Name: Motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez comment créer des motifs protéiques réversibles sur membranes lipidiques artificielles en utilisant la protéine photosensible iLID et la lumière bleue. Cette méthode permet un contrôle spatiotemporel précis des processus cellulaires.

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Ce travail a été financé par le Conseil européen de la recherche ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). La DDI remercie la Fondation Alexander von Humboldt pour une bourse postdoctorale.

1. Préparation expérimentale
<ol><li>Exprimer et purifier le biotinylated-disiLID (b-disiLID) et le mOrange-Nano (voir le tableau des matériaux) en suivant les procédures précédemment rapportées 7,8.</li>
	<li>Préparez des mélanges de lipides dans des flacons en verre avec la composition et les concentrations de lipides sélectionnées. Tout d’abord, dissoudre les lipides dans le chloroforme pour obtenir une solution lipidique finale avec une concentration de 1 mg/mL.<ol><li>Mélanger les lipides afin d’obtenir une composition de 94,9 % molaire de sel sodique de 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), de 5 % molaire de sel de sodium 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamineN-(cap biotinyl) (DOPE-biotine) et de 0,1 % molaire de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Le mélange lipidique peut être ajusté avec des rapports variables et une concentration DOPE-biotine et/ou différents colorants membranaires. La concentration recommandée de DOPE-biotine (5 % molaire) permet la formation d’une couche de streptavidine à haute densité (SAv) dans les étapes suivantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez de petites vésicules unilamellaires (SUV) en suivant les méthodes précédemment rapportées 7,8,12. Pour cette étape, il est recommandé de préparer des SUV d’un diamètre ≤100 nm.</li>
	<li>Pour cette étude, la méthode de sonication est utilisée. Tout d’abord, évaporez la solution de chloroforme dans le flacon en verre avec un flux d’azote tout en faisant tourner les flacons afin de former une fine pellicule lipidique. Ensuite, retirez le chloroforme résiduel pendant au moins 1 h sous vide.<ol><li>Réhydrater le film séché dans de l’eau ultrapure avec une concentration finale de 1 mg/mL de lipides par vortex. Enfin, sonicez la solution obtenue pendant 10 minutes jusqu’à ce que la solution opaque devienne claire. REMARQUE : Conservez le mélange de lipides dans un tube de microcentrifugation au réfrigérateur pendant un maximum de 2 semaines. Différentes méthodes de préparation des SUV (par exemple, la méthode d’extrusion) peuvent également être utilisées tant que la taille des SUV finaux est ≤ 100 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Recrutement de mOrange-Nano pour les SLB fonctionnalisés disiLID
<ol><li>Ajouter 150 μL de NaOH 2 M dans chaque puits de la chambre à fond de verre à 18 puits à μ-lames (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez le NaOH et lavez les puits 3 à 5 fois d’abord avec de l’eau ultrapure de 150 μL, puis 3 fois avec un tampon de 150 μL (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM de NaCl) contenant 10 mM de CaCl2.</li>
	<li>Ajouter 15 μL de SUV fraîchement préparés (concentration de stock de 1 mg/mL dans l’eau) dans les puits contenant 150 μL de tampon avec 10 mM de CaCl2 afin d’avoir environ un facteur 10 de dilution des SUV dans le tampon. Laissez les SUV incuber pendant 30 min à température ambiante. Après le temps d’incubation, des SLB-biotinylés se formeront.</li>
	<li>Lavez les SLB au moins 7 fois avec un tampon (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) sans CaCl2 en retirant d’abord la solution et en ajoutant ensuite un nouveau tampon à chaque étape. Il est recommandé d’utiliser 80 μL de tampon pour chaque étape de lavage. REMARQUE : Un lavage optimal des SLB est obtenu en pipetant la solution fraîche de haut en bas plusieurs fois sans toucher la surface. Le pipetage de la solution dans les puits contenant les SLB nouvellement formés doit être doux afin de réduire la formation de petites bulles d’air qui endommageraient les SLB formés. À partir de ce moment, les puits doivent contenir un volume suffisant de tampon afin d’éviter le dessèchement des SLB.</li>
	<li>Pour la fonctionnalisation ultérieure des SLB biotinylés avec SAv, ajouter une solution de SAv à une concentration finale de 250 nM et incuber pendant 30 min à température ambiante. Par la suite, éliminez l’excès de SAv en le lavant avec un tampon (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) au moins 5 fois.</li>
	<li>À partir de ce moment, conservez les échantillons sous une lumière rouge protectrice afin d’éviter la photoactivation indésirable de protéines photocommutables. Ajouter b-disiILD (voir tableau des matériaux) à une concentration finale de 1 μM dans le puits. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, éliminez l’excès de protéines en les lavant au moins 5 fois avec un tampon.</li>
	<li>Ajouter mOrange-Nano (voir tableau des matériaux) à une concentration finale de 200 nM et maintenir l’échantillon dans l’obscurité en le recouvrant d’une feuille d’aluminium.</li>
	<li>Placez la lame μ sous le microscope à fluorescence et ajustez les paramètres d’imagerie. Réglez le laser 552 nm pour l’excitation de mOrange-Nano. Ajustez la plage d’émission pour optimiser le signal mOrange. La photoactivation de disiLID est réalisée à l’aide d’un laser de 488 nm, à l’aide d’impulsions lumineuses espacées de 2,58 s.</li>
</ol>3. Préparation des GUV
<ol><li>Préparer une solution à 5 % (p/v) d’alcool polyvinylique (PVA, voir tableau des matières) (MW : 145 000 g/mol) avec 100 mM de saccharose dans de l’eau ultrapure, en mélangeant pendant une nuit à 80 °C à 400 tr/min.</li>
	<li>Préparer une solution lipidique dans du chloroforme avec la composition souhaitée (concentration finale 10 mg/mL). Pour cette méthode, il est recommandé d’utiliser une composition composée de 10 mg/mL de POPC, de 10 % molaires de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (POPG), de 2 % molaires de DOPE-biotine et de 1 % molaire de DiD (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparez les GUV avec la technique d’hydratation 7,8. Tout d’abord, étalez 40 μL de la solution de PVA préparée sous la forme d’une couche mince homogène sur une lame de verre de 60 mm x 24 mm, de préférence à l’aide d’une pointe de pipette. Ensuite, séchez la fine couche à 50 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Étaler 5 μL de la solution lipidique à l’aide d’une aiguille sur la couche de PVA et laisser sécher à 30 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Assemblez une chambre sur la lame de verre fonctionnalisée à l’aide d’une entretoise (~40 mm × 24 mm × 2 mm, voir tableau des matériaux) et d’une seconde lame de verre.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de réhydratation (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) dans la chambre pendant 1 h à température ambiante pour former des GUV. Après 1 h, retournez la chambre et tapotez doucement sur les surfaces en verre avec une pointe de pipette.</li>
	<li>Retirez délicatement la lame de verre d’un côté pour ouvrir la chambre construite et récoltez les GUV à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Placez la solution dans un tube en plastique et laissez les GUVs se déstabiliser pendant 2 h.</li>
</ol>4. Recrutement de mOrange-Nano pour les GUVs fonctionnalisés disiLID
<ol><li>Ajoutez une solution de SAv aux GUVs fraîchement récoltés et laissez reposer pendant 30 min à température ambiante. REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées avec une lumière rouge de protection afin d’éviter la photoactivation du disiLID.</li>
	<li>Ajouter 1 μM de b-disiLID à la solution de GUVs et placer l’échantillon pendant 30 min dans l’obscurité, en le recouvrant d’une feuille d’aluminium.</li>
	<li>Prétraiter une chambre à fond en verre de 18 puits à μ lames avec une solution BSA de 150 μL (3 % p/v dans l’eau) pendant 10 min. Ensuite, retirez la solution BSA et lavez les puits avec de l’eau ultrapure de 150 μL 3 fois.</li>
	<li>Ajouter 145 μL de tampon 200 nM mOrange-Nano (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) dans le puits.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 5 μL de GUVs décorés de b-disiLID à la solution et attendez ~15 min pour que les GUVs se déposent.</li>
	<li>Placez la lame μ sous le microscope confocal. Excité l’échantillon à 552 nm pour visualiser la fluorescence mOrange (λex = 557 nm ; λem = 576 nm) et à 638 nm pour visualiser DiD (λex = 644 nm ; λem = 665 nm) dans les membranes GUV. Le recrutement mOrange-Nano est déclenché par des impulsions de lumière bleue (488 nm, intensité 1%) toutes les 5,3 s afin de minimiser les effets indésirables de photoblanchiment. REMARQUE : Les longueurs d’onde d’excitation peuvent être adaptées en fonction du type de microscope utilisé. D’autres longueurs d’onde d’excitation courantes disponibles pour les microscopes sont également les lasers de 532 nm ou 561 nm et de 633 nm, 647 nm, 639 nm ou 640 nm.</li>
</ol>

Structuration de protéines réversibles contrôlées par la lumière sur des membranes lipidiques

<ol><li>Kretschmer, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+on+membranes+and+its+role+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division.</a> Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).</li>
<li>Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+excitable+Cdc42+signals+steer+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis.</a> Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).</li>
<li>Caldwell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+control+of+protein+localization+and+activity+within+cell-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments.</a> Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).</li>
<li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li>
<li>Bartelt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+blue+light-switchable+protein+patterns+on+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles.</a> Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).</li>
<li>Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disordered+tether+to+iLID+improves+photoswitchable+protein+patterning+on+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes.</a> Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).</li>
<li>Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+blue+light+inducible+Spytag+system+%28BLISS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS).</a> J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).</li>
<li>Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+light+lithography%3A+a+general+strategy+to+create+active+protein+and+cell+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Horiz%22%5BJournal%5D)">Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns.</a> Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+printing+of+protein+structures+on+membranes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro.</a> Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).</li>
<li>Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+Multivalent+Binding+of+influenza+hemagglutinin+nanoparticles+at+a+sialoglycan-functionalized+supported+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer.</a> ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).</li>
<li>Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMN+binding+and+photochemical+properties+of+plant+putative+photoreceptors+containing+two+LOV+domains%2C+LOV%2FLOV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit une méthode de recrutement localisé de protéines mOrange-Nano sur des membranes modèles, telles que la bicouche lipidique supportée et les vésicules unilamellaires géantes, en utilisant la protéine photocommutable disiLID8. Les aspects qui contribuent à la qualité du motif comprennent la qualité des protéines ainsi que la bonne qualité des SLB et des GUV.
Pour garantir une bonne qualité protéique après expression et purification, il est important d’évaluer d’abord les propriétés photocommutables du disiLID. Pour ce faire, l’absorption du cofacteur FMN doit être mesurée dans l’obscurité et après un éclairage à lumière bleue. On s’attend à ce que les spectres UV-Vis de disiLID montrent le triple pic caractéristique du cofacteur FMN dans l’obscurité, qui diminue considérablement à l’éclairage de la lumière bleue et se rétablit dans l’obscurité13. Ce comportement photocommutable est crucial pour obtenir un recrutement reproductible et réversible dans les étapes suivantes. Travailler avec une lumière rouge protectrice et exposer disiLID à un éclairage externe minimal pendant la préparation des échantillons augmente les performances des expériences.
Une autre étape critique, et peut-être la plus cruciale, est la formation de SLB appropriés. Les défauts dans les membranes et/ou la formation de SLB non homogènes (c’est-à-dire la présence de multicouches ou de SLB patchés) affecteront la qualité de la structuration des protéines. Par conséquent, pour les utilisateurs inexpérimentés, il est recommandé de reproduire le protocole en marquant les SUV avec des colorants membranaires, tels que DiD et DiO, afin de former des SLB marqués par fluorescence. De cette façon, les propriétés et la qualité des SLB peuvent être bien caractérisées avec la microscopie à fluorescence. Les mesures FRAP représentent une approche typique pour évaluer la qualité d’un SLB en évaluant la fluidité des membranes. Par ailleurs, dans le cas des SLB biotinylés tels que ceux décrits dans le présent protocole, des SAv marqués par fluorescence (par exemple, Atto 488-SAv) peuvent être utilisés pour visualiser et évaluer la qualité des SLB.
La première partie du protocole décrit la formation de motifs sur les SLB. Pour garantir un résultat optimal, il est important d’ajouter mOrange-Nano sur les SLB et de laisser l’échantillon incuber dans l’obscurité pendant 15 min. Lors de la photoactivation, la sélection du ROI n’est pas limitée à une taille spécifique. Cependant, l’intensité du laser et le temps d’exposition doivent être régulés afin de réduire le photoblanchiment indésirable des protéines fluorescentes.
Cette méthode n’est pas limitée aux protéines biotinylées, et d’autres approches peuvent être utilisées pour ancrer disiLID aux SLB. Par exemple, disiLID étiqueté His-tag peut être exprimé et ancré sur des SLB contenant du Ni-NTA. Cependant, il est crucial d’exprimer Nano et disiLID avec des marqueurs différents afin d’éviter le remplacement des protéines sur les SLB. Cette méthode permet également d’inverser l’ordre des protéines, fonctionnalisant ainsi les SLB avec Nano et recrutant des disiLID (ou des protéines fusionnées avec disiLID) lors d’un éclairage par lumière bleue.
Pour le contrôle dynamique de la localisation des protéines, la localisation réversible de la protéine dans la région sélectionnée devrait être possible de manière répétée. Pour y parvenir, la concentration de Nano (200 nM) dans la solution est un paramètre critique pour obtenir une réversibilité élevée.
Une autre préoccupation est le recrutement de Nano sur la surface GUV fonctionnalisée par disiLID. Comme dans le cas de la structuration des protéines sur les SLB, cette méthode peut être étendue à différentes stratégies de fonctionnalisation membranaire. Dans ce protocole, l’ensemble du GUV a été éclairé par une lumière bleue pour recruter mOrange-Nano sur toute la surface du GUV. Cependant, la sélection de petits ROIs localisés sur la membrane GUV devrait conduire à la localisation précise des protéines dans une zone plus restreinte.
Cette méthode ne présente qu’une limitation liée au choix du fluorophore utilisé pour l’imagerie du recrutement Nano au niveau de la membrane des SUV ou des GUVs. En particulier, les fluorophores avec un spectre d’excitation dans la gamme de la lumière bleue doivent être évités, car leur utilisation interférera avec la photoactivation de (dis)iLID. Par conséquent, le choix de fluorophores dans la gamme de la lumière verte ou rouge (par exemple, mOrange ou Cy5) est recommandé pour ce type d’expérience.
La conception disiLID offre un moyen simple et adaptable d’améliorer le recrutement local des protéines dans les membranes et élargit la gamme dynamique d’iLID et de Nano à partir de l’optogénétique4. Ces méthodes se concentrent sur le recrutement de Nano sur des membranes mimiques telles que les bicouches lipidiques et les GUV. Néanmoins, cette approche est extensible aux nombreux outils optogénétiques dans les cellules où (dis)iLID ou Nano sont liés à une membrane.

La formation de motifs protéiques sur les membranes cellulaires dans les régions subcellulaires donne lieu à de nombreux processus biologiques, notamment la migration, la division et la communication localisée de cellule à cellule 1,2. Ces modèles protéiques sont régulés dans l’espace et le temps, et sont très dynamiques. La réplication de ces modèles protéiques dans les cellules synthétiques est essentielle pour imiter les processus cellulaires qui en découlent et pour mieux comprendre comment une telle régulation fonctionne au niveau moléculaire. De manière analogue à ce qui est observé pour les membranes dans les cellules vivantes, les méthodes de génération de motifs protéiques sur des membranes artificielles doivent capturer leur dynamique et fournir un contrôle spatio-temporel précis.
Parmi les différents stimuli, la lumière se distingue par le contrôle spatio-temporel le plus élevé et plusieurs avantages supplémentaires3. Grâce à la régulation par la lumière, il est facile d’éclairer une zone souhaitée à n’importe quel moment avec une précision inégalée. De plus, la lumière offre une grande capacité de réglage car l’intensité lumineuse et la durée des impulsions peuvent être ajustées. De plus, la lumière visible est inoffensive pour les biomolécules, y compris les protéines, et il est même possible d’aborder plusieurs fonctionnalités avec différentes longueurs d’onde. Par conséquent, les approches sensibles à la lumière basées sur la lumière visible apparaissent comme des voies prometteuses pour la régulation contrôlée et biorthogonale des modèles protéiques dans l’espace et le temps 4,5,6. L’utilisation de paires de protéines photocommutables de l’optogénétique, agissant comme des dimériseurs inductibles par la lumière, fournit une méthode simple pour recruter des protéines spécifiques dans les membranes. En particulier, des motifs protéiques ont été formés avec succès sur des membranes artificielles en utilisant l’interaction déclenchée par la lumière bleue entre iLID (dimère amélioré inductible par la lumière, basé sur le domaine photocommutable LOV2 d’Avena sativa) et Nano (SspB de type sauvage)7,8, le système SpyTag inductible par la lumière bleue (BLISS)9, le tétramère protéique sensible à la lumière verte CarH10 et l’interaction induite par la lumière rouge entre PhyB et PIF611.
Il a été démontré que l’interaction photocommutable entre iLID et Nano5 peut être utilisée pour photo-modeler des protéines sur des membranes modèles en utilisant la lumière bleue7. L’interaction iLID/Nano est réversible dans l’obscurité, très spécifique et fonctionne dans des conditions physiologiques. L’ancrage d’iLID sur des modèles de membranes lipidiques, tels que les vésicules unilamellaires géantes (GUV) ou les bicouches lipidiques supportées (SLB), permet un recrutement de Nano régulé par la lumière sur ces membranes, ce qui est réversible dans l’obscurité. Notamment, nous avons observé que l’introduction d’un domaine désordonné dans l’extrémité N-terminale de l’iLID (résultant en une protéine nommée disiLID) en tant qu’attache à une membrane lipidique modèle améliore l’efficacité du recrutement Nano et la dynamique de réversion8.
En utilisant l’interaction disiLID/Nano, nous avons développé une méthode pour générer des motifs à contraste élevé de protéines d’intérêt nano-fusionnées (POI) sur les SLB et les membranes externes des GUV. Cette méthode permet de créer des motifs protéiques avec une résolution spatiale et temporelle remarquable et une réversibilité élevée en quelques minutes. Le protocole détaillé décrit le processus de recrutement local des protéines sur des membranes artificielles. Plus précisément, cela est réalisé en immobilisant une version biotinylée de disiLID sur des SLB et des GUVs par l’interaction biotine-streptavidine (SAv). Par la suite, des Nano marqués par fluorescence (mOrange-Nano) sont recrutés sur ces membranes fonctionnalisées disiLID sous éclairage par lumière bleue. Notre protocole expérimental offre une approche simple et adaptable pour réaliser un recrutement localisé de protéines dans les membranes. Il est important de noter que cette méthodologie ne se limite pas aux interfaces SLB et GUV rapportées ou à mOrange-Nano ; il peut être étendu à d’autres matériaux et protéines fonctionnalisés par disiLID fusionnés à Nano.

<table><tbody><tr><td>&micro ;-Slide 18 Well</td><td>Ibidi</td><td>81817</td><td>Pour la préparation SLB</td></tr><tr><td>25 &micro ; L Seringue d’un microlitre&nbsp ;</td><td>Hamilton</td><td>Modèle 702 N</td><td>Pour la préparation du mélange lipidique et l’étalement de la solution lipidique sur la couche PVA</td></tr><tr><td>Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sel de sodium)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C</td><td>Pour la préparation des SUV</td></tr><tr><td>CaCl2 (Chlorure de calcium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Pour la formation SLB</td></tr><tr><td>Couvercles 24 mm x 60 mm</td><td>Engelbrecht</td><td>K12460</td><td>Pour la formation de GUVs</td></tr><tr><td>DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tétraméthylindodicarbocyanine)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>D7757</td><td>Colorant membranaire</td></tr><tr><td>disiLID</td><td></td><td></td><td>Séquence : MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA / GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF</td></tr><tr><td>DOPC (1,2-di-(9Z-octadécenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td>Pour la composition lipidique des SUV</td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microtubes à centrifuger</td><td>Merk</td><td>EP0030108116-100EA</td><td>Pour la collecte de GUVs fraîchement préparés</td></tr><tr><td>mOrange-Nano</td><td></td><td></td><td>Séquence : MRGSHHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAlkgksalm FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAK lkvtkgg PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG</td></tr><tr><td>NaCl (chlorure de sodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Pour tampon</td></tr><tr><td>NaOH (hydroxyde de sodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064980500</td><td>Pour l’activation de surface dans la formation SLB</td></tr><tr><td>POPC (1-Palmitoyl-2- oléoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>Pour GUVs composition lipidique</td></tr><tr><td>PVA (alcool polyvinylique) entièrement hydrolysé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8148940101</td><td>Pour GUVs Formation</td></tr><tr><td>SP8 microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>TermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>84097</td><td>Pour la formation de GUVs</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Tris</td><td>Sigma-Aldrich 10812846001</td><td></td><td>Pour tampon</td></tr></tbody></table>

motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

La localisation et l’activation précises des protéines au niveau de la membrane cellulaire à un certain moment donnent lieu à de nombreux processus cellulaires, notamment la polarisation, la migration et la division cellulaires. Ainsi, les méthodes de recrutement de protéines pour modéliser des membranes avec une résolution subcellulaire et un contrôle temporel élevé sont essentielles lors de la reproduction et du contrôle de ces processus dans les cellules synthétiques. Ici, une méthode est décrite pour fabriquer des motifs protéiques réversibles régulés par la lumière au niveau des membranes lipidiques avec une grande précision spatio-temporelle. Pour ce faire, nous immobilisons la protéine photocommutable iLID (dimère inductible par la lumière amélioré) sur des bicouches lipidiques supportées (SLB) et sur la membrane externe de vésicules unilamellaires géantes (GUV). Lors de l’éclairage local par lumière bleue, iLID se lie à son partenaire Nano (SspB de type sauvage) et permet le recrutement de toute protéine d’intérêt (POI) fusionnée à Nano de la solution à la zone éclairée sur la membrane. Cette fixation est réversible dans l’obscurité, ce qui permet une liaison dynamique et une libération du POI. Dans l’ensemble, il s’agit d’une méthode flexible et polyvalente pour réguler la localisation des protéines avec une grande précision dans l’espace et le temps à l’aide de la lumière bleue.

Les procédures décrites permettent la formation de SLB pour recruter mOrange-Nano sur les membranes synthétiques. La figure 1A montre la formation de mOrange-Nano définis sur les SLB fonctionnalisés avec b-disiLID. Lorsqu’une région d’intérêt (ROI) carrée (24 μm × 24 μm) sur le SLB est éclairée par une lumière bleue de 488 nm, une augmentation rapide du signal de fluorescence est observée dans le canal mOrange (en rouge) dans le ROI en 200 s. Le motif montre des arêtes très définies et tranchantes (Figure 1B), indiquant un contrôle spatial élevé sur la zone photoactivée. L’interaction est rapide et entièrement réversible car l’éclairage à lumière bleue est interrompu. Cette méthode permet également la formation de motifs sur plusieurs cycles d’éclairage (Figure 2). Des cycles alternés de ~200 s de lumière bleue et de 200 s d’obscurité conduisent à un recrutement réversible de mOrange-Nano dans la zone sélectionnée plusieurs fois avec des valeurs comparables de Δ d’intensité de fluorescence dans les motifs.
La figure 3 montre la représentation schématique de la préparation des GUV. Le recrutement de mOrange-Nano est également observé sur les GUV. Il est montré que les GUV placés dans l’obscurité ne présentent pas de fluorescence mOrange (Figure 4A). Comme les GUV sont globalement éclairés par de la lumière bleue, une fluorescence mOrange est observée, colocalisant avec le colorant membranaire GUV (DiD). L’interaction est hautement réversible lorsque l’éclairage est terminé. La quantification de l’intensité de mOrange au niveau de la membrane GUV au cours du temps montre le recrutement rapide et efficace des protéines ainsi que la réversibilité complète (Figure 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig01.jpg"> Figure 1 : Images de microscopie à fluorescence de SLB fonctionnalisés avec b-disiLID. Les images de fluorescence en présence de mOrange-Nano avant (A) et pendant (B) l’illumination locale en lumière bleue (488 nm) dans le ROI. Barre d’échelle = 20 μm. (C) Intensité de fluorescence de mOrange mesurée dans le ROI pour les SLB fonctionnalisés avec b-disiLID (à = 200 s). La figure est adaptée de Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig02v3.jpg"> Figure 2 : Intensité de fluorescence de mOrange recrutée dans le ROI sur des SLB décorés de b-disiLID au cours de trois cycles de recrutement. Après chaque étape de photoactivation, la fluorescence mOrange-Nano a augmenté dans le ROI. Le motif atteint la saturation en 120 s, et la fluorescence diminue en 120 s, presque jusqu’aux niveaux de fond. Aucune perte de qualité du motif n’est observée sur les différents cycles de lumière bleue/obscurité. La figure est adaptée de Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig03v2.jpg"> Figure 3 : Représentation schématique de la préparation des GUVs à l’aide de la méthode d’hydratation douce. Le schéma offre une représentation visuelle des différentes étapes et de la chambre construite à l’aide de deux lames de verre et d’une entretoise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig04.jpg"> Figure 4 : Mesures en microscopie à fluorescence du recrutement dépendant de la lumière de mOrange-Nano sur les membranes GUVs. (A) Images de fluorescence d’un GUV fonctionnalisé disiLID en présence de mOrange-Nano. En vert se trouve le colorant membranaire des GUV, et en rouge est la fluorescence mOrange avant, pendant et après l’éclairage de la lumière bleue. Barres d’échelle = 10 μm. (B) Intensité de fluorescence de mOrange localisée sur GUV au cours du temps. Lors de l’éclairage, la fluorescence mOrange (en rouge) sur la membrane lipidique atteint son intensité maximale en 60 s, avec une augmentation de l’intensité de fluorescence de 5,9 fois. Lorsque l’éclairage est arrêté, la fluorescence mOrange diminue à des valeurs proches de celles de pré-éclairage en 60 s (avec une récupération de 90 %). La figure est adaptée de Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, un protocole est décrit pour générer des motifs protéiques régulés par la lumière et réversibles avec une grande précision spatio-temporelle au niveau de membranes lipidiques artificielles. La méthode consiste en la photoactivation localisée de la protéine iLID (dimère inductible par la lumière améliorée) immobilisée sur des membranes modèles qui, sous la lumière bleue, se lie à sa protéine partenaire Nano (SspB de type sauvage).

Motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Dans notre travail, nous visons à reproduire des processus cellulaires dans des modèles de type cellulaire artificiel qui nécessitent la localisation précise des protéines à un endroit donné à un certain moment. Ici, à titre d’exemple, nous démontrons la formation de motifs protéiques dynamiques sur des membranes lipidiques modèles avec une grande précision et un contrôle temporel spatial élevé en utilisant des protéines photocommutables et la lumière visible. L’un des défis expérimentaux actuels consiste à reproduire des motifs protéiques dynamiques sur des membranes lipidiques modèles.Ici, nous devons manipuler ces modèles protéiques rapidement et de manière réversible avec une grande précision, de manière biocompatible et non invasive. Nous utilisons des protéines photocommutables pour recruter et structurer des protéines d’intérêt sur des bicouches lipidiques soutenues et des vésicules unilamellaires géantes. Nous obtenons un recrutement rapide et localisé des protéines, et le motif des protéines est entièrement réversible dans l’obscurité et peut être répété plusieurs fois.Dans notre protocole, nous utilisons la lumière visible pour former des motifs protéiques. La lumière est un déclencheur attrayant pour contrôler les interactions avec une résolution spatio-temporelle et un accordage élevés. La lumière n’est pas non plus invasive et n’endommage pas les biomolécules.

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