Name: Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Apprenez à générer et maintenir des embryons de poissons-zèbres exempts de germes jusqu'au stade juvénile. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-microbiote et leur impact sur le développement et l'immunité chez Danio rerio.

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Nous remercions sincèrement le soutien du Chongqing Medical University Talent Project (n° R4014 au DSP et R4020 au PPJ), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, n° 32200386 à PPJ), du Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) et du Programme du Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour la recherche et la démonstration de la technologie de l’eau de l’Académie chinoise des sciences (CAS)/Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour l’éducation et la recherche par le CAS.

Optimisation des modèles de poissons-zèbres GF : génération, maintenance et études microbiennes

Le protocole de GF Artemia a été accordé en tant que brevet par l’Administration nationale chinoise de la propriété intellectuelle, ce qui permettra de lever l’utilisation restreinte de la méthode après avoir obtenu l’autorisation des auteurs. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’autres intérêts concurrents ou financiers.

Étapes critiques dans les protocoles du poisson GF et de la préparation des aliments GF Au cours de la génération des modèles de poissons GF, plusieurs étapes critiques ont été impliquées, notamment la préparation du matériel stérile, la stérilisation des embryons, le renouvellement quotidien du GZM, la collecte de divers échantillons et l’examen stérile de chaque échantillon à l’aide de plusieurs méthodes. Parmi ces étapes, le traitement initial des embryons est fondamental et décisif pour la réussite des modèles GF. Le contrôle des agents, de leurs concentrations et des temps de traitement est crucial pour obtenir des taux de stérilisation optimaux et le succès de l’éclosion. Une attention particulière est nécessaire lors de la manipulation des embryons de poissons GF jusqu’aux larves, ce qui implique des changements quotidiens de milieu et s’assure que les matériaux et les plates-formes sont soigneusement stérilisés à l’aide d’une lumière ultraviolette ou d’un autoclave lors du retrait des plaques de l’incubateur. La surveillance des conditions de température et du temps de fonctionnement pendant l’hiver est essentielle pour prévenir la mort des larves causée par des températures plus basses sur des bancs propres.
Le jaune d’œuf stérile et l’artémia GF doivent être détectés avant d’être donnés aux poissons après 7 dpf afin de garantir leur état stérile pour les modèles GF à long terme. Pendant la période d’alimentation, le nettoyage des résidus alimentaires est important dans le cadre des échantillons collectés pour la détection lors du renouvellement du déchet. Le contenant, le volume de GZM et la masse alimentaire doivent être ajustés en même temps que les stades de croissance et de développement afin d’éviter la perte de poissons GF en raison d’un environnement limité et de problèmes de qualité de l’eau. La surveillance régulière et l’ajustement de ces paramètres contribuent à la bonne tenue à jour des modèles de poissons GF.
Modifications et importance de ces protocoles Le processus simplifié en trois étapes de génération d’embryons de poisson-zèbre GF, impliquant des agents, des concentrations et des temps d’exposition optimisés des solutions AB-GZM, PVP-I et NaClO, garantit un taux de stérile élevé et un développement sain des modèles. De plus, les méthodes de détection stérile pour les échantillons quotidiens ont été perfectionnées pour inclure des cultures sur plaques et en milieu liquide dans des conditions aérobies et anaérobies, ainsi que des techniques moléculaires utilisant des amorces bactériennes courantes. D’autres expériences dans le domaine des tests de contaminants bactériens et fongiques visent à optimiser les contaminants isolants et les tests stériles lors de techniques animales GF48.
Le protocole spécifique pour les nauplii GF Artemia en tant que nourriture vivante pour les modèles de poissons a été étudié dans notre étude, et un brevet a été accordé à PPJ et DSP par l’Administration nationale de la propriété intellectuelle de Chine (No. ZL202210482684.8). Les modèles de poissons GF à long terme sont constamment limités par une nutrition inadéquate et inadaptée, ce qui exacerbe les faiblesses des fonctions intestinales liées à la digestion et à l’absorption. En tant que source de nourriture crédible pour les modèles de medaka et de poisson-zèbre à différents stades de leur vie, GF Artemia sp. devrait être facile à préparer avec une procédure simple, un temps d’incubation court et une détection stérile en temps réel pour une utilisation quotidienne. Dans cette méthode, les kystes normaux d’Artemia sont rincés à une concentration suffisante de NaClO pour être aseptiques, puis incubés dans un flacon pelliculé, ainsi que sur une plaque et dans un milieu liquide pour la détection. Cela permet de faire éclore des nauplii fraîchement éclos pour nourrir les poissons GF. Le taux stérile et le taux d’éclosion des artémias, ainsi que la longueur du corps, le poids et l’activité de l’artémia, sont excellents, ce qui indique les applications disponibles dans la pratique.
L’importance de ces modifications dans les poissons GF et les protocoles alimentaires GF profite aux chercheurs dans la génération de modèles aux embryons, aux larves, aux stades juvéniles et même aux premiers stades adultes et adultes chez les espèces marines et d’eau douce. Les animaux GF à long terme fourniront l’autorisation en tant que modèles in vivo dans la recherche sur le criblage de médicaments et les fonctions microbiennes pendant la croissance et le développement de l’hôte, en particulier dans la maturité de l’immunité et des lignées cellulaires intestinales associées. Par exemple, les larves de poisson-zèbre ne possèdent une immunité innée qu’au cours de la première semaine, puis développent le système d’immunité adaptative au cours de 7 à 21 dpf, ainsi qu’une maturité du thymus31,49. De plus, les modèles de poissons GF peuvent offrir la possibilité d’analyser les interactions bactéries-bactéries et microbiote-hôte avec observation en direct des processus dynamiques de colonisation et de migration dans les organismes50,51.
Limites de la méthode L’élevage de poissons GF des juvéniles aux adultes précoces (28 dpf-2,5 mpf) et aux adultes sexuellement matures (>2,5 mpf) reste difficile en raison de la mortalité accrue et du risque de contamination bactérienne pendant l’entretien du modèle. Ces limites proviennent principalement de l’absence de systèmes d’autoculture adaptés aux poissons vivant dans un environnement GF. Ces systèmes doivent inclure de l’air pur, de l’eau et un système alimentaire pour maintenir efficacement les animaux et leur environnement, assurant une isolation complète des micro-organismes externes. Contrairement à d’autres modèles d’animaux GF tels que les souris et les poulets52, il est difficile d’obtenir du poisson-zèbre GF par le biais d’opérations anatomiques à partir des parents CR en raison de leurs habitudes aquatiques et de leur style de fécondation naturel.
Traiter les animaux adultes comme étant complètement dépourvus de microbiote intestinal est également un défi. Bien que le traitement antibiotique puisse induire un état similaire à celui des animaux exempts d’agents pathogènes spécifiques (FPS), caractérisé par une réduction du microbiote détecté dans les échantillons fécaux, il reste difficile d’obtenir de véritables modèles de poissons adultes GF. Les défis liés à l’établissement et au maintien des modèles de GF, en particulier pendant la transition de l’état juvénile à l’état à long terme, sont importants. L’importance de la progéniture GF, comme les œufs GF F1 ou F2 de poissons GF adultes, dans la recherche microbienne est reconnue. Cependant, il faut beaucoup de temps pour surmonter les défis liés à l’établissement et au maintien de modèles de poissons GF adultes à long terme.
Il convient de noter que le poisson-zèbre gnotobiotique avec une colonisation bactérienne spécifique a été développé, montrant une survie chronique basée sur des modèles GF. Néanmoins, il n’est pas certain que ces modèles puissent servir d’alternatives viables aux modèles GF dans les infections bactériennes et la recherche biomédicale.
Applications futures des modèles de poissons GF Dans cette étude, nous avons affiné le protocole de génération de modèles de poissons-zèbres GF, passant de l’embryon à la juvénile. Cette avancée a des applications importantes en biologie du développement, en immunologie, en recherche sur les maladies humaines et en organogenèse. Grâce à l’isolement et à l’identification de masse, l’étude explore les fonctions, les mécanismes et les métabolites dérivés de l’intestin de souches bactériennes uniques. L’enquête implique l’infection de modèles de poisson-zèbre GF après l’ouverture de l’évent au stade47,53. De plus, les bactéries marquées par fluorescence facilitent l’observation de la colonisation et de la distribution dans les larves vivantes de GF, exemptes d’autres influences microbiennes54. Des modèles de poissons GF similaires, tels que le medaka marin ou d’eau douce, peuvent être créés à l’aide de méthodes comparables avec divers agents ou changements de milieu.
Pour sonder les mécanismes de la maladie humaine, l’étude utilise des méthodes FMT, en transférant des échantillons de patients ou de donneurs à des animaux sains ou à des modèles GF55. Contrairement aux animaux élevés de manière conventionnelle, les modèles GF offrent des preuves solides des fonctions, des impacts ou des réponses microbiennes chez l’hôte, en particulier lorsqu’ils sont combinés à des bactériophages pour réguler les bactéries cibles dans le microbiote46.
En résumé, les poissons-zèbres GF servent de modèles puissants pour évaluer l’innocuité bactérienne, l’efficacité des médicaments, la toxicité des polluants ou l’interférence des composés, en raison de leur environnement intestinal sensible et pur. L’exploration future des applications des poissons GF devrait englober divers domaines, avec la nécessité de créer des modèles de poissons GF adultes pour une compréhension plus approfondie des fonctions microbiennes à différents stades de la vie.

Le microbiote (c’est-à-dire les archées, les bactéries, les eucarya et les virus) joue un rôle crucial dans le maintien de la santé de l’hôte et contribue au développement de diverses maladies en influençant les processus physiologiques et pathologiques par le biais d’interactions symbiotiques au sein de la barrière intestinale, de la surface épithéliale et des fonctions de la mucine chez les individus 1,2,3. La composition du microbiote à travers les différents stades de la vie, de la petite enfance à la jeunesse, à l’âge adulte et au vieillissement, ainsi que sa présence à divers endroits tels que les narines, la bouche, la peau et les intestins, sont façonnées de manière dynamique par divers habitats et environnements4. Le microbiote intestinal dans les organismes est impliqué dans l’absorption des nutriments, la réponse immunitaire, l’invasion d’agents pathogènes, la régulation métabolique, etc. 5,6. Des études sur des patients ont démontré que les perturbations du microbiote intestinal sont liées à l’obésité humaine, aux troubles du sommeil, à la dépression, aux maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), aux maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer), au vieillissement et à divers cancers 7,8,9. De plus, les voies interactives entre le microbiote intestinal et les hôtes impliquent des facteurs inflammatoires, des neurotransmetteurs, des métabolites, la barrière intestinale et le stress oxydatif, comme observé dans des recherches antérieures utilisant des modèles de souris et de poissons10,11.
Récemment, de multiples approches ou thérapies liées aux bactéries, y compris des probiotiques potentiels et la transplantation de microbiote fécal (FMT), ont été explorées pour ces troubles dans des modèles cliniques et animaux. Ces explorations sont basées sur des découvertes liées à l’axe microbiote-intestin-cerveau/foie/rein, aux produits dérivés du microbiote et à l’activité altérée des récepteurs12,13. Cependant, le développement, les diverses fonctions et les mécanismes du système microbiote-hôte sont encore incomplètement compris et identifiés en raison de la complexité de la communauté microbienne et du défi de générer de puissants modèles de maladies semblables à celles de l’homme.
Pour résoudre ces problèmes, des modèles animaux exempts de germes (GF) ont été proposés d’urgence au milieu du 19e siècle et principalement développés au cours du 20e siècle. Des améliorations ultérieures, y compris des modèles traités aux antibiotiques et gnotobiotiques, ainsi que des progrès dans les technologies de détection et d’observation microbiennes, ont perfectionné ces modèles 14,15,16. Les animaux GF, créés en effaçant leur propre arrière-plan et en évitant les microbes environnementaux, offrent une excellente stratégie pour explorer les interactions entre les micro-organismes et leurs hôtes17. Grâce à l’application de modèles animaux et de protocoles affinés, les chercheurs ont réussi à reproduire des compositions microbiennes similaires trouvées chez des patients chez des souris et des poissons GF. De plus, d’autres modèles d’animaux GF, tels que les chiens, les poulets et les porcs, offrent diverses options en tant que sujets de recherche 18,19,20,21. Cette approche a permis d’étudier les effets thérapeutiques potentiels des microbiomes commensales sur diverses maladies, y compris l’immunothérapie du cancer chez l’homme16,18. Les modèles GF offrent des informations plus précises sur les caractéristiques et les mécanismes de la colonisation, de la migration, de la multiplication et de l’interaction bactériennes spécifiques au sein des hôtes. Cela fournit de nouvelles informations cruciales sur l’apparition et le développement des maladies liées au microbiote22,23. L’histoire de l’établissement et de l’application du poisson-zèbre GF dans la recherche microbienne a évolué depuis les rapports de Rawls et al. en 2004 et de Bates et al. en 2006 jusqu’au protocole de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Cependant, la faisabilité de modèles de GF adultes ou reproducteurs est encore un processus prolongé, accompagné d’une longévité, de taux de réussite et de problèmes de santé variables.
Parmi les différents modèles animaux, le poisson-zèbre (Danio rerio) se distingue comme un outil essentiel pour la recherche fondamentale et biomédicale en raison de sa similitude avantageuse avec les organes humains et la génomique, de son cycle de développement court, de sa fécondité élevée et de ses embryons transparents19,26. Les poissons-zèbres, qui servent de modèles fiables de maladies humaines, offrent une représentation visuelle des processus physiologiques et pathologiques in vivo, donnant un aperçu des caractéristiques attrayantes des interactions hôte-microbe. Notamment, les poissons-zèbres présentent des lignées cellulaires distinctes, permettant l’imagerie de la physiologie intestinale, de la dynamique microbienne, des gonades et du développement reproducteur, de la maturation du système immunitaire de l’hôte, du comportement et dumétabolisme27. Les embryons de poisson-zèbre se développent dans des chorions protecteurs jusqu’à l’éclosion, devenant des larves 3 jours après la fécondation (dpf). Ils chassent activement pour se nourrir à 5 dpf et atteignent la maturité sexuelle environ 3 mois après la fécondation (mpf)28. Le premier poisson-zèbre sans germes (GF) réussi, rapporté par Rawls et al.24, a montré que les larves nourries avec de la nourriture autoclavée après absorption du vitellus présentaient une nécrose tissulaire à partir de 8 dpf et une mort totale à 20 dpf. Cela a révélé les effets de l’alimentation ou l’importance de tenir compte de l’apport exogène en nutriments dans les expériences impliquant des poissons SG à long terme (>7 dpf)29. Des études ultérieures ont amélioré le protocole de génération des poissons GF, en utilisant des aliments stériles et des méthodes perfectionnées dans différents modèles de poissons16.
Cependant, la plupart des recherches sur les modèles de poissons-zèbres GF se sont concentrées sur les premiers stades de la vie, impliquant une infection bactérienne à 5 dpf pendant 24 h à 48 h, avec des échantillons collectés avant 7 dpf à la fin des expériences 25,30,31. Il est largement reconnu que le microbiote des organismes, y compris les humains et les poissons-zèbres, est colonisé au début de la vie et façonné au cours de la croissance et du développement. La composition reste stable aux stades adultes, les rôles du microbiote chez l’hôte étant cruciaux tout au long de la vie, en particulier dans les aspects du vieillissement, des maladies neurodégénératives, métaboliques et des maladies intestinales3. Ainsi, les perspectives d’animaux GF ayant une survie plus longue peuvent donner un aperçu des mécanismes des rôles microbiens dans le développement et les fonctions des organes de l’hôte, compte tenu des systèmes immunitaires et reproducteurs immatures des larves de poissons au début de la vie. Alors que des souches bactériennes dans les intestins du poisson-zèbre ont été isolées et identifiées dans des études antérieures, offrant le potentiel d’infecter des modèles animaux GF pour sélectionner des probiotiques ou rechercher les fonctions bactériennes chez l’hôte19,25, la génération et l’application de modèles de poissons GF ont été principalement limitées aux premiers stades de la vie. Cette limitation, attribuée à la complexité du processus de production, aux coûts d’entretien élevés et aux problèmes associés à l’alimentation et à l’immunité, entrave les efforts de recherche visant à étudier les effets développementaux et chroniques du microbiote chez l’hôte.
Le taux de survie, le comportement, la croissance, la maturation et la santé globale des poissons, en particulier dans les modèles sans germes (GF), sont significativement influencés par les pratiques alimentaires, englobant l’apport nutritionnel et l’absorption pendant la période d’ouverture de la bouche, des larves précoces aux juvéniles32,33. Cependant, l’un des défis de l’élevage des poissons GF est la rareté des régimes stériles appropriés, ce qui limite l’efficacité du soutien nutritionnel pour soutenir la croissance et la survie des larves. La résolution de ce problème est cruciale pour restaurer la vie des poissons GF, compte tenu de leurs mécanismes de défense développementaux et de leurs faibles capacités de digestion dues à l’absence de microbiome intestinal. En termes de nourriture, les artémias vivants (Artemia sp.) apparaissent comme le régime alimentaire le plus approprié pour les larves à bouche ouverte comme pour les poissons juvéniles. Il a été observé que les poissons nourris avec des artémias vivants présentent des taux de croissance et de survie plus élevés que ceux nourris avec du jaune d’œuf cuit ou d’autres appâts naturels et synthétiques34. Bien que les modèles précoces de poissons GF puissent survivre avec le soutien du vitellin et que les modèles de larves GF puissent être maintenus avec une alimentation stérile, il reste difficile de générer des modèles à long terme des larves aux juvéniles et d’atteindre la maturité sexuelle. De plus, les aliments en flocons ou en poudre sont limités par une composition nutritionnelle inégale et peuvent avoir un impact sur la qualité de l’eau. En revanche, les artémias vivants présentent des avantages tels que la survie en eau salée et douce, une petite taille adaptée aux larves aux adultes, une facilité de dosage et une qualité d’éclosion supérieure35. En nous appuyant sur les méthodes précédentes 16,24,30, nous avons simplifié le processus de traitement complexe et relevé le défi de l’alimentation en établissant des Artemia sp. vivants sans gluten facilement incubés comme nourriture stérile pendant de plus longues durées que les poissons sans gluten en début de vie.
Cette étude présente un protocole optimisé couvrant (1) la génération, (2) l’entretien, (3) l’identification du taux de stérileté, et (4) l’entretien et l’alimentation pour assurer la croissance du poisson-zèbre sans germes (GF) de l’embryon au stade larvaire et juvénile. Les résultats offrent des preuves préliminaires sur l’éclosion, la survie, la croissance et la stérilité du poisson-zèbre GF, ainsi que des indices essentiels pour GF Artemia sp. en tant qu’aliment stérile. Les étapes détaillées de la génération de modèles et de la préparation d’aliments vivants stériles fournissent un soutien technique crucial pour la construction et l’application de modèles à long terme de poissons GF, ainsi que GF Artemia sp. dans la recherche sur l’interaction microbiote-hôte. Le protocole aborde l’isolement, l’identification et l’infection bactériennes sur des modèles de poissons GF, en décrivant les méthodes de marquage par fluorescence bactérienne et en observant leur colonisation dans les intestins des poissons au microscope. Les poissons GF, les poissons gnotobiotiques atteints d’une infection bactérienne ou les modèles de microbiote humain transférés subiront diverses détections pour élucider leurs fonctions et leurs effets sur l’immunité de l’hôte, la digestion, le comportement, la régulation transcriptomique et les aspects métaboliques. À long terme, ce protocole peut être étendu à différentes espèces de poissons sauvages, comme le medaka marin, et potentiellement à d’autres lignées de poissons-zèbres transgéniques sélectionnées corrélées à des tissus ou à des maladies spécifiques.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>Amphotéricine :Solarbio ; &nbsp ; kanamycine :Solarbio ; Ampicilline :Solarbio.</td><td>Amphotéricine :CAS :1397-89-3 ; kanamycin : CAS : 25380-94-0 ; Ampicilline : CAS : 69-52-313.</td><td>49,6 mL GZM, 50 & micro ; L solution mère d’amphotéricine (250 & micro ; g/mL), 25 et micro ; L solution mère de kanamycine (10 mg/mL) et 250 & micro ; L solution mère d’ampicilline (20 mg/mL).</td></tr><tr><td>1,5 mL, 15 mL, 50 mL EP</td><td>tubes biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Pour collecter des échantillons et maintenir des agents</td></tr><tr><td>2,4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS : 7681-52-9</td><td>Dilué avec une solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 8 %.</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits, 24, 48 puits</td><td>LABSELECT&nbsp ;</td><td>11112</td><td>Pour l’élevage</td></tr> <tr><td>de poissonsAeronomas</td><td>Base de données NCBI</td><td>n°MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>Plaques anaérobies TSA</td><td>tryptone :Oxoid ; peptone de soja : Solarbio ; NaCl :Biosharp ; poudre de gélose : BioFroxx.</td><td>tryptone : LP0042B ; peptone de soja : Cat#S9500 ; NaCl :BS112 ; poudre de gélose : 9002-18-0.</td><td>Les plaques TSA ont été préparées avec un milieu de 400 mL contenant 6 g de tryptone, 2 g de peptone de soja, 2 g de NaCl et 6 g de poudre de gélose sous le système anaérobie.</td></tr><tr><td>Poste de travail anaérobie</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>Isolement bactérien, tests stériles</td></tr><tr><td>Analyse GraphPad</td><td>Prism 5</td><td>v6.07</td><td>Pour analyser les données</td></tr><tr><td>API 20 E kits</td><td>&nbsp ; BioMérieux SA, France</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 Kits pour détecter le métabolisme bactérien</td></tr> <tr><td>Artemia (Artémias)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td><td></td><td>Kystes d’artémias de marque Aquamaster et œufs d’artémias</td></tr><tr><td>Système de cycle automatique pour la pisciculture</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>Pas de chat</td><td>Entretenir le poisson</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Zeal Way</td><td>G154DWS</td><td>Préparer les matériaux</td></tr><tr><td>BHI Aerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>Le milieu BHI a été préparé, dans lequel 100 mL de milieu comprenait 3,7 g de poudre BHI.</td></tr><tr><td>BHI Anaérobie</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>Le milieu BHI a été préparé et divisé en tubes anaérobies sous le système anaérobie.</td></tr><tr><td>Incubateur biochimique</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>Pour poissons et assiettes</td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>Traitement et test stériles</td></tr><tr><td>Agent de blanchiment de 0,02 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS : 7681-52-9</td><td>Solution de travail avec concentration en hypochlorite de sodium (NaClO) : Diluée avec une solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 8 % ou 166,6 μL d’hypochlorite de sodium à 6 % avec 500 ml d’eau distillée.</td></tr><tr><td>Plaques de sang</td> de <td>mouton : Solarbio</td><td>N° de catalogue TX0030</td><td>Du sang de mouton stérile défibriné a été ajouté à la TSA pour préparer 5 % de plaques de sang.</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Pour la culture</td></tr><tr><td>des poissons CM-Dil colorants</td><td>Sondes moléculaires</td><td>Cat#C7000&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour étiqueter les bactéries</td></tr><tr><td>Incubateur à agitation à température constante</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>Base</td></tr><tr><td>de données</td> de culture bactérienne <td>NCBI</td><td>Base de données sur les bactéries et les archées</td><td>Lien : Archaea FTP : ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bactéries FTP : ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>Pipette Pasteur jetable</td><td>biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>Utilisée pour changer l’eau et transférer les œufs</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri jetable</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>Pour la culture</td></tr> des <tr><td>kits d’ADN de</td> poisson <td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>Kits d’extraction d’ADN génomique bactérien.</td></tr><tr><td>Pipette électrique</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Change water</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI database</td><td>No.MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Sel de mer :LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>Composé de</td><td>1 L d’eau et de 1,5 mL de solution de sel marin (40 g/L), autoclave. La teneur en sel marin dans la solution GZM était de 60 mg/L.</td></tr><tr><td>Système d’eau pure de laboratoire</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>Préparer les agents</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Avec lumière fluorescente pour observer les larves de poissons</td></tr><tr><td>Kits PCR</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq Kit d’ADN polymérase</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>LABSELECT&nbsp ;</td><td>sp-013-10</td><td>Changer d’eau</td></tr><tr><td>Povidone iodée (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Lot#H1217005</td><td>Solution aqueuse povidone iode 0,4 g/L d’eau pure.</td></tr><tr><td>Convertisseur de synchronisation</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>Pour réguler la lumière</td></tr><tr><td>TSA plaques</td><td>tryptone :Oxoid ; peptone de soja : Solarbio ; NaCl :Biosharp ; poudre de gélose : BioFroxx.</td><td>tryptone : LP0042B ; peptone de soja : Cat#S9500 ; NaCl :BS112 ; poudre de gélose : 9002-18-0.</td><td>Des plaques TSA ont été préparées avec un milieu de 400 mL contenant 6 g de tryptone, 2 g de peptone de soja, 2 g de NaCl, 6 g de poudre d’agar.</td></tr><tr><td>TSB Tryptone aérobie</td><td>: Oxoïde ; peptone de soja : Solarbio ; NaCl :Biosharp ;</td><td>tryptone : LP0042B ; peptone de soja : Cat#S9500 ; NaCl :BS112 ;</td>Un <td>milieu TSB a été préparé, dans lequel un milieu de 400 mL comprenait 6 g de tryptone, 2 g de peptone de soja et 2 g de NaCl.</td></tr><tr>TSB Tryptone <td>anaérobie</td><td>: Oxoïde ; peptone de soja : Solarbio ; NaCl :Biosharp ;</td><td>tryptone : LP0042B ; peptone de soja : Cat#S9500 ; NaCl :BS112 ;</td><td>Le milieu TSB a été préparé et divisé en tubes anaérobies sous le système anaérobie.</td></tr><tr><td>Établi ultra-propre</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>Traitement et test stériles</td></tr><tr><td>Système d’écoulement ultra-pur pour la pisciculture</td><td>Entreprise d’équipement biologique marin</td><td>Non Chat</td><td>Produire de l’eau pour les poissons</td></tr><tr><td>VibrioBase</td> <td>de données NCBI</td><td>n°MK178501</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Les poissons-zèbres servent de modèles précieux pour la recherche sur la croissance, l’immunité et le microbiote intestinal en raison de leurs similitudes génomiques avec les mammifères, de leurs embryons transparents développés dans un environnement de chorion relativement propre et du développement extrêmement rapide des larves par rapport aux modèles de rongeurs. Les poissons-zèbres exempts de germes (Danio rerio) sont essentiels pour évaluer la toxicité des polluants et établir des modèles de maladies similaires à celles de l’homme liées aux fonctions microbiennes. Par rapport aux modèles élevés de manière conventionnelle (RC) (poissons en élevage commun), le poisson-zèbre GF permet une manipulation plus précise du microbiote de l’hôte, aidant à déterminer la relation de cause à effet entre les micro-organismes et les hôtes. Par conséquent, ils jouent un rôle essentiel dans l’avancement de notre compréhension de ces relations. Cependant, les modèles de poisson-zèbre GF sont généralement générés et étudiés au cours des premiers stades de la vie (de l’embryon à la larve) en raison des limitations de la fonction immunitaire et de l’absorption des nutriments. Cette étude optimise la génération, la maintenance et l’identification des premiers modèles de poissons-zèbres GF sans alimentation et avec une alimentation à long terme avec des aliments GF (tels que Artemia sp., artémias ). Tout au long du processus, des échantillonnages et des cultures quotidiens ont été effectués et identifiés grâce à de multiples détections, y compris des plaques et le séquençage de l’ARNr 16S. Le taux d’asepsie, la survie et les indices de développement du poisson-zèbre GF ont été enregistrés pour garantir la qualité et la quantité des modèles générés. Il est important de noter que cette étude fournit des détails sur les techniques d’isolement bactérien et d’infection des poissons GF, permettant la création efficace de modèles de poissons GF des larves aux stades juvéniles avec un soutien alimentaire GF. En appliquant ces procédures dans la recherche biomédicale, les scientifiques peuvent mieux comprendre les relations entre les fonctions bactériennes intestinales et la santé de l’hôte.

Les modèles de poisson-zèbre GF peuvent être produits efficacement en utilisant les œufs abondants pondus par les couples de poissons-zèbres, avec le protocole optimisé sur la base des modèles de poissons GF précédents35. Une seule plaque à 6 puits peut élever environ 30 à 48 embryons/larves, ce qui permet une collecte de données et une analyse statistique suffisantes. Après le traitement stérile, les embryons GF sont cultivés dans un incubateur propre jusqu’à l’éclosion des larves à 48-72 h, et changent de GZM quotidiennement avec la détection des échantillons collectés, ce qui est crucial pour maintenir l’état exempt de germes (Figure 1). Après 7 dpf, la nourriture de jaune d’œuf et d’artémias vivants doit être préparée pour les larves aux stades juvéniles. Au cours de la croissance et du développement des poissons, le volume, le contenant et la densité du GZM doivent être régulés ou modifiés à temps pour éviter la mort et l’échec de l’état stérile. Si la détection ne montre pas de pollution bactérienne, les modèles GF réussis peuvent être maintenus en tant que modèles chroniques de la juvénile au début de l’âge adulte, mais le taux de survie est beaucoup plus faible dans la pratique. Enfin, le taux de stérilité, le taux de survie, l’indice de développement, le comportement, l’analyse histopathologique et le profil de transcription des modèles de poissons GF et CR peuvent être mesurés pour explorer l’influence du microbiote et des champs de dépistage de médicaments. Dans cette étude, les principaux indices de développement ont été comparés (figure supplémentaire 1), et le taux d’éclosion des poissons GF était inférieur de 45,7 % à celui des poissons CR, avec 60 % à 72 hpf. Les fréquences cardiaques des larves GF à 7 dpf étaient significativement plus faibles à 18,2 battements/10 s par rapport aux poissons CR avec 22,6 battements/10 s, mais il n’y avait pas de différence entre les deux groupes à 14 dpf avec des taux de 23,5 à 23,8 battements/10 s. Le taux de survie des poissons GF à 7 dpf était le même que celui des poissons CR à 86,7 %, mais a diminué à 60 % à 14 dpf contre 80 % pour les poissons CR. Cependant, les taux de survie des poissons GF et CR ont diminué à 25 % à 10 % après la période d’ouverture de la bouche lorsqu’ils ont acquis des capacités ou des habitudes alimentaires. L’incapacité à maintenir le statut stérile des poissons était l’une des raisons du taux de survie plus faible. Par conséquent, l’alimentation et l’entretien des nutriments des stades juvéniles au début de l’âge adulte sont des défis critiques dans la pisciculture.
Un autre facteur clé qui affecte la croissance et le développement des poissons est l’alimentation. Dans cette étude, nous explorons plusieurs méthodes pour obtenir des artémias GF comme nourriture vivante pour les larves de poisson-zèbre GF à long terme jusqu’aux juvéniles et aux adultes (processus illustré à la figure 2). En raison de l’utilisation quotidienne de nourriture pour les poissons GF, le protocole optimisé pour GF Artemia devrait être facile, rapide et économique en pratique. Après avoir comparé le mouvement actif et la mort/immobilité des nauplii observés au microscope, les caractéristiques des nauplii, des œufs non éclos et de la coquille, la méthode est perfectionnée. Après l’incubation quotidienne, les indices d’artémias GF frais obtenus à partir de bouteilles, y compris le taux d’éclosion, de survie et de difformité, ainsi que la longueur et le poids des nauplius, ont été observés et mesurés au microscope (figure 3). Après traitement, le taux d’éclosion des kystes d’artémia était élevé, avec une moyenne de 88,15%, la survie des nauplies nageuses était de 77,83% et le taux de malformation était de 1,87%. La longueur corporelle des nauplii était de 546,70 μm et l’indice de poids corporel était de 3,80 mg/100, ce qui convient à la capture et à l’alimentation des poissons depuis la période d’ouverture des larves jusqu’aux stades juvénile et adulte.
La détection des poissons GF et des artémias GF est également importante pour l’entretien des modèles. Selon le prélèvement d’échantillons et de multiples méthodes d’essai, les résultats peuvent fournir le succès des embryons de poisson-zèbre traités et des kystes d’artémias dans la plaque de culture et le milieu liquide (Figure 4). Les différents échantillons prélevés quotidiennement doivent être détectés comme stériles dans toutes les méthodes d’essai, qui peuvent alors indiquer les modèles GF au moment de la collecte. L’artémia GF doit être détectée avant de se nourrir de poissons GF, ou les résultats de l’incubateur à plaque et à milieu doivent faire référence à l’état stérile des nauplies vivantes fraîches. C’est-à-dire, cultivez GF Artemia à partir de kystes sur des plaques TSA ou du verre liquide TSB ou BHI en incubation shake, qui pourrait être utilisé pour générer des artémias GF et une vérification stérile en même temps. Le protocole GF Artemia peut accueillir un nombre limité de larves pour se nourrir. Au cours du processus d’alimentation, il était évident que l’artémia GF nageait à l’intérieur du GZM, puis qu’il était capturé et consommé par les larves de poisson GF.
Les applications des modèles de poissons GF impliquent divers domaines de la biologie et de la médecine, permettant l’étude des fonctions microbiennes, de la croissance et du développement, des mécanismes de la maladie et du criblage de probiotiques ou de médicaments, entre autres46. Dans cette étude, par exemple, deux bactéries intestinales majeures, Aeromonas sp. et Vibrio sp., ont été isolées chez le poisson zèbre. Les caractéristiques et l’identification de la colonie ont été effectuées, et plusieurs fonctions métaboliques ont été mesurées in vitro à l’aide de kits disponibles dans le commerce (figure 5). Ces bactéries ont été isolées et identifiées par séquençage 16S, et les résultats de l’explosion ont été présentés dans un rapport précédent42. Les souches bactériennes identifiées permettent des recherches scientifiques sur l’impact du microbiote simple ou combiné sur la santé de l’hôte en infectant les modèles de poissons GF. La transparence des larves de poissons permet d’observer des cellules bactériennes marquées en fluorescence à l’aide de colorants CM-Dil, révélant la colonisation et la distribution dans les intestins des poissons GF (illustré à la figure 6). Après une infection bactérienne à 5 dpf, les larves de poisson-zèbre GF peuvent être imagées avec un microscope à fluorescence et observées en continu de 6 à 14 dpf, fournissant des informations sur les fonctions microbiennes combinées aux indices de développement, aux changements histopathologiques et aux altérations moléculaires47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> Figure 1 : Protocole du poisson-zèbre GF de l’embryon à la larve et aux juvéniles. Les étapes clés de la génération du poisson-zèbre GF comprennent : (1) La collecte d’embryons de poissons-zèbres de type sauvage et leur placement dans AB-GZM. (2) Traitement de rinçage avec des agents PVP-I et NaClO pour assurer une stérilité complète. (3) Culture d’embryons/larves GF dans des plaques à 6 puits avec GZM, en renouvelant le milieu quotidiennement. (4) Régulation des conditions de culture pour une croissance et un développement optimaux. (5) Échantillonnage à différents stades de développement, suivi d’un test de stérilité à l’aide de méthodes sur plaque et en milieu liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> Figure 2 : Protocole de préparation d’artémias GF comme aliment vivant pour les poissons GF. Les étapes clés comprennent : (1) Traitement de rinçage des kystes d’artémia pour une stérilité complète. (2) Préparation des kystes GF dans le milieu. (3) Incubation dans une solution saline pendant 24 h pour favoriser l’éclosion. (4) Filtration des œufs échoués et des œufs vides pour recueillir les nauplii actifs. (5) Laver les nauplies collectées pour éliminer les débris, garantissant des aliments vivants de haute qualité et sans contaminants. (6) Test de stérilité de l’artémia GF avant l’alimentation des larves de poissons GF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> Figure 3 : Indices des kystes d’artémias GF et des nauplii incubés pendant 24 h. (A) Kystes d’artémia non traités avec film d’impuretés (barre d’échelle : 500 μm). (B) Kystes artémiens traités avec une surface légèrement convexe après absorption d’eau et un aspect plus propre (barre d’échelle : 500 μm). (C) Examen microscopique de nauplii GF GF vivants frais incubés (barre d’échelle : 2000 μm) et (D) grossissement avec une barre d’échelle de 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> Figure 4 : Détection stérile des poissons GF à chaque stade de leur cycle biologique et des artémias GF. (A) Essais stériles d’échantillons de poissons CR et GF à l’aide d’un milieu liquide TSB et BHI, d’un TSA et de plaques sanguines dans des conditions aérobies et anaérobies. (B) Tests stériles de kystes d’artémias non traités, de kystes d’artémia GF et de nauplii à l’aide d’un milieu liquide TSB et BHI, d’un TSA et de plaques sanguines dans des conditions aérobies et anaérobies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> Figure 5 : Isolement et identification de bactéries intestinales chez le poisson zèbre. (A) Souches bactériennes, caractéristiques des colonies, cartes de séquençage 16S (exemples : Aeromonas sp. et Vibrio sp.). (B) Accessions du genre et du NCBI. (C) Fonctions métaboliques des bactéries isolées de l’intestin du poisson-zèbre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> Figure 6 : Infection et colonisation de souches de bactéries intestinales chez le poisson-zèbre GF. (A) Récupération de souches bactériennes isolées et identifiées pour des expériences d’infection. (B) Marquage des bactéries avec des colorants fluorescents et infection des larves de poisson-zèbre GF à 5 dpf. Grossissement : 1x. (C) Observation de la distribution et de la colonisation des bactéries (Vibrio sp.) dans les tissus intestinaux in vivo. Grossissement : 3x. (D) Comptage des UFC de bactéries (Aeromonas sp. et Vibrio sp.) dans chaque larve de poisson par échantillonnage quotidien. Les données présentent la moyenne ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Amorces</td>
			<td>Séquences(5'-3')</td>
			<td>Longueur du produit</td>
		</tr><tr><td>27 ans</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 pb</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr><tr><td>63F</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 pb</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Amorces utilisées pour la détection bactérienne.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composants</td>
			<td>Unités</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td>
			<td>2,5 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>Tampon 10× (Mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>Mélange dNTP</td>
			<td>2,5 millions d’euros</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>Base de teint 27F</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Apprêt 1492R</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Sans ADN/ARN H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>ADN matrice</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Volume total</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Concentration finale et volume des composants par réaction.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Pas</td>
			<td>Température</td>
			<td>Heure</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation initiale</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 minutes</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>1 minute</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>Recuit</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 minute</td>
		</tr><tr><td>Extension</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 minute</td>
		</tr><tr><td>Prolongation finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>Durée : 10 minutes</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Tenir</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Programme de PCR pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S.
Figure supplémentaire 1 : Les indices de développement critiques des modèles de poisson-zèbre GF et CR. (A) Le taux d’éclosion des poissons-zèbres CR et GF à 72 hpf, et (B) battements cardiaques/10 s des poissons CR et GF à 7 dpf et 14 dpf. Les taux de survie (%) des poissons RC et GF ont diminué de 7 jours à 14 jours avec 86 %, 60 % à 80 % à 10 % à 25 % à 30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit les principales étapes à suivre pour obtenir des embryons de poissons exempts de germes (GF) et les maintenir depuis l’état larvaire jusqu’au stade juvénile, y compris l’échantillonnage et la détection de leur statut stérile. L’utilisation de modèles GF avec infection est importante pour comprendre le rôle des microbes dans la santé de l’hôte.

Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

La portée de cette recherche est la génération de nouveaux modèles animaux exempts de germes, qui seront des outils utiles et puissants dans l’étude de diverses fonctions du microbiome. Dans ce domaine, les premiers modèles de poissons exempts de germes ont été utilisés récemment, mais les modèles à long terme sont encore limités en raison de diverses conditions d’élevage et de la défense du développement du personnel. Les modèles actuels de poissons GF sont normalement des modèles de vie précoce.Ainsi, les technologies telles que la balance stérile, les méthodes de détection des échantillons et la fourniture d’aliments stériles sont des défis très importants à surmonter. Le modèle du poisson-zèbre sans germes est crucial pour étudier l’interaction hôte-microbiote et leurs impacts sur le développement, l’immunité et la maladie. Ce modèle permet aux chercheurs de manipuler avec précision les bactéries intestinales uniques et d’observer leur effet sur les embryons transparents de poisson-zèbre.Il fournit des informations précieuses sur le rôle des microbes intestinaux dans l’héritage de la maladie. À l’avenir, nos recherches se concentreront principalement sur l’établissement d’un modèle de poisson-zèbre exempt de germes pour l’ensemble du cycle de vie afin de mieux comprendre la fonction du microbiome intestinal.

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