Test de complémentation basé sur Escherichia coli pour étudier la fonction chaperonne de la protéine de choc thermique 70
8 mars 2024
Ce protocole démontre l’activité chaperonne de la protéine de choc thermique 70 (Hsp70). Les cellules E. coli dnaK756 servent de modèle pour le test car elles hébergent un Hsp70 natif et fonctionnellement altéré, ce qui les rend sensibles au stress thermique. L’introduction hétérologue de Hsp70 fonctionnel sauve le déficit de croissance des cellules.
J’étudie le rôle des protéines de choc thermique dans l’octroi d’une protection statique future aux antigènes qui causent des infections humaines telles que le paludisme et la tuberculose. Mes recherches portent essentiellement sur la structure et les caractéristiques fonctionnelles de la machinerie des protéines de choc thermique de ces agents pathogènes qui causent des infections humaines. Les protéines de coup de chaleur sont généralement très conceptuelles, mais elles présentent un certain niveau de spécialisation fonctionnelle.
De plus, ils sont impliqués dans la résistance aux médicaments. En tant que tel, des efforts sont en cours pour les cibler afin d’inverser la résistance aux médicaments dans divers modèles de maladies. Ils comprennent des techniques biochimiques, biophysiques, bioinformatiques et de biologie cellulaire.
En d’autres termes, divers domaines techniques sont utilisés pour étudier les rôles de ces protéines. Dans notre cas, l’étude des protéines de Plasmodium était le principal agent du paludisme et qu’elles sont difficiles à produire, ce qui limite la capacité d’étudier ces protéines. Par exemple, il est difficile de générer des niveaux suffisants pour cristalliser et imager les protéines.
Nous avons établi certains des réseaux fonctionnels de ces protéines chez le parasite du paludisme. Nous avons également mis au point des tests pour étudier les composés ciblant ces protéines dans les agents responsables du paludisme et de la tuberculose. Le protocole actuel est utilisé pour explorer le rôle de repliement de la protéine chaperonne puis la fonction cytoprotectrice de HSP 70 en utilisant equal comme modèle. Le protocole pourrait également être adopté pour le criblage de petites molécules inhibitrices ciblant la protéine 70.
Aperçu
Ce protocole démontre l'activité de chaperon de la protéine de choc thermique 70 (Hsp70) en utilisant des cellules E. coli dnaK756. Ces cellules possèdent une Hsp70 native fonctionnellement altérée, ce qui les rend sensibles au stress thermique, et l'introduction d'une Hsp70 fonctionnelle corrige leur déficience de croissance.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biochimie
Contexte
- Les protéines de choc thermique jouent un rôle essentiel dans les réponses cellulaires au stress.
- La protéine Hsp70 est connue pour son activité de chaperon, qui assiste le repliement et la protection des protéines.
- Un dysfonctionnement de la Hsp70 peut entraîner une susceptibilité accrue au stress.
- La compréhension de la fonction de la Hsp70 peut guider des stratégies thérapeutiques contre certaines maladies.
Objectif de l'étude
- Étudier l'activité de chaperon de la Hsp70.
- Évaluer l'impact de la protéine Hsp70 fonctionnelle sur les cellules d'E. coli soumises à un stress thermique.
- Fournir des informations sur le rôle des protéines de choc thermique dans la protection cellulaire.
Méthodes utilisées
- Utilisation de cellules E. coli dnaK756 comme organisme modèle.
- Introduction hétérologue d'une protéine Hsp70 fonctionnelle.
- Évaluation de la reprise de croissance en conditions de stress thermique.
- Analyse des réponses cellulaires au stress.
Résultats principaux
- La protéine Hsp70 fonctionnelle corrige avec succès le déficit de croissance chez les cellules E. coli dnaK756.
- Les protéines de choc thermique sont essentielles à la survie en conditions de stress.
- A démontré l'importance de l'activité de chaperon dans la protection cellulaire.
- A fourni un modèle pour l'étude des fonctions des protéines de choc thermique.
Conclusions
- La protéine Hsp70 joue un rôle crucial dans la protection des cellules contre le stress thermique.
- Une Hsp70 fonctionnelle peut inverser les effets néfastes d'une activité de chaperon altérée.
- Les connaissances acquises peuvent contribuer à des stratégies thérapeutiques ciblant les protéines de choc thermique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les tests d'activité chaperon à l'aide de cellules E. coli dnaK756 permettent d'éliminer les risques mécanistiques liés aux interventions ciblant Hsp70 dès les premières étapes de la découverte de médicaments. Cette plateforme de complémentation offre une prédiction fiable pour la validation de cibles et facilite le tri des projets en distinguant le sauvetage fonctionnel des variants non fonctionnels dans des conditions de stress. Cette approche est directement pertinente pour évaluer les modulateurs de petites molécules et les produits biologiques ciblant les systèmes chaperons conservés, impliqués dans la survie des pathogènes et la résistance aux médicaments.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation fonctionnelle d'orthologues et de mutants de Hsp70 dans un contexte cellulaire contrôlé.
- Facilite la réduction des risques biologiques en distinguant les variants de chaperon actifs de ceux qui sont inactifs sous stress thermique.
- Permet une évaluation prédictive de la liaison au site cible et de la pertinence mécanistique dans le cadre de stratégies anti-infectieuses.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système cellulaire validé pour l'analyse de petits inhibiteurs moléculaires ou activateurs de la fonction de Hsp70.
- Fournit des mesures quantitatives et reproductibles de la croissance permettant la standardisation des tests et leur évolutivité ultérieure.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur la protéostasie médiée par les chaperonnes dans un organisme modèle.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les mécanismes pertinents pour la maladie chez les agents pathogènes où la Hsp70 est impliquée dans la résistance aux médicaments.
- Permet une continuité translationnelle en modélisant la fonction des chaperonnes à travers les espèces par expression hétérologue.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque pour les candidats thérapeutiques ciblant la Hsp70.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cet essai de complémentation s'inscrit dans les phases précoces de la découverte et de la validation de cibles, faisant le lien entre les études mécanistiques et l'identification de composés candidats pour les programmes ciblant les chaperonnes.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses sur la fonction des chaperonnes et leur implication dans les voies de réponse au stress cellulaire.
- Écrantage : Assure la prêts-à-l'emploi et la reproductibilité des tests pour l'évaluation de composés ciblant la Hsp70.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de la croissance et de l'expression protéique afin de comparer les effets de variants ou de composés.
- Recherche translationnelle : Modélise des mécanismes conservés des chaperonnes, pertinents pour la biologie des pathogènes et la résistance aux médicaments.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour la validation fonctionnelle de divers orthologues de la Hsp70 et de variants conçus.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles de la Hsp70 et réduit l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des tests cellulaires standardisés, évolutifs et reproductibles utilisables dans différents programmes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en permettant un tri fonctionnel précoce.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des actifs ciblant les chaperonnes dans les portefeuilles de maladies infectieuses et de résistance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en clonage moléculaire, en génétique bactérienne et en analyse de l'expression protéique.
- Suppose un accès à des équipements standards de microbiologie, d'électrophorèse et de détection immunologique.
- Exige une standardisation interéquipes des conditions d'essai et des lectures pour assurer la reproductibilité.
- Adaptable à différents orthologues de Hsp70 ou à des variants conçus pour des études comparatives.
- Limité aux modèles cellulaires et peut nécessiter une validation orthogonale dans des systèmes plus complexes pour des applications translationnelles.
