Name: Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Découvrez la méthode OPTIR-FISH pour identifier les cellules individuelles et analyser leur métabolisme au niveau unicellulaire. Cette approche combine l'imagerie infrarouge photothermique optique et l'hybridation in situ par fluorescence.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole complet pour l’identification cellulaire et l’analyse métabolique à l’aide d’OPTIR-FISH

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
<li>Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+culturing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Present and future of culturing bacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).</li>
<li>Epstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-independent+methods+for+studying+environmental+microorganisms%3A+methods%2C+application%2C+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).</li>
<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
<li>Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+chemical+imaging+combined+with+correlative+microscopy+for+biological+sample+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).</li>
<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+integration+with+other+imaging+modalities+for+greater+molecular+understanding+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues.</a> Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labelling+in+vibrational+spectroscopy%3A+a+technique+to+decipher+the+structure+of+surface+species%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Catal%22%5BJournal%5D)">Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species.</a> Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).</li>
<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+suite+of+16S+rRNA-specific+oligonucleotide+probes+designed+to+investigate+bacteria+of+the+phylum+cytophaga-flavobacter-bacteroides+in+the+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment.</a> Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).</li>
<li>Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaims%2C+H+%22Molecular+Microbial+Ecology%22">Molecular Microbial Ecology</a>. , Taylor & Francis. London. (2004).</li>
<li>Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Fluorescence+In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Wang, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+FISH+protocol+with+hybridization-sensitive+fluorescent+linear+oligodeoxynucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes.</a> RNA. 18 (1), 166-175 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+isotopically+labeled+bacteria+at+the+single-cell+level+using+high-resolution+optical+infrared+photothermal+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy.</a> Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond-resolution+photothermal+dynamic+imaging+via+MHZ+digitization+and+match+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering.</a> Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).</li>
<li>Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond-selective+imaging+by+optically+sensing+the+mid-infrared+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect.</a> Sci Adv. 7 (20), (2021).</li>
<li>Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal+microscopy%3A+principle%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chemi+B%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications.</a> J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).</li>
<li>Du, J., Wang, H., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+vibrational+imaging+to+chemical+biology+with+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes.</a> ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).</li>
<li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+metabolic+imaging+with+vibrational+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes.</a> Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mapping+of+lipid+metabolites+using+an+infrared+probe+in+human-derived+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems.</a> Nat Commun. 15 (1), 350(2024).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRS-FISH%3A+A+high-throughput+platform+linking+microbiome+metabolism+to+identity+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+chemical+imaging+by+widefield+photothermal+sensing+of+infrared+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption.</a> Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).</li>
<li>Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+chemical+imaging+by+dense-net+learning+of+femtosecond+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering.</a> J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Éthanol à 96 %</td><td>ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de calcium</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0.35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluocose (U-13C6, 99 %)</td><td>Cambridge Isotopic Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon Luria-Bertani&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sels minimaux 5x</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Instrument OPTIR</td><td>Spectroscopie Photothermique Corp.</td><td>mIRage LS</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraforaldéhyde, 4 % dans une solution de</td> poly-L-lysine PBS <td>ThermoScientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>à 0,1 % (p/v)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 99+ %</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja trypic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (optir-fish)

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Le flux de travail général pour l’analyse métabolique microbienne unicellulaire avec identification génétique par OPTIR-FISH est résumé dans Graphique 2. Les résultats représentatifs démontrant la capacité d’imagerie métabolique unicellulaire d’OPTIR sont présentés dans Graphique 3. Cet exemple a utilisé des cellules E. coli incubées avec 12C- ou 13C-glucose pendant 24 h. L’incorporation de 13Il a été démontré que C dans les protéines provoque un décalage vers le rouge significatif des amides protéiques I et II (Graphique 3A)17,18. Par conséquent, ces deux numéros d’onde clés représentant le 12protéine C (1656 cm-1amide normal, bande I) et 13protéine C (1612 cm-1, décalée dans la bande amide I) ont été sélectionnées, et des images OPTIR à ces deux numéros d’onde ont été acquises. Les images en fond clair correspondantes sont également montrées pour démontrer la morphologie des cellules (Graphique 3B,E). Les bactéries en forme de bâtonnet peuvent être clairement résolues au niveau de la cellule unique dans les images en fond clair et OPTIR, ce qui confirme la haute résolution spatiale de la technique OPTIR (Graphique 3B-G). Pour les cellules incubées avec 12C-glucose (Graphique 3B-D), une intensité plus élevée à 1656 cm-1 a été observée, tandis qu’une altitude supérieure de 1612 cm-1 a été observée pour les cellules incubées avec 13C-glucose (Graphique 3E-G). Ce décalage de pic indique l’incorporation d’isotopes de carbone plus lourds dans la masse protéique17. L’évaluation a été élargie pour évaluer la capacité d’OPTIR-FISH à discriminer les taxons bactériens et leurs activités métaboliques dans des échantillons multi-espèces. Nous avons mélangé artificiellement deux espèces bactériennes qui sont répandues dans le microbiome intestinal humain : E. coli et B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli cellules incubées avec 13Le C-glucose a été hybridé avec une sonde Gam42a-Cy5, ciblant l’ARNr 23S des gammaprotéobactéries10. B. theta cellules incubées avec 12Le C-glucose a été hybridé avec la sonde Bac303-Cy3, ciblant l’ARNr 16S de la plupart des espèces de Bacteroidaceae11. Il est très difficile de différencier les deux espèces sur la base des images en fond clair, car elles sont toutes deux en forme de bâtonnet (Graphique 4A). Ainsi, l’imagerie par fluorescence multicolore de sondes hybridées était essentielle pour attribuer une identité taxonomique à chaque cellule bactérienne analysée (Graphique 4B). En soustrayant les images OPTIR acquises à 1612 cm-1 de celui de 1656 cm-1, nous avons remarqué qu’un segment de cellules de cet échantillon bi-espèces présentait des valeurs de soustraction positives (Graphique 4C), indiquant l’incorporation de 13C. Sur la base des conditions de culture, nous avons attribué aux cellules avec une valeur de soustraction positive E. coli, et la valeur de soustraction négative à B. theta. L’attribution d’espèces bactériennes est confirmée par les résultats de l’imagerie de fluorescence : les cellules produisant des valeurs de soustraction positives produisent un contraste Cy5, qui est spécifique à E. coli, et les cellules produisant des valeurs de soustraction négatives produisent B. theta-contrastes Cy3 spécifiques. Ensuite, le rapport de remplacement isotopique a été calculé, dans ce cas, nouvellement synthétisé 13Protéine C de 13C-glucose (Graphique 4D). Comme prévu, une différence significative dans le rapport de remplacement isotopique entre les deux espèces bactériennes (test t par paire, p = 9,74 x 10-33) a été observée. Cet ensemble de données souligne la faisabilité de l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour étudier le métabolisme dans un environnement complexe où plusieurs espèces d’échantillons sont présentes.
<img alt="Analyse microbienne ; hybridation par fluorescence, marquage isotopique, imagerie OPTIR, phénotype du génotype." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Schéma de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces et l’analyse du métabolisme. Différents membres de la communauté microbienne ont pu être identifiés par liaison spécifique des sondes d’ARN ribosomique microbienne par hybridation in situ en fluorescence et détectés par imagerie en fluorescence des fluorophores attachés. L’activité métabolique a pu être analysée par culture avec des substrats isotopiques et détectée par imagerie OPTIR. L’imagerie OPTIR détecte le changement de diffusion induit par l’absorption IR, et OPTIR est intrinsèquement compatible avec les outils fluorescents largement utilisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma du processus de marquage isotopique : FISH microbien, analyse OPTIR, détermination de l’identité, ratios." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Flux de travail général pour l’analyse unicellulaire de l’activité métabolique avec identification génétique par OPTIR-FISH. (A) Les cellules bactériennes ont été cultivées avec des substrats marqués isotopiquement. (B) Une hybridation in situ en fluorescence (FISH) a ensuite été réalisée. (C) Préparation de l’échantillon sur une lame transparente IR. (D) Les images en fond clair identifient les régions où la densité cellulaire est optimale. (E,H) L’imagerie par fluorescence multicolore de différents fluorophores FISH révèle l’identité génétique des cellules individuelles telle que spécifiée par les sondes FISH ou reste inconnue. (F,G) L’imagerie OPTIR multispectrale ultérieure au pic normal et décalé révèle l’incorporation isotopique dans la biomasse microbienne. En se référant aux spectres OPTIR pour les échantillons non marqués et entièrement marqués (coefficient h), la contribution relative des composants biologiques réguliers (cr) et isotopiques (ci) a pu être quantifiée. La synthèse des protéines à partir de substrats métabolisés marqués isotopiquement a été quantifiée à l’aide du « rapport de remplacement isotopique ». (I) Par OPTIR-FISH, une analyse à haut débit de l’activité métabolique d’espèces microbiennes dans une population complexe peut être obtenue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Spectroscopie d’E. coli à l’aide du glucose 12C/13C ; spectres OPTRIR ; images en fond clair et OPTIR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Spectres représentatifs d’OPTIR et résultats d’imagerie. (A) Spectres OPTIR pour des cellules d’E. coli cultivées avec 12C-glucose (cyan) et 13C-glucose (orange) couvrant les régions de l’amide I et de l’amide II. Un pic clair d’amide I décalé vers le rouge (1656 cm-1 à 1612 cm-1) est observé pour 13cellules cultivées de C-glucose. Images représentatives en fond clair et OPTIR des cellules d’E. coli dans la bande normale de l’amide I et de l’amide I décalé dans des conditions de culture de (B-D) 12C-glucose et (E-G) 13C-glucose. Barres d’échelle : 10 μm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images de microscopie à fond clair et FISH avec soustraction OPTIR, tableau de quantification d’E. coli et de B. thêta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Images représentatives et résultats de quantification à partir de mélanges bactériens. Les cellules d’E. coli ont été incubées avec du 13C-glucose, puis hybridées avec la sonde oligonucléotidique Gam42a-Cy5. Les cellules de B. thêta ont été incubées avec 12C-glucose, suivies d’une hybridation avec la sonde oligonucléotidique Bac303-Cy3. (A) L’image en fond clair montre la morphologie du mélange de cellules. (B) L’image de fluorescence bicolore montre la distribution d’E. coli (rouge) et de B. thêta (vert). (C) Le résultat de la soustraction OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) montre le métabolisme protéique des cellules bactériennes. (D) Quantification du rapport de remplacement isotopique représentant la protéine C 13nouvellement synthétisée à partir du glucose 13C. (Test t par paires : p = 9,74 x 10-33). Barres d’échelle : 10 μm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

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Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

Ce manuscrit présente une méthode détaillée pour la génération X-sondes de bras de chromosome et performants fluorescence in situ hybridation (poisson) pour examiner l’état de sœur cohésion des chromatides sœurs en prométaphase et métaphase que j’ai arrêté  Drosophile ovocytes. Ce protocole est convenable pour déterminer si la cohésion bras méiotique est intacte ou perturbé dans différents génotypes.

À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes

Les technologies d'édition génétique ont permis aux chercheurs de générer des mutants de poissons zèbres pour étudier la fonction génique avec une relative facilité. Ici, nous fournissons un guide pour effectuer le génotypage d'embryons parallèles et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. Cette approche impartiale offre une plus grande précision dans les analyses phénotypiques basées sur l'hybridation in situ.

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Optique résolution microscopie photoacoustique (OR-PAM) est une technologie émergente capable d'imagerie d'absorption optique des...

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Découvrez la méthode OPTIR-FISH pour identifier les cellules individuelles et analyser leur métabolisme au niveau unicellulaire. Cette approche combine l'imagerie infrarouge photothermique optique et l'hybridation in situ par fluorescence.

Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

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