés ci-dessus a également été évaluée à l’aide des procédures fournies (figure 3A). Les niveaux d’expression de ces gènes sont relativement similaires entre ces deux dépôts. (Figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg"> Figure 1 : Emplacement anatomique du scBAT et processus de sa dissection. (A) Emplacement du scBAT dans la couche intermédiaire du cou. (B) La couche superficielle du cou avant et après l’enlèvement de la peau. Barre d’échelle = 250 μm. Des lignes jaunes pointillées délimitent la zone qui doit être exposée après avoir fait l’incision en forme de U. (C) Image d’une carcasse de souris placée sous un microscope à dissection pour augmenter la clarté visuelle pendant la dissection. (D, E) Images représentatives de la couche intermédiaire du cou avant et après le retrait de scBAT chez des souris âgées de 3 semaines et 3 mois. Barre d’échelle = 250 μm. Des lignes jaunes pointillées délimitent les dépôts scBAT bilatéraux exposés ; n = 2. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; SFI = couche superficielle ; SG = glande salivaire ; tr = trachée ; jv = veine jugulaire externe ; SM = muscle squelettique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg"> Figure 2 : Traitement de la scBAT pour la coloration H&amp;E. (A) Organigramme illustrant les principales étapes du traitement de la scBAT pour la coloration H&amp;E. Après avoir disséqué le tissu, il est fixé séquentiellement, déshydraté, intégré, sectionné et coloré. (B) Images représentatives de scBAT colorées à l’H&amp;E provenant de souris âgées de 3 semaines et 3 mois ; n = 3 pour chaque stade de développement ; barre d’échelle = 250 μm pour les images à faible grossissement ; barre d’échelle = 50 μm pour les images à fort grossissement. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; PFA = paraformaldéhyde ; H&amp;E = hématoxyline et éosine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg"> Figure 3 : Préparation de l’ARN à partir de scBAT pour l’analyse de l’expression génique. (A) Organigramme illustrant les étapes de l’isolement de l’ARN et de l’analyse RT-qPCR de l’expression du gène scBAT. En raison de sa petite taille et de sa texture douce, la congélation instantanée du dépôt de scBAT et son broyage dans de l’azote liquide est cruciale pour réussir l’isolement de l’ARN. (B) Expression relative des gènes marqueurs, y compris Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 et Ppargc1a, dans scBAT et iBAT isolés de souris mâles âgées de 3 mois, n = 5. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. 36B4 a été utilisé comme gène d’entretien pour la normalisation. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; RT-qPCR = transcription inverse-PCR quantitative ; LN2 = azote liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous fournissons une procédure pratique pour disséquer et effectuer des analyses histologiques et d’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin.

Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

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Dans cette vidéo, nous montrons la procédure chirurgicale permettant d’isoler le tissu adipeux blanc sous-cutané et le tissu adipeux brun interscapulaire d’une souris nouveau-née.

Collection de dépôts adipeux blancs et bruns chez un bébé souris : une intervention chirurgicale pour récolter le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun chez le bébé souris

Grâce à la connexion drastique et négative entre l'obésité et d'autres comorbidités, la recherche sur le rôle adipeux joue dans la maladie et la santé globale est justifiée. Nous présentons un protocole pour l'isolement et l'excision de dépôts adipeux permettant l'étude du tissu adipeux à l'aide in situ et des procédés in vitro.

Localisation, identification, et l&#39;excision des dépôts adipeux murin

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

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Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.

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Identification et dissection des dépôts d'adipose de souris diverses

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Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

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Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

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Visualisation et quantification des tissus adipeux bruns et beiges chez la souris à l’aide de l’imagerie micro-PET/MR [18F]FDG

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

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Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Découvrez la dissection précise du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) pour la biologie métabolique. Cette méthode combine microscopie, analyse d'expression génique et histologie pour améliorer l'efficacité d'extraction et la qualité des données.

Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin

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