Name: Modèle de greffe de foie entier auxiliaire hétérotopique utilisant une hépaticourétérostomie pour des études de rejet d’allogreffe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez un modèle de greffe hétérotopique du foie chez le rat pour étudier le rejet d'allogreffe hépatique. Cette méthode réduit la complexité chirurgicale et le stress animal par rapport à la transplantation orthotopique.

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<meta charset="utf8"></head><body>Transplantation hépatique chez le rat et analyse de la perméabilité de l’allogreffe

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<li>Schleimer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+liver+transplantation+with+flow-regulated+portal+vein+arterialization+offers+a+successful+therapeutic+option+in+acute+hepatic+failure--investigations+in+heterotopic+auxiliary+rat+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Auxiliary liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization offers a successful therapeutic option in acute hepatic failure--investigations in heterotopic auxiliary rat liver transplantation.</a> Transpl Int. 19 (7), 581-588 (2006).</li>
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<li>Li, J., Ren, J., Zhang, J., Meng, X. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+kidney-sparing+portal+vein+arterialization+model+of+heterotopic+auxiliary+liver+transplantation+increases+liver+IL-6%2C+TNF-%CE%B1%2C+and+HGF+levels+and+enhances+liver+regeneration%3A+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified kidney-sparing portal vein arterialization model of heterotopic auxiliary liver transplantation increases liver IL-6, TNF-α, and HGF levels and enhances liver regeneration: an animal model.</a> BMC Surg. 2, 281-292 (2022).</li>
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<li>Levitsky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+rejection+increases+risk+of+graft+failure+and+death+in+recent+liver+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Acute rejection increases risk of graft failure and death in recent liver transplant recipients.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 15 (4), 584-593 (2017).</li>
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<li>Nasralla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+trial+of+normothermic+preservation+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation.</a> Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).</li>
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<li>Kageyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+Injury+in+allogeneic+liver+transplantation%3A+A+role+of+CD4+T+cells+in+early+allograft+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury.</a> Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).</li>
<li>Oldani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+short-term+machine+perfusion+on+the+risk+of+cancer+recurrence+after+rat+liver+transplantation+with+donors+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death.</a> PLoS One. 14 (11), e0224890(2019).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>3-0 Suture en soie</td><td>Éthicon</td><td>C013D</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Cravates en soie</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Cravates en soie</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Cravates en soie</td><td>Téléflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Suture en polyamide</td><td>AROSurgique</td><td>T05A09N10-13</td><td>Noir</td></tr><tr><td>Cautère bipolaire</td><td>Codman & Shurtleff Inc.</td><td>P.H. 234</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine HCL</td><td>Hospira</td><td>409201232</td><td></td></tr><tr><td>Pince Adson-Brown</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11627-12</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Pince coudée Dumont&nbsp ;</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11253-25</td><td>Médical #5/45 11 cm</td></tr><tr><td>Pinces, attache de sutures&nbsp ;</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18025-10</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Héparine sodique injectable, USB</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504015</td><td>10 000 unités USP par 10 mL</td></tr><tr><td>Canule d’hydrodissection</td><td>Ambler Chirurgical</td><td>N° 1021E</td><td>27 grammes</td></tr><tr><td>L’isoflurane</td><td>Dechra Vet. Produits</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter IV</td><td>Kendall</td><td>2619PUR</td><td>26 g x 3/4 po</td></tr><tr><td>Système de rétraction magnétique</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pinces</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18055-05</td><td>6 millimètre</td></tr><tr><td>Micro-pinces</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18055-06</td><td>4 millimètre</td></tr><tr><td>Applicateur Micro Clamp</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18057-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Micro porte-aiguille</td><td>S& T</td><td>C-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Universel S3</td><td>Double tête</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Puralube</td><td>14590500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polyimidi</td><td>Cole Parmer</td><td>95820-04</td><td>OD 0.0215 », ID 0.0195 », mur 0.0010 »</td></tr><tr><td>Salin</td><td>Baxter</td><td>281324</td><td>Chlorure de sodium à 0,9 %</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux à ressort</td><td>S& T</td><td>SDC-15</td><td>Émoussé 14 cm</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux à ressort</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15021-15</td><td>Vannas 14 cm</td></tr></tbody></table>

modèle de greffe de foie entier auxiliaire hétérotopique utilisant une hépaticourétérostomie pour des études de rejet d’allogreffe

Heterotopic Auxiliary Whole Liver Rat Transplant Model Utilizing a Hepaticoureterostomy for Allograft Rejection Studies

À l’heure actuelle, 29 paires de rats ont été utilisées pour établir le protocole HALT-PVA, 17 greffes syngéniques et 12 greffes allogéniques. Les foies transplantés syngéniques ont survécu jusqu’à leur point final expérimental désigné de 8 ou 30 jours avec un taux de réussite de 70 %, tandis que les foies transplantés allogéniques ont survécu jusqu’à leurs critères d’évaluation désignés de 3 ou 8 jours avec un taux de réussite de 50 %. Les échecs comprennent les rats qui sont morts à cause de complications chirurgicales et les foies auxiliaires qui ont échoué même lorsque le receveur a survécu.
La durée moyenne de l’opération était de 130 min, avec un temps d’ischémie froide d’environ 35 min et un temps d’ischémie chaude de moins de 25 min. À condition qu’il n’y ait pas de complications peropératoires, les receveurs se sont réveillés et sont devenus actifs dans les 10 à 20 minutes, ont commencé à boire et à se promener dans les 1 h et 24 h plus tard, ils se sont comportés comme des rats normaux et en bonne santé.
Les greffes hépatiques syngéniques ont montré une excellente couleur et une perméabilité des voies biliaires 30 jours après la greffe (Figure 3), tandis que l’histologie de l’hématoxyline et de l’éosine (H&amp;E) a montré une structure hépatocytaire normale sans altérations parenchymateuses significatives aux points de temps de 8 jours et de 30 jours (Figure 4A,B). Après seulement 3 jours, l’histologie des greffes allogéniques a montré une inflammation portale significative (Figure 4C), tandis que les greffons allogéniques de 8 jours ont montré un rejet cellulaire aigu avec une infiltration lymphoïde étendue (Figure 4D).
Des échantillons représentatifs de LTx allogéniques et syngéniques ont été évalués par un pathologiste hépatique certifié, et le rejet a été noté à l’aide de l’indice d’activité de rejet (RAI) du schéma de Banff12. L’évaluation pathologique a révélé qu’il n’y avait pas de rejet, avec un RAI de Banff de 0, dans les greffes syngéniques de 8 jours et de 30 jours, tandis que les allogreffes de 8 jours ont été sévèrement rejetées avec un score RAI de Banff de 9 (tableau 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de principe de la procédure HALT-PVA pour rats. Le PV est artérialisé avec l’artère rénale gauche à l’aide d’un stent, l’IHVC est anastomosé d’un bout à l’autre de la veine rénale gauche et le canal biliaire est fixé à l’uretère à l’aide d’un stent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig02.jpg"> 
Figure 2 : Intervention chirurgicale. (A) Hydro-dissection de PV. Dissociez le PV du tissu conjonctif environnant à l’aide d’une aiguille d’hydro-dissection de 27 G. (B) Insertion d’une endoprothèse artérielle. L’endoprothèse artérielle est insérée dans une petite ouverture en forme d’entonnoir pratiquée dans la fourche de la bifurcation de l’artère rénale. (C) Élargissement de la veine rénale. Afin de correspondre à la plus grande largeur de l’IHVC du donneur pour l’anastomose, une petite incision dans la bouche de poisson est pratiquée dans la face de la veine rénale du receveur après la mise en place de deux sutures de séjour. (D) Greffe de foie perfusée immédiatement après l’anastomose. Le positionnement de l’artère rénale et de la connexion PV sous la veine rénale et l’IHVC est crucial pour prévenir la thrombose du greffon. (E) Rat HALT-PVA in situ. Le foie auxiliaire est positionné contre la paroi gauche de l’abdomen avant de retourner dans les intestins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig03.jpg"> 
Figure 3 : HALT-PVA syngénique 30 jours après la greffe. (A) Après 30 jours, le foie auxiliaire a une couleur et une texture similaires à celles du foie natif, tandis que (B) le canal biliaire et le stent PV restent persistants et sans restriction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig04.jpg"> 
Figure 4 : Histologie des greffes hépatiques auxiliaires. Coloration H&amp;E de greffons syngéniques (A) de 8 jours et (B) de 30 jours après la greffe présentant une structure hépatocytaire normale ainsi que de greffons allogéniques de 3 jours et de 8 jours présentant une inflammation portale et une infiltration lymphocytaire. Barre d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tx allogéniques</td>
			<td>Inflammation portale</td>
			<td>Lésion des voies biliaires</td>
			<td>Inflammation endoveineuse</td>
			<td>Banff RAI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 jours (LT-34)</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 jours (LT-38)</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 jours (LT-20)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 jours (LT-40)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tx Syngeneic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 jours (LT-13)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 jours (LT-19)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 jours (LT-28)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 jours (LT-32)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Schéma de Banff. Indice d’activité de rejet (IRA) des LTx de rat allogéniques et syngéniques.

Modèle de greffe de foie entier auxiliaire hétérotopique utilisant une hépaticourétérostomie pour des études de rejet d’allogreffe

Small animal transplant models are indispensable for organ tolerance studies investigating feasible therapeutic interventions in preclinical studies. Rat ...

Le champ principal de notre recherche est d’étudier les mécanismes à l’origine de la tolérance immunologique après une transplantation hépatique. Nous étudions ensuite des méthodes pour réduire le rejet hépatique et améliorer la survie des receveurs de greffe hépatique.L’étape la plus difficile de cette procédure de transplantation hétérotopique est l’anastomose de bout en bout de la veine cave hépatique inférieure à la veine rénale. Par conséquent, toute personne à l’aise pour effectuer une anastomose de bout en bout d’une veine de 3 millimètres par n’importe quelle méthode possède toutes les compétences techniques nécessaires pour effectuer cette procédure.Les modèles de greffe orthotopique de foie de rat sont des opérations techniquement difficiles qui sont compliquées par de longs temps d’anhépathie et d’ischémie du bas du corps, ce qui rend la récupération difficile pour l’animal receveur. Le modèle de greffe hépatique hétérotopique présenté ici élimine ces complications. Et il ne nécessite pas de compétences microchirurgicales avancées. La récupération rapide du receveur, en l’absence de temps d’ischémie anhépatique ou du bas du corps, est un avantage significatif de la transplantation hépatique de rat hétérotopique par rapport à la transplantation hépatique orthotopique. De plus, l’étude du rejet après une transplantation hépatique orthotopique repose souvent sur la morbidité ou le décès comme critère expérimental, ce qui n’est pas le cas avec ce modèle hétérotopique.La perfusion hépatique normémique ex vivo est une nouvelle stratégie intéressante pour stocker les foies avant la transplantation clinique. Cependant, les modèles animaux de petite taille font défaut en raison de la forte exigence technique de préparation d’un foie pour la transplantation après perfusion normothermique. Par conséquent, notre objectif est d’utiliser notre modèle de transplantation hépatique hétérotopique pour transplanter avec succès des foies après perfusion normothermique de manière fiable et reproductible.[Narrateur] Après avoir rasé et désinfecté l’abdomen, placez le rat donneur anesthésié en position couchée sur un tampon chirurgical chauffé. Lors de l’incision longitudinale, utilisez des cotons-tiges humides pour rétracter soigneusement le foie et disséquer les ligaments falciformes, triangulaires, hépatogastriques et hépatoduodénaux. Cautériser les vaisseaux para-œsophagiens à l’aide d’une pince bipolaire et diviser davantage entre le lobe latéral gauche et le lobe caudé antérieur. À l’aide d’une pince coudée ou d’un porte-aiguille, disséquez derrière la veine cave sus-hépatique inférieure au diaphragme. Ensuite, passez une suture en soie 5-0 sous la veine cave sus-hépatique et faites un double nœud sans serrer pour une utilisation ultérieure. Isolez la veine cave infrahépatique du tissu rétropéritonéal jusqu’à la veine rénale droite. Ensuite, ligaturez la veine surrénale droite avec une suture en soie 6-0 aussi près que possible de la veine cave infrahépatique. À l’aide d’une aiguille d’hydrodissection de calibre 27, dissociez la veine porte du tissu conjonctif environnant. Séparez la veine porte des veines pylorique et splénique en les ligaturant et en les divisant avec une suture en soie 7-0. Après isolement de l’artère hépatique commune, ligaturée avec une suture en soie 6-0, et divisez l’artère près de l’endroit où elle passe sous la veine porte. Librez le canal biliaire avec une suture en soie 5-0 au niveau de la ramification de l’artère gastroduodénale, assurant la préservation du tissu adipeux autour du canal biliaire. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une petite incision dans la paroi du canal biliaire à proximité de la ligature. Insérez un stent en tube de polyamide dans la lumière du canal biliaire et fixez-le avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue pour une utilisation ultérieure. Coupez entre les ligatures 5-0 et 6-0 pour diviser le canal biliaire. Marquez la face supérieure de la veine cave infrahépatique et de la veine porte avec un stylo à colorant chirurgical pour aider à l’alignement des vaisseaux pendant l’anastomose. Fixez ensuite la veine porte à l’aide d’une pince à microvaisseaux aussi distale que possible par rapport au foie. Insérez une seringue de 20 millilitres avec une aiguille de calibre 26 dans la veine porte proximale à la pince et perfuser le foie avec 10 à 15 millilitres de sérum physiologique hépariné glacé, en divisant simultanément la veine cave infrahépatique à l’aide de ciseaux à ressort aussi près que possible de la veine rénale droite. Pour exciser le foie, disséquez la veine porte proximale à la micropince. Serrez ensuite la suture 5-0 précédemment placée autour de la veine cave suprahépatique et disséquez le diaphragme pour transecter la veine cave intrathoracique. Continuez à disséquer les ligaments restants à l’arrière du foie et divisez la veine surrénale précédemment ligaturée. Placez le foie excisé dans une solution saline froide sur de la glace. Après avoir rasé et désinfecté l’abdomen, placez le rat receveur anesthésié en position couchée sur un tampon chirurgical chauffé. Lors de l’incision longitudinale, utilisez des cotons-tiges humides pour rétracter les intestins vers le côté droit de l’abdomen et couvrez-les de gaze humidifiée. Appliquez de la gaze humide supplémentaire pour couvrir l’estomac, la rate et le foie, en exposant les reins et les vaisseaux rénaux gauches. À l’aide d’une aiguille d’hydrodissection de calibre 27 et d’une pince à pointe émoussée, séparez la veine rénale gauche de l’artère rénale, en retirant soigneusement la graisse et le tissu conjonctif des deux vaisseaux. À l’aide d’une pince bipolaire, cautériser toutes les micro-branches latérales, en isolant la veine rénale et l’artère entre l’aorte ou la veine cave et le rein. Après avoir isolé les veines gonadiques et surrénales, utilisez de la soie 6-0 pour les ligaturer temporairement à proximité de la veine rénale. Mobilisation de l’uretère au pôle inférieur et ligature avec une suture en soie 6-0. Clampez d’abord l’artère rénale, puis la veine rénale, avec une pince de microvaisseaux aussi près que possible de l’aorte et de la veine cave. Transectez l’artère rénale à l’aide de ciseaux à ressort juste après la bifurcation du vaisseau et divisez la veine rénale à mi-chemin entre la veine cave et le rein. Mobilisez le rein gauche du tissu conjonctif environnant et retirez-le. Rincer les moignons de l’artère rénale et de la veine rénale avec une solution saline héparinisée pour éliminer tout le sang restant. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une petite entaille dans la fourche de la bifurcation de l’artère rénale pour créer une ouverture en forme d’entonnoir. Ensuite, insérez un stent de 8 millimètres coupé dans un cathéter de calibre 26 et fixez-le avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue. Introduisez le foie du donneur et placez-le avec la veine porte, la veine cave infrahépatique et le canal biliaire face à la veine rénale et à l’artère gauche du receveur. À l’aide d’une suture en nylon 9-0, deux sutures de maintien ont été installées de part et d’autre de la connexion de la veine cave rénale infrahépatique. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort pour faire une petite incision en forme de bouche de poisson dans la face de la veine rénale jusqu’à ce que la largeur corresponde à la veine porte infrahépatique du donneur. Avec une suture en soie 9-0, anastomose la veine porte hépatique infrahépatique d’un bout à l’autre de la veine rénale avec neuf ou 10 sutures courantes sur les parois avant et arrière du vaisseau. Confirmez que l’artère rénale est placée sous la veine porte infrahépatique. Insérez ensuite le stent précédemment placé dans l’artère rénale dans la veine porte du foie et fixez-le avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue pour s’attacher au fil opposé sur l’artère. Rassemblez les extrémités pour empêcher chacune de glisser de l’endoprothèse. Séquentiellement, retirez les microclamps de la veine rénale, puis de l’artère rénale. Pendant la reperfusion hépatique, utilisez de la gaze et des cotons-tiges pour appliquer une légère pression autour de la région de l’anastomose jusqu’à ce qu’une anastomose sans fuite soit obtenue. Retirez les ligatures temporaires précédemment placées sur les veines surrénales et gonadiques. Mobilisez soigneusement environ 10 millimètres à l’extrémité de l’uretère gauche à partir du tissu conjonctif environnant, en laissant une quantité importante de tissu adipeux attaché. Avec des ciseaux à ressort, faites une petite incision dans la paroi de l’uretère proximal à la ligature 6-0 précédemment placée. Insérez le stent en polyamide préalablement fixé au canal biliaire dans la petite incision pratiquée dans la paroi de l’uretère. Fixez le stent avec une suture en soie 6-0 et attachez une extrémité avec le long fil du côté du canal biliaire du stent, en rapprochant fermement les deux extrémités. Remettez les intestins dans leur position naturelle et irriguez avec deux à 3 millilitres de solution saline. Enfin, fermez l’abdomen en couches. À partir du deuxième jour suivant l’opération, injecter quotidiennement de l’héparine par voie sous-cutanée aux receveurs d’une allogreffe. 30 jours après la greffe, les greffes de foie syngéniques ont montré une couleur et une perméabilité des voies biliaires optimales. L’histologie de l’hématoxyline et de l’éosine a montré une structure hépatocytaire normale sans altérations parenchymateuses significatives à des intervalles de 8 jours et de 30 jours. À l’inverse, les allogreffes ont montré une inflammation portale significative dès 3 jours après la greffe, et un rejet cellulaire aigu caractérisé par une infiltration lymphoïde étendue au bout de 8 jours.

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