Name: Préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique utilisant FIB-SEM. Cette méthode permet de reconstruire en 3D les terminaux des photorécepteurs de souris avec une excellente préservation des membranes cellulaires.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation des structures synaptiques rétiniennes en 3D avec la microscopie électronique volumique

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Moule d’encastrement</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon résine</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i SEM bifaisceau</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de plomb</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Composant du tampon phosphate</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Un composant du tampon phosphate</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

La figure 1A montre l’image des terminaisons des photorécepteurs rétiniens préparée à l’aide de la méthode traditionnelle de double fixation chimique, et la figure 1B montre l’image des terminaisons des photorécepteurs rétiniens préparée à l’aide de la méthode OTO. Les deux ont été échantillonnés par FIB-SEM. On peut clairement voir que la structure de la membrane cellulaire peut être conservée autant que possible en utilisant la méthode OTO, et même le contour des vésicules peut être clairement vu. De plus, le contraste des images obtenues à l’aide de la méthode OTO est également plus clair.
La figure 2 illustre le flux de travail expérimental utilisé pour reconstruire les caractéristiques ultrastructurales des terminaisons photoréceptrices. La reconstruction s’est concentrée sur quatre types de terminaisons photoréceptrices, notamment les pédicules du cône M, les pédicules du cône S, les sphérules de bâtonnet1 et les sphérules de bâtonnet2. L’accent a été mis sur les composants essentiels, tels que les mitochondries, les rubans synaptiques et les bassins de vésicules synaptiques dans les terminaisons photoréceptrices.
La figure 3 montre les mitochondries reconstruites et les rubans synaptiques dans les terminaisons photoréceptrices des bâtonnets. Notamment, les rubans synaptiques des sphérules de la tige 2 présentent une forme de fer à cheval distinctive, comportant généralement un seul ruban par sphérule. De plus, la figure 2 met en évidence la présence de deux mitochondries dans les sphérules des bâtonnets, avec une position cohérente dans l’espace central des terminaisons, situé au-dessus des rubans synaptiques. Toutes les structures ont été tracées manuellement, page par page.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> Figure 1 : Exemples d’images échantillonnées à l’aide de FIB-SEM pour la méthode traditionnelle de double fixation chimique et la méthode OTO. (A) Méthode traditionnelle de double fixation chimique. (B) Méthode OTO. Barre d’échelle : 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail de reconstruction 3D pour les terminaux photorécepteurs à l’aide de FIB-SEM. Après l’alignement à l’aide d’un logiciel de visualisation de données 3D, les images en série ont été segmentées manuellement et rendues pour une analyse plus approfondie. (A) Images originales de série. (B) Images alignées. (C) Images segmentées. (D) Images reconstituées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> Figure 3 : Reconstruction 3D. Les images représentatives de la reconstruction 3D représentent les terminaisons photoréceptrices en blanc, les mitochondries en orange et les rubans synaptiques en bleu. Barre d’échelle : 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

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Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.

Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Nous décrivons une méthode pour séparer efficacement l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de la rétine dans les yeux humains et générer des supports plats RPE / choroïdes entiers pour les analyses histologiques et morphométriques de l’EPR.

Génération efficace et cohérente d’épithélium/platures choroïdes pigmentaires rétiniens à partir d’yeux humains pour l’analyse histologique

Ce travail présente une préparation alternative de rétine à montage plat dans laquelle l’ablation des corps cellulaires photorécepteurs permet une diffusion plus rapide des anticorps et un meilleur accès des pipettes patch aux neurones rétiniens internes pour l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et les expériences d’électrophysiologie.

Split Retina en tant que préparation améliorée à montage plat pour l’étude des neurones de la couche nucléaire interne dans la rétine des vertébrés

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.

Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

Les péricytes dans le système vasculaire rétinien ont été examinés par coloration immunofluorescente avec le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β après injection rétro-orbitaire de lectine fluorescente de tomate. La rétine marquée a ensuite été traitée avec la méthode de nettoyage des tissus et montée entière pour visualiser les vues tridimensionnelles des péricytes entourant le système vasculaire rétinien au microscope confocal.

Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage 

Découvrez la préparation d'échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique utilisant FIB-SEM. Cette méthode permet de reconstruire en 3D les terminaux des photorécepteurs de souris avec une excellente préservation des membranes cellulaires.

Préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique

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