Name: Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions unicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 3 s
Description: Apprenez à créer un modèle de plaie murin stable et à préparer des suspensions unicellulaires de peau de souris. Cette méthode permet d'étudier l'impact des vésicules extracellulaires dérivées de MSC sur la cicatrisation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (#82373494).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique du septième centre médical de l’hôpital général chinois de l’APL, en Chine. Des souris mâles C57/BL6 âgées de 6 semaines ont été utilisées. 
1. Modèle de cicatrisation des plaies chez la souris
<ol>
	<li>Groupement d’animaux
	<ol>
		<li>Attribuez au hasard des souris à des groupes expérimentaux et témoins (6 chacun). Abriter les souris dans un établissement d’élevage exempt d’agents pathogènes spécifiques, avec une température maintenue à 23-25 °C, un taux d’humidité de 50 à 60 % et un cycle lumière-obscurité de 12 heures.</li>
		<li>Fournir aux souris un accès illimité à de la nourriture standard et à de l’eau du robinet autoclave.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation préopératoire
	<ol>
		<li>Retenez doucement la souris à l’aide d’une contention ou en la tenant solidement en position couchée. Chargez la seringue avec du pentobarbital sodique à 1 % rétabli à température ambiante, administrée à une dose de 0,1 mL/20 g de poids corporel. 
		REMARQUE : La solution de pentobarbital sodique à 1 % doit être conservée dans un environnement sombre à 4 °C.</li>
		<li>Nettoyez l'abdomen de la souris avec des cotons-tiges imbibés d'alcool. Insérez la seringue légèrement inclinée dans l’abdomen. Aspirer avant l’injection pour éviter une administration par inadvertance dans la vessie ou les intestins. Attendez 10 min.</li>
		<li>Une fois que la souris cesse de se contracter et ne répond plus aux stimuli, appliquez de la vaseline blanche sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Utilisez un rasoir pour tailler la fourrure dorsale plus longue.</li>
		<li>Appliquez la crème dépilatoire sur le dos, attendez 2 minutes et essuyez doucement avec de la gaze humide pour éviter d'endommager la peau de la souris. Assurez-vous que la crème dépilatoire n’est pas laissée en place pendant une période prolongée.</li>
		<li>Désinfectez délicatement la peau environnante avec trois tampons alternés de bétadine et d’alcool à 70 %.</li>
		<li>Poinçon de biopsie cutanée en autoclave, ciseaux, pinces et autres instruments pour la stérilisation. Maintenez un espace de travail stérile. Effectuez une intervention chirurgicale ultérieure sur un chiffon chirurgical frais.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Excision cutanée pleine épaisseur 
	REMARQUE : Le modèle d’attelle de plaie a été utilisé pour évaluer l’efficacité du traitement de la cicatrisation des plaies.
	<ol>
		<li>À l'aide d'un marqueur permanent, marquez la partie centrale supérieure de la région dorsale de la souris avec un cercle de 8 mm de diamètre.</li>
		<li>Soulevez la peau dorsale à l’aide d’une pince propre et faites la première incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins. Après la première coupe, tenez la zone de peau partiellement retirée à l’aide d’une pince et découpez soigneusement les cercles marqués.</li>
		<li>Utilisez un anneau en acier inoxydable conçu sur mesure (diamètre intérieur 15 mm, diamètre extérieur 18 mm). Suturez l’anneau métallique à la périphérie du site d’incision avec 5-0 sutures non résorbables, empêchant la contraction de la peau du site d’incision (Figure 1A). Utilisez de l’acier inoxydable comme matériau de l’anneau pour éviter la rouille et la déformation.</li>
		<li>Administrer une seule injection sous-cutanée de 0,1 mL de chlorhydrate de buprénorphine dilution à 10 % près de la plaie pour traiter la douleur post-chirurgicale.</li>
		<li>Réintroduisez la souris pour nettoyer les cages individuelles. Placez la souris en position couchée. Ne laissez pas la souris sans surveillance avant qu’elle n’ait repris conscience.</li>
		<li>Observez et photographiez la plaie de la souris tous les 2 jours pour mesurer la taille de la plaie après l’anesthésie comme décrit à l’étape 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marquage du tampon de la plaie pour obtenir du tissu de biopsie
	<ol>
		<li>Préparez-vous à l’expérience comme décrit aux étapes 1.1 et 1.2.</li>
		<li>Créez des tampons personnalisés de marquage d’enroulement de souris avec un diamètre de cercle de 8 mm et une longueur de côté carré de 10 mm (Figure 1B).</li>
		<li>Positionnez la souris en position couchée et désinfectez la peau dorsale avec des cotons-tiges imbibés d’alcool. Trempez le tampon dans l’encre. Faites une marque sur la partie centrale supérieure du dos de la souris avec le tampon.</li>
		<li>Excise soigneusement toute la couche cutanée du dos le long de la marque circulaire à l’aide de ciseaux chirurgicaux, en exposant complètement la couche musculaire. Laissez la plaie ouverte sans pansement pour éviter d'interférer avec l'état de la plaie. Maintenez la stérilité de la plaie en plaçant la souris dans un environnement propre et désinfecté et en permettant à la plaie de former naturellement une croûte.</li>
		<li>Administrer une seule injection sous-cutanée de 0,1 mL de chlorhydrate de buprénorphine dilution à 10 % près de la plaie pour traiter la douleur post-chirurgicale.</li>
		<li>Réintroduisez la souris pour nettoyer les cages individuelles. Placez la souris en position couchée. Ne laissez pas la souris sans surveillance avant qu’elle n’ait repris conscience.</li>
		<li>Observez et photographiez la plaie de la souris tous les 2 jours pour mesurer la taille de la plaie après l’anesthésie, comme décrit à l’étape 1.2.</li>
		<li>Effectuer l’administration du traitement comme décrit au point 1.4</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Administration du traitement
	<ol>
		<li>4 h après que la souris a repris conscience, effectuez l’anesthésie décrite aux étapes 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Injectez par voie sous-cutanée le traitement souhaité, ici 100 μg d’exosome dérivé de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hucMSC-Exo) dissous dans 200 μL de PBS autour du site d’incision pour le groupe de traitement.</li>
		<li>Injecter par voie sous-cutanée 200 μL de PBS autour du site d’incision pour le groupe témoin.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.5.2 et 1.5.3 tous les deux jours pendant 14 jours maximum. Inspectez le site d’injection pour détecter tout gonflement, rougeur ou signe d’infection.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Préparation pour le séquençage de l’ARN unicellulaire
<ol>
	<li>Prélèvement et préparation des tissus
	<ol>
		<li>Effectuez l’anesthésie comme décrit aux étapes 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Soulevez la peau dorsale à l’aide d’une pince propre et retirez les croûtes. Coupez environ 2 cm2 de peau près de la plaie, en coupant le tissu adipeux et les gros vaisseaux sanguins.</li>
		<li>Transférez la biopsie cutanée à l’aide d’une pince stérile dans un puits d’une plaque à 6 puits remplie de 4 ml de PBS pré-réfrigérés.</li>
		<li>Lavez avec du PBS en transférant séquentiellement la biopsie dans de nouveaux puits (plaque à 6 puits) remplis de 4 ml de PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sang visible.</li>
		<li>Coupez la peau avec un scalpel en morceaux d’environ 2 mm, en la lavant davantage dans du DPBS contenant 0,04 % de BSA et en enlevant tous les débris.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociation enzymatique (Figure 2)
	<ol>
		<li>Combinez 1 mL de collagénase I (10 mg/mL), 1 mL de collagénase IV (5 mg/mL), 1 mL de collagénase D + Dispase II (15 mg/mL), 1 mL de DNase I (5 mg/mL) et 6 mL de DPBS dans un tube conique stérile pour préparer la solution de digestion. Mélangez soigneusement les composants pour assurer l’homogénéité.</li>
		<li>Placez le tube conique dans un bain-marie réglé à 37 °C pendant 10 min pour préchauffer la solution de digestion.</li>
		<li>Ajouter 2,5 mL de solution de digestion dans le tissu et digérer à 37 °C pendant 70 min, en retournant l’éprouvette toutes les 10 min pour bien mélanger.</li>
		<li>Pré-mouiller une crépine de 70 μm avec tampon de lavage (0,2 % BSA dans le PBS). Transférez le mélange réactionnel, y compris les cellules dissociées et les fragments de tissu résiduels, à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL de diamètre large sur la crépine.</li>
		<li>Filtrez ce mélange à travers la crépine à cellules pré-mouillées de 70 μm dans un tube à centrifuger de 15 mL.</li>
		<li>Centrifuger le mélange réactionnel avec du tissu digéré à 300 x g, à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et conserver la pastille (cellules) pour l’étape suivante de dissociation.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lyse des globules rouges
	<ol>
		<li>Diluer la solution de lyse des globules rouges (10x) dans un rapport de 1:10 avec de l’eau distillée deux fois. Diluez les cellules avec 1x solution de lyse des globules rouges dans un rapport de 1:10 dans un tube conique.</li>
		<li>Agitez le mélange pendant 5 s, incubez à température ambiante pendant 2 min, puis centrifugez à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un volume égal de DPBS et stockez-les sur de la glace.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>filtration
	<ol>
		<li>Récupérez la suspension cellulaire et filtrez-la à travers une crépine de 40 μm dans un nouveau tube conique.</li>
		<li>Rincer le tube 2 fois avec 4,5 mL de RPMI (10 % FCS) pour assurer la collecte des cellules restantes.</li>
		<li>Procéder à la centrifugation de la suspension cellulaire à 300 x g à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez le surnageant, agitez doucement la pastille et remettez en suspension les cellules avec des pointes à large calibre dans 50 μL de BSA PBS à 0,04 %. Maintenez les cellules sur la glace tout au long de ce processus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Élimination des cellules mortes
	<ol>
		<li>Mélangez le tampon de stock du kit d’élimination des cellules mortes 20x avec de l’eau sans nucléases dans un rapport de 1:20 pour obtenir un tampon de liaison 1x.</li>
		<li>Centrifuger l’échantillon à 300 x g, retirer le surnageant et ajouter 10 μL de microbilles d’élimination des cellules mortes pour 60 mg d’échantillon de peau.</li>
		<li>Incuber 15 min à température ambiante. Ajouter une mémoire tampon jusqu’à ce qu’elle atteigne 500 μL. Chargez l’échantillon dans la colonne préparée du kit et fixez-le au dissociateur.</li>
		<li>Exécutez le programme de dissociation pour séparer les cellules vivantes. Une fois le programme terminé, filtrez la suspension à travers un filtre de 30 μm et diluez-la avec du D-PBS. de volume égal
		REMARQUE : Si la vitesse d’égouttement ralentit sensiblement, remplacez rapidement la colonne pour éviter que les impuretés ne bloquent les pores et n’affectent la récupération cellulaire.</li>
		<li>Effectuez la coloration à l’orange d’âcridine/iodure de propidium (AO/PI) et le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez les critères d’acceptation suivants : viabilité cellulaire ≥ 85 %, taux d’agrégation cellulaire < 20 % et absence de globules rouges ou de fragments cellulaires visibles.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procédure de dissociation pour le kit de dissociation multi-tissus (Alternative)
	<ol>
		<li>Mélangez 2,5 ml de RPMI 1640, 100 μL d’enzyme D, 50 μL d’enzyme R et 12,5 μL d’enzyme A1 dans un tube MACS C doux (composants du kit de dissociation multitissulaire).</li>
		<li>Transférez le tissu dans le tube MACS C doux contenant le mélange d’enzymes et fermez-le hermétiquement.</li>
		<li>Placez le tube à 37 °C dans un bain-marie pendant 90 min avec une inversion douce toutes les 10 min pour assurer une exposition adéquate des tissus à la solution de dissociation.</li>
		<li>Jetez la solution de dissociation et lavez les mouchoirs avec du DPBS.</li>
		<li>Faire passer les suspensions unicellulaires à travers des crépines de cellules de 70 μm et 40 μm de manière séquentielle et centrifuger à 4 °C pendant 10 min à 300 x g.</li>
		<li>Lyser les globules rouges à l’aide du réactif de lyse des globules rouges en suivant la même procédure que à l’étape 2.3.</li>
		<li>Éliminez les cellules mortes à l’aide du kit d’élimination des cellules mortes en suivant la même procédure qu’à l’étape 2.58.</li>
		<li>Effectuez la coloration AO/PI et le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez les critères d’acceptation suivants : viabilité cellulaire ≥ 85 %, taux d’agrégation cellulaire < 20 % et absence de globules rouges ou de fragments cellulaires visibles.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Protocol for Mouse Wound Healing Model with Stem Cell-Derived Exosomes

<ol><li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Wu, J., Landén, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+skin+wound+healing+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigation of skin wound healing using a mouse model.</a> Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265(2013).</li>
<li>Ganguli-Indra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cutaneous+wound+healing+assay+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model.</a> Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+differentiation+and+characterization+of+vascular+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).</li>
<li>Dead cell removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline">https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline</a> (2015).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+wound+closure+in+mice+using+skin-punch+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).</li>
<li>Gao, C., Zhang, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+two+single-cell+sequencing+platforms%3A+Bd+rhapsody+and+10x+genomics+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium.</a> Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Plusieurs étapes cruciales ont été essentielles au succès du protocole. Ces étapes comprenaient une préparation précise de la zone de la plaie par un rasage et un nettoyage minutieux, la création de plaies standardisées de taille et de profondeur spécifiques, et des soins post-plaies diligents pour surveiller les infections et administrer les traitements appropriés. La normalisation de ces procédures a permis d’assurer l’uniformité dans toutes les conditions expérimentales, améliorant ainsi la fiabilité et la reproductibilité des résultats10.
Nous avons utilisé le marquage de l’empreinte de la plaie pour le séquençage, car d’autres méthodes introduisent des variables supplémentaires telles que l’égratignure de la plaie de souris et la déchirure de la suture 2,5. Le modèle de tampon améliore la cohérence initiale des plaies chez la souris et fournit un point de référence standardisé pour évaluer la cicatrisation des plaies, réduisant ainsi les inexactitudes potentielles dans l’estimation du taux de cicatrisation des plaies dans les modèles murins. De plus, le tampon facilite l’utilisation de logiciels tels qu’ImageJ. Cependant, comme un pansement n’est pas utilisé pour couvrir la plaie, la méthode d’estampage a des exigences de désinfection beaucoup plus élevées pour l’environnement. L’expérience devra être répétée si une infection se produit.
La variabilité biologique entre les souris individuelles peut introduire de la variabilité dans les résultats expérimentaux, ce qui nécessite des échantillons de plus grande taille pour des analyses statistiques robustes. Ce modèle peut être étendu à d’autres techniques de séquençage, telles que le séquençage spatial, afin d’améliorer encore son utilité.
L’optimisation des conditions de dissociation scRNA-Seq et la sélection des méthodes de dissociation appropriées sont des étapes essentielles du flux de travail expérimental. À l’heure actuelle, les méthodologies couramment utilisées incluent la digestion enzymatique en conjonction avec l’approche génomique recommandée 10x basée sur les réactifs11. Notamment, la digestion enzymatique est nettement plus rentable que la méthode à base de réactifs ; Cependant, il nécessite plusieurs itérations pré-expérimentales pour optimiser la sélection des enzymes et la durée de la digestion.
Dans cette étude, des expériences préliminaires ont été menées à l’aide de diverses combinaisons d’enzymes. La méthode sélectionnée répondait aux exigences de base du contrôle qualité en aval, malgré l’absence d’un kit de réactifs génomiques 10x spécialement conçu pour la dissociation de la peau de souris sur toute sa longueur. Au lieu de cela, le kit de dissociation multi-tissus 1 a été utilisé pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité. Cependant, il est important de noter le coût relativement élevé associé à cette méthode, bien qu’elle offre une stabilité supérieure par rapport aux techniques internes de digestion enzymatique. Pour les échantillons de valeur, l’utilisation de la méthode de dissociation basée sur les réactifs génomiques 10x est recommandée.
Il est crucial de tenir compte de l’impact potentiel de la variabilité interindividuelle sur la viabilité cellulaire, car cela peut faire en sorte que certains échantillons ne répondent pas aux critères requis et donc affecter la qualité des données en aval12.
Du côté positif, cette méthode offre des possibilités d’intégration avec la transcriptomique spatiale ou d’autres approches multi-omiques, offrant ainsi un cadre analytique plus complet13. De plus, ses applications cliniques potentielles mettent en évidence sa polyvalence et sa pertinence au-delà des contextes de la recherche fondamentale.

La souris est un modèle animal largement reconnu dans la recherche pour sa séquence génétique hautement homologue à celle de l’homme, sa reproduction rapide, son rapport coût-efficacité et sa taille gérable1. Cependant, il existe des différences dans la structure de la peau entre les souris et les humains. Les souris ont une couche de membrane cutanée distincte qui contribue à la contraction de la peau, jouant un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies chez cette espèce. En revanche, la cicatrisation des plaies humaines implique principalement la réépithélialisation et la formation de tissu de granulation1.
Malgré ces différences interespèces dans la structure de la peau, le modèle murin reste le choix privilégié dans la recherche sur la réparation des plaies et conserve une importance significative par rapport à d’autres modèles animaux2,3. Lorsque vous utilisez de la peau de souris pour imiter les processus de cicatrisation des plaies humaines, il est essentiel d’examiner attentivement divers facteurs d’influence. Ces facteurs comprennent le choix des sites appropriés pour les interventions chirurgicales, la prise en compte du cycle des follicules pileux de souris et la compréhension des effets de la contraction de la membrane cutanée4,5. La mise en œuvre de mesures correspondantes est essentielle pour optimiser les conditions expérimentales et améliorer la précision des résultats d’observation.
Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) séquence les cellules à un niveau beaucoup plus raffiné que le séquençage de l’ARN conventionnel et a une exigence beaucoup plus élevée pour la qualité de l’échantillon avec des différences intragroupe minimes. De multiples expériences ont été menées pour affiner un modèle de défaut cutané aigu de pleine épaisseur chez la souris stable. Ces expériences ont utilisé une combinaison de méthodes établies dans la littérature et d’approches innovantes pour évaluer la cicatrisation des plaies de manière exhaustive 2,5. Pour développer le modèle de cicatrisation des plaies, l’excision cutanée de souris sur toute l’épaisseur a été utilisée pour reproduire le processus physiologique de réparation et de régénération des plaies. Son objectif était d’évaluer les altérations potentielles induites par divers traitements à l’aide du scRNA-seq. La dissociation du tissu cutané des souris pose des défis, notamment une faible viabilité cellulaire et des taux d’agrégation élevés, lors de la préparation de suspensions unicellulaires 6. Ces difficultés peuvent entraîner des problèmes tels que l’encrassement des instruments et la capture anormale des cellules, ce qui peut compromettre la qualité des données. Compte tenu du coût considérable du séquençage unicellulaire, la réalisation de plusieurs expériences préliminaires est cruciale pour garantir la stabilité et la fiabilité de la suspension unicellulaire. Cette étude a évalué l’efficacité de la dissociation enzymatique mixte et de la méthode de dissociation du kit tissulaire afin d’identifier l’approche optimale pour la dissociation tissulaire 6,7. Cette étude établit une base solide pour d’autres investigations approfondies.

<table><tbody><tr><td>75 % Alcolchol</td><td>Liuhe</td><td>JIUJING500ML</td><td></td></tr><tr><td>souris C57/BL6J</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D + Dispase II</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>5349907103</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Roche</td><td>5267439001</td><td></td></tr><tr><td>cotons-tiges</td><td>Haishi</td><td>MIANQIAN</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’élimination des cellules mortes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche 10104159001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMAC Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Fil de nylon médical</td><td>Jinlong</td><td>HM507</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation multi-tissus 1</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-201</td><td></td></tr><tr><td>poinçon aiguille de biopsie</td><td>Integra Miltex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solution de lyse des globules rouges</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Jinglu</td><td>JIANDAO</td><td></td></tr><tr><td>Pétrolatum blanc</td><td>Shangyuan</td><td>BAIFANSHILIN</td><td></td></tr></tbody></table>

modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions de cellules uniques

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

La prise en charge des lésions cutanées aiguës de pleine épaisseur représente un défi considérable dans la pratique clinique. La complexité de la cicatrisation des plaies, impliquant des populations cellulaires diverses et le microenvironnement complexe de la plaie, complique l’évaluation des effets du traitement et de leurs interactions à l’aide d’approches expérimentales traditionnelles. La technologie de séquençage du transcriptome unicellulaire a révolutionné la compréhension des fonctions et des mécanismes cellulaires pendant la cicatrisation des plaies. Cependant, la variabilité des méthodologies de création de modèles de plaies chez la souris introduit des facteurs de confusion qui peuvent avoir un impact sur les résultats expérimentaux. De plus, le processus de dissociation des tissus cutanés de souris présente des obstacles techniques importants, soulignant le besoin critique de suspensions unicellulaires de haute qualité pour un séquençage précis du transcriptome. Par conséquent, cette étude vise à optimiser la construction de modèles de plaies chez la souris afin d’évaluer avec précision les changements dans la fermeture de la plaie tout en éliminant les variables qui pourraient influencer le résultat du séquençage ultérieur. De plus, la préparation de suspensions unicellulaires a été effectuée à l’aide de protocoles de préparation d’enzymes et de protocoles de kits de test afin d’optimiser le coût et l’efficacité.

Plusieurs variantes de la procédure ont été explorées. Les protocoles d'empreintes ont été privilégiés car ils interfèrent peu avec le processus de cicatrisation et préservent l'intégrité de la plaie en évitant des perturbations telles que les grattages ou les points de suture. Ceci permet d'éviter d'introduire du bruit au niveau cellulaire unique lors du séquençage ultérieur. Le fait de placer des plaies de chaque côté d'une souris a entraîné des différences notables de surface lésionnelle en raison de l'élasticité intrinsèque de la peau de la souris (Figure 3A,B). Des ponctions bilatérales ont été réalisées pour positionner les plaies plus près des bords, une région particulièrement sujette au comportement d'automutilation par grattage chez la souris. Les souris âgées de 7 semaines ou plus ont été jugées inappropriées pour l'étude, car un sous-ensemble d'entre elles a présenté un assombrissement irrégulier de la peau dorsale vers le 10e jour suivant la chirurgie, signe du début de la repousse du pelage (Figure 4A). Ce phénomène a introduit une variable supplémentaire indésirable.
Lorsque des anneaux en caoutchouc étaient utilisés, qu'il s'agisse de caoutchouc souple ou dur, ces anneaux avaient tendance à se détacher et se délogeaient souvent du site de la plaie en environ 12 heures en raison des mouvements fréquents des souris et des propriétés adhésives limitées des anneaux. Les anneaux en caoutchouc fixés par des points de suture étaient sujets à la déchirure, nécessitant des sutures répétées pour assurer leur stabilisation. Cette procédure itérative de sutures entraînait à son tour un traumatisme supplémentaire pour les souris (Figure 4B,C). En revanche, les anneaux métalliques ont démontré une stabilité supérieure et de meilleures propriétés de rétention, permettant d'évaluer les effets de réépithélialisation sans interférence de la contraction de la plaie.
Étant donné le potentiel de l'anneau métallique-suture avec attelle à provoquer des lésions cutanées supplémentaires en dehors de la zone de la plaie et à appliquer des contraintes mécaniques non uniformes sur la plaie, un poinçon standardisé aux dimensions fixes a été utilisé afin de faciliter les analyses ultérieures.
L'analyse a révélé que le groupe soumis au traitement d'exemple (hucMSC-Exo) présentait un rythme de cicatrisation plus rapide par rapport au groupe témoin (Figure 5A). Bien que la cicatrisation complète se soit produite plus rapidement dans le modèle au tampon que dans le groupe avec anneau métallique suturé, qui limite la contraction de la plaie, aucune différence statistiquement significative des taux de cicatrisation n'a été observée durant les 7 premiers jours (Figure 5B). Ces résultats concordent avec des travaux antérieurs de Lin et al., suggérant que les 10 premiers jours de cicatrisation cutanée chez la souris impliquent principalement la réépithélialisation plutôt que la contraction9.
Comparaison de la dissociation 
Après une optimisation approfondie de la composition enzymatique, la combinaison de la dispase II et de la collagénase a montré des performances supérieures par rapport à l'utilisation d'une seule enzyme (Tableau 1). Importamment, la présence de globules rouges ou de débris cellulaires était minimale, répondant ainsi aux critères essentiels pour l'utilisation en machine, qui incluent une viabilité cellulaire supérieure à 85 % et un taux d'agrégation inférieur à 20 %.
En revanche, l'approche utilisant le kit de test a montré des résultats prometteurs, avec une viabilité cellulaire relativement plus élevée et un taux d'agrégation cellulaire plus faible (Tableau 1). De plus, aucune hématie ni fragment cellulaire n'a été observé, indiquant une qualité cellulaire globalement supérieure par rapport aux autres méthodes.
<img alt="Dispositif chirurgical sur la peau d'un animal ; schéma d'incision circulaire ; plaie avec mesure au ruban." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Modèle finalisé de plaie chez la souris. (A) Image représentative de l'anneau métallique sur mesure suturé. (B) Image représentative du poinçon cutané et de la plaie excisée. Diamètre : 8 mm. Bord : 1 cm. (C) Taux de fermeture de la plaie. Barre d'erreur : erreur standard. Test T bilatéral (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Procédé de préparation des cellules : préparation de l'échantillon, dissociation, lyse des globules rouges, élimination des cellules mortes, suspensions monocellulaires." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Schéma de préparation de suspensions monocellulaires. Les étapes comprennent la collecte de l'échantillon, la dissociation, la lyse des globules rouges, l'élimination des cellules mortes et la mise en suspension monocellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Expérience de cicatrisation de plaies chez le rat ; images chronologiques, jour 1 et jour 6 après l'opération ; règle de mesure." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Modèle de plaie chez la souris avec des plaies de chaque côté. (A) Une image représentative du modèle de plaie chez la souris avec des plaies de chaque côté est présentée. Diamètre de référence circulaire blanc : 8 mm. (B) Image représentative de la cicatrisation des plaies à différents moments pour les plaies situées de chaque côté. La peau du dos de la souris près de la queue guérit plus rapidement que celle près du cou. Côté de l'objet de référence carré blanc : 1 cm. Diamètre de l'objet de référence circulaire blanc : 8 mm. Abréviations : POD = jours postopératoires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de l'expérience de cicatrisation des plaies avec mesures, du JOP 1 au JOP 10, étude d'une incision cutanée chez le rat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Modèle de plaie chez la souris avec des lésions uniques. (A) Image représentative de la cicatrisation des plaies à différents stades de croissance du poil chez des souris âgées de 7 semaines. Les souris se trouvent à différents stades de croissance du poil au JOP 10. La peau plus foncée cicatrise plus rapidement. (B) Image représentative d'anneaux adhésifs en caoutchouc. Côté du carré blanc servant d'objet de référence : 1 cm. (C) Image représentative des lignes de suture. Diamètre de l'objet de référence rond blanc : 8 mm. Abréviations : JOP = jours postopératoires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Taux de fermeture de la plaie au fil du temps ; graphiques en barres expérimentaux comparant l'efficacité des traitements ; analyse statistique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5 : Taux de fermeture de la plaie. (A) Comparaison entre les groupes témoin et hucMSC-Exo. Les barres d'erreur représentent les erreurs standards. Test T bilatéral (n=6). (B) Comparaison entre les groupes « stamp » et anneau métallique. Les barres d'erreur représentent les erreurs standards. La significativité a été calculée à l'aide du test t bilatéral (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Taux de viabilité cellulaire</td>
			<td>Taux d'agrégation cellulaire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Approche interne</td>
			<td>86.90%</td>
			<td>18.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Approche par kit de test</td>
			<td>90.65%</td>
			<td>13.73%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Viabilité et taux d'agrégation des deux approches de préparation des cellules.

Cette étude présente deux techniques expérimentales cruciales : la construction d’un modèle de plaie murine pour évaluer la fermeture de la plaie et la préparation de suspensions unicellulaires à partir de peau murine pour préserver la viabilité cellulaire.

Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions de cellules uniques

The management of acute full-thickness skin injuries presents a considerable challenge in clinical practice. The complexity of wound healing, involving ...

mouse-wound-models-and-preparation-of-single-cell-suspensions

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions unicellulaires 

Cette vidéo décrit un simple gain de temps technique pour la dissociation des tissus automatisée en utilisant les dissociateur gentleMACS pour préparer une seule cellule de suspensions de splénocytes de souris.

Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Dissocier les cellules de différents types de tissus spécifiques requiert des paramètres spécifiques pour aggitation tissus pour obtenir un volume élevé de viabilité, de cellules cultivables. Le Miltenyi gentleMACS dissociateur optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. Dans cette publication, l'utilisation de cet appareil sur le tissu nerual est expliqué.

Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules CD11b, y compris la microglie, du cerveau des petits de souris en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement. Les tissus cérébraux sont homogénéisés pour obtenir des suspensions unicellulaires, qui sont incubées avec des microbilles enrobées d’anticorps anti-CD11b, suivies d’une séparation sur colonne magnétique pour purifier la population de cellules CD11b+.

Isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau d’un bébé souris

La vidéo montre la préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir d’un tissu cérébral murin. Il implique une digestion enzymatique pour libérer les cellules du tissu cérébral, suivie d’une centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules immunitaires en fonction de leur densité afin d’obtenir la suspension unicellulaire.

Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Cet article explique comment le cerveau postérieur embryonnaires de souris peut servir comme modèle pour étudier la neurogenèse du développement dans les organes entiers et préparations de section de tissu.

Le rhombencéphale de souris comme un modèle pour étudier la neurogenèse embryonnaire

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

Un protocole général pour la dissociation mécanique enzymatique et semi-automatisée combinée des tissus afin de générer des suspensions unicellulaires pour des analyses en aval, telles que la cytométrie en flux, est fourni. Des instructions pour la fabrication, l’assemblage et le fonctionnement du dispositif mécanique à faible coût développé pour ce protocole sont incluses.

Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

L’application des résultats de la microscopie intravitale est mise à l’épreuve par sa faible profondeur de pénétration dans les tissus. Nous décrivons ici un modèle de souris à chambre de fenêtre dorsale qui permet le co-enregistrement de la microscopie intravitale et des modalités d’imagerie cliniquement applicables (par exemple, CT, IRM) pour une corrélation spatiale directe, rationalisant potentiellement la traduction clinique des résultats de la microscopie intravitale.

Modèle murin de tumeur à chambre fenêtre de pli cutané dorsal pour la microscopie intravitale combinée et l’imagerie par résonance magnétique dans la recherche translationnelle sur le cancer

Ce protocole décrit un système microfluidique modélisant la dynamique métabolique neuronale post-lésion axonale, permettant l’imagerie, l’analyse multi-omique et les études mécanistes du remodelage métabolique intrinsèque.

Construction de modèles de puce microfluidique pour la construction et l’analyse multi-omique

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.

Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris

Apprenez à créer un modèle de plaie murin stable et à préparer des suspensions unicellulaires de peau de souris. Cette méthode permet d'étudier l'impact des vésicules extracellulaires dérivées de MSC sur la cicatrisation.

Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions de cellules uniques

Explorer plus de vidéos