Name: Reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Découvrez la reconstitution de protéines membranaires dans des cellules synthétiques par encapsulation d'un système d'expression acellulaire. Cette méthode permet d'étudier les canaux ioniques et les potentiels d'action.

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L’APL remercie la National Science Foundation (EF1935265), les National Institutes of Health (R01-EB030031 et R21-AR080363) et le Bureau de recherche de l’armée (80523-BB)

Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont fournis dans la table des matériaux.
1. Réactions CFE en vrac en présence de petites vésicules unilamellaires (SUV)
<ol><li>Préparation du SUV REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une hotte en suivant les instructions de sécurité pour travailler avec du chloroforme.<ol><li>Préparez 5 mM de VUS de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) dans un flacon en verre en transférant 76 μL de solution mère de POPC à 25 mg/mL dissoute dans du chloroforme.</li>
		<li>Tout en tournant doucement le flacon en verre, soufflez un léger filet d’argon dans le flacon pour former un film de lipides séchés au fond. Ensuite, transférez le flacon en verre dans un dessiccateur avec son bouchon vissé sans serrer pour évaporer l’excès de chloroforme.</li>
		<li>Conservez le flacon en verre dans le dessiccateur pendant 1 h. Ensuite, ajoutez 0,5 mL d’eau désionisée ultra-pure pour dissoudre le film lipidique et vortex pendant environ 2 min.</li>
		<li>Mettez en place un appareil de mini-extrusion en trempant deux supports de filtre dans de l’eau désionisée et en les plaçant sur chacun des supports de membrane internes. Ensuite, trempez un filtre en polycarbonate de 100 nm et placez-le entre les deux supports de membrane internes maintenus ensemble par le boîtier extérieur de l’extrudeur et l’écrou de retenue. Placez cette configuration dans le support de l’extrudeuse.</li>
		<li>Rincez 3 fois deux seringues étanches au gaz de 1 ml avec de l’eau déminéralisée ultra-pure.</li>
		<li>Chargez l’échantillon de mélange lipide-eau dans l’une des seringues étanches au gaz de 1 ml et placez-le à une extrémité de la mini-extrudeuse à l’aide des clips du bras oscillant pour maintenir la seringue en place. Insérez la deuxième seringue dans l’autre extrémité de la mini-extrudeuse et assurez-vous qu’elle est complètement enfoncée. REMARQUE : Lorsque vous chargez la seringue avec le mélange lipide-eau, assurez-vous qu’il n’y a pas d’air dans la seringue avant de la faire passer dans la mini-extrudeuse.</li>
		<li>Passez doucement le mélange lipide-eau de la seringue d’origine à la seringue vide à travers l’appareil de mini-extrudeuse. Répétez cette étape 11 fois pour former des SUV. Transférez les VUS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. REMARQUE : La solution SUV peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemble de réaction CFE<ol><li>Assemblez la réaction CFE en suivant le protocole d’expression acellulaire fourni par le fabricant avec de légères modifications détaillées ci-dessous.</li>
		<li>Mélanger 10 μL de la solution 1 (contenant des acides aminés, des NTP, des ARNt et des substrats pour les enzymes, ainsi que le tampon nécessaire), 1 μL de la solution 2 (protéines dans 20 % de glycérol), 2 μL de la solution 3 (ribosome (20 μM)), une quantité appropriée d’ADN codant pour le sfGFP soluble-sfCherry(1-10)27 (ci-après dénommé sfGFP soluble), le WT-GluR0-sfGFP ou le PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 paires de bases), 1 μL d’inhibiteur de l’ARNase murine, et 4 μL de solution SUV 5 mM pour les protéines membranaires ou 4 μL d’eau pour les protéines solubles.</li>
		<li>Porter le volume final de la réaction à 20 μL en ajoutant de l’eau désionisée ultra-pure. REMARQUE : Lors de l’assemblage du système CFE, tous les composants doivent être maintenus sur la glace. Tous les matériaux sont sensibles à la température et peuvent se dégrader s’ils atteignent la température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation et surveillance de la réaction CFE<ol><li>Transférez la solution CFE sur une plaque conique à fond en V de 96 puits. Pour éviter l’évaporation au cours de la réaction, recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité.</li>
		<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un lecteur de plaques pendant 4 à 5 h tout en surveillant la réaction CFE en mesurant le signal GFP avec un gain de 100 aux longueurs d’onde d’excitation/émission de 488 nm/528 nm toutes les 2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Réactions CFE encapsulées dans les GUV
<ol><li>Préparation de la solution tampon extérieure GUV<ol><li>Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger 1,5 μL de spermidine 1 M, 37,5 μL de 100 mM d’ATP, 25 μL de 100 mM GTP, 12,5 μL de 100 mM CTP, 12,5 μL de 100 mM UTP, 25 μL de 1 M de créatine phosphate, 18 μL d’acétate de magnésium 1 M, 93,33 μL de 3 M de glutamate de potassium, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL d’acide folinique 332 mM, 100 μL de glucose 2 M et 50 μL de solution mère de 6 mM de mélange de chacun des 20 acides aminés (préparés en suivant le protocole décrit par Sun et al.28).</li>
		<li>Porter le volume final de la solution à 1 mL en ajoutant de l’eau déminéralisée ultra-purifiée. REMARQUE : Tous les composants doivent être conservés sur la glace. Ajouter le mélange d’acides aminés à la fin pour éviter l’épuisement des acides aminés28. La solution peut être aliquote dans des aliquotes de 330 μL et stockée à -20 °C jusqu’à son utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du mélange lipides dans l’huile REMARQUE : cette étape doit être effectuée dans une hotte en suivant les consignes de sécurité pour travailler avec du chloroforme.<ol><li>Dans une hotte, mélanger 17,3 μL de solution mère de POPC à 25 mg/mL et 1,08 μL de copolymère de poly(butadiène)-b-poly(oxyde d’éthylène) (PEO-b-PBD) à 50 mg/mL dans un flacon en verre de 15 mL. REMARQUE : La solution finale de lipides dans l’huile contient 0,5 mM de lipides avec 95 % et 5 % de POPC et de PEO-b-PBD, respectivement. PEO-b-PBD a été utilisé pour améliorer la stabilité de la membrane pendant l’expression de la protéine, mais a été maintenu à un faible rapport molaire pour réduire la tendance du copolymère à s’agréger en micelles séparées des molécules lipidiques29,30.</li>
		<li>Soufflez doucement un léger jet d’argon dans le flacon en verre tout en tournant le flacon pour évaporer le chloroforme.</li>
		<li>Pipeter 1,2 mL d’huile minérale légère dans le flacon en verre de 15 mL contenant les lipides séchés.</li>
		<li>Mélangez les lipides et l’huile en tourbillonnant à vitesse maximale pendant 10-20 s. Le mélange lipide-copolymère dissous aura l’air trouble.</li>
		<li>Pour s’assurer que tous les agrégats lipidiques possibles dans l’huile sont complètement dissous et dispersés dans toute l’huile, placez le flacon en verre dans un four à environ 50 °C pendant 20 min avant de tourbillonner pendant 10 à 20 s supplémentaires à vitesse maximale.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblage et encapsulation de la réaction CFE (la figure 1 résume les étapes suivantes).<ol><li>Préparez 300 μL de la solution extérieure GUV dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en mélangeant 270 μL de solution tampon externe CFE préparée à l’étape 2.1, 15 μL de 5 M de NaCl et 15 μL de 4,5 M KCl. REMARQUE : À cette étape, ajouter 0,45 μL de 1 M 1,4-dithiothréitol (DTT) à la solution extérieure GUV. Le but de l’ajout de NaCl et de KCl est d’ajuster l’osmolalité de la solution externe pour qu’elle corresponde à la solution CFE interne. Le volume exact de NaCl et de KCl dépend de l’ajustement souhaité de l’osmolalité. On peut ajouter soit du NaCl, soit du KCl, soit les deux pour ajuster l’osmolalité.</li>
		<li>Pipeter doucement 300 μL de mélange lipidique dans l’huile sur la solution extérieure GUV. REMARQUE : Lors de l’ajout du mélange lipide-huile, il est important que l’huile ne se mélange pas à la solution extérieure aqueuse. Après l’ajout, il doit y avoir une interface visible entre le mélange lipidique dans l’huile et la solution extérieure GUV.</li>
		<li>Incuber l’interface huile-eau à température ambiante pendant 2 h pour permettre à la monocouche lipidique de se former et de se stabiliser à l’interface.</li>
		<li>Pendant ce temps, suivez la section 1.2.1 pour assembler une réaction CFE contenant l’ADN plasmidique codant pour les variantes de protéines membranaires ou GFP soluble. Remplacez 4 μL de solution SUV 5 mM ou l’eau par 4 μL de saccharose 1 M. Cette réaction sera la solution interne GUV. REMARQUE : Un osmomètre a été utilisé pour mesurer l’osmolalité des solutions internes et externes. L’osmolalité de la solution externe a ensuite été ajustée en conséquence par l’ajout de NaCl ou d’eau. L’osmolalité de la réaction CFE est généralement d’environ 1600 mOsm/Kg. L’ajout de saccharose à la réaction augmente la densité de la solution interne, permettant ainsi aux vésicules de traverser l’interface huile-eau pendant l’étape de centrifugation. Une alternative au saccharose est la solution de gradient de densité Opti-Prep.</li>
		<li>Ajouter 600 μL de mélange lipide-huile dans le tube de microcentrifugation contenant la réaction CFE et pipeter vigoureusement de haut en bas pendant ~1 min pour émulsionner la réaction dans une solution lipidique dans l’huile et former la monocouche lipidique autour des cellules synthétiques. REMARQUE : La solution finale ne doit pas avoir de bulles et doit avoir l’air opaque.</li>
		<li>Pipetez doucement l’émulsion de solution interne sur la couche d’huile dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL où l’interface huile-eau a été mise en place. REMARQUE : Veillez à ne pas perturber ou déstabiliser l’interface.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 10 min à 2 000 x g à 4 °C. REMARQUE : La vitesse de centrifugation a été optimisée pour ce protocole. Adir et al.31 ont signalé une vitesse de centrifugation différente.</li>
		<li>Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement l’excès d’huile et la solution extérieure du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette. Retirer la solution extérieure jusqu’à ce que le volume restant soit d’environ 100 μL. REMARQUE : Une pastille de GUVs est généralement visible au fond du tube de la microcentrifugeuse. Cependant, l’absence d’un granulé visible ne signifie pas nécessairement qu’il n’y a pas de rendement GUV. Au lieu d’utiliser une pipette, l’excès d’huile sur le dessus de la solution externe peut être éliminé par aspiration. Il est essentiel de s’assurer que la solution lipidique dans l’huile est complètement éliminée. La contamination par l’huile dans la solution GUV peut entraîner des images de mauvaise qualité.</li>
		<li>Remettez la pastille GUV en suspension dans la solution restante de 100 μL en pipetant doucement de haut en bas. Ensuite, transférez la solution GUV sur une plaque à fond plat propre et claire à 96 puits pour l’incuber.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubation et imagerie de la réaction CFE encapsulée
<ol><li>Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5-6 h. On peut utiliser un lecteur de plaques et suivre l’étape 1.3.2 pour préparer le lecteur de plaques pour l’étape d’incubation.</li>
	<li>Une fois l’incubation terminée, placez la plaque à 96 puits sur la platine d’imagerie d’un microscope inversé équipé d’une caméra EMCCD (ou d’une caméra sCMOS), d’un laser contrôlé DAQ-MX (ou d’un système de combinaison laser intégré) et d’un disque rotatif confocal CSU-X1 (ou d’un confocal à balayage laser). Concentrez-vous sur n’importe quel retour sur investissement contenant des GUV et capturez des images à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm à l’aide d’un objectif Plan-Apochromat 60 x/1,4 NA.</li>
	<li>Enregistrez des images de GUV au format .tiff.</li>
	<li>Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images (par exemple, ImageJ ou Fiji). Ouvrez le panneau de réglage Luminosité/Contraste . Ajustez la luminosité et le contraste sur les paramètres appropriés qui rendent les protéines fluorescentes visibles.</li>
	<li>Si l’objectif est de comparer l’intensité du signal de différentes protéines exprimées, empilez d’abord des images individuelles de GUV contenant différentes protéines à l’aide du panneau Images à empiler situé sous le sous-menu Image > Stacks . Ensuite, ajustez la luminosité et le contraste de toutes les images à l’aide du panneau Luminosité/Contraste .</li>
</ol>

Expression acellulaire de protéines membranaires dans des vésicules unilamellaires géantes

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Pratiquement tous les processus cellulaires qui dépendent du transfert de molécules ou d’informations à travers la membrane cellulaire, comme la signalisation cellulaire ou l’excitation cellulaire, nécessitent des protéines membranaires. Ainsi, la reconstitution des protéines membranaires est devenue le principal goulot d’étranglement dans la réalisation de diverses conceptions de cellules synthétiques pour différentes applications. La reconstitution traditionnelle des protéines membranaires dans les membranes biologiques par l’intermédiaire d’un détergent nécessite des méthodes de génération de GUV telles que le gonflement doux ou l’électroformation. Les approches de gonflement produisent généralement des vésicules de petite taille, et le rendement d’électroformation diminue considérablement lorsque des solutions compliquées, ce qui est souvent le cas lors de la génération de cellules synthétiques, sont encapsulées32. De plus, les détergents solubilisent la protéine membranaire, et leur élimination pendant le processus de reconstitution peut provoquer un mauvais repliement des protéines33,34. D’autre part, l’approche présentée ici repose sur l’incorporation cotraductionnelle de la protéine membranaire dans la bicouche lipidique, qui ressemble davantage à la voie naturelle de biogenèse des protéines dans les cellules22.
D’un point de vue technique, le protocole présenté est avantageux par rapport à d’autres méthodes d’encapsulation courantes, telles que l’électroformation et l’encapsulation de croisement d’interface de gouttelettes continues 7,8,35,36 (cDICE), pour une mise en œuvre plus facile car le seul équipement de laboratoire requis pour la génération de GUV est une centrifugeuse. Contrairement à l’électroformation, la méthode de l’émulsion inversée permet l’encapsulation de différentes combinaisons de molécules de concentrations diverses. De plus, par rapport à la technique originale d’émulsion inversée25, cette approche génère des GUV plus stables qui conviennent à l’encapsulation de lysats CFE ou de systèmes PURE. La plus grande stabilité du GUV est due à la présence de copolymère dibloc dans la composition de la membrane GUV37 ainsi qu’à la longue incubation de l’interface huile-eau qui permet à l’interface d’être saturée en molécules lipidiques. Enfin, contrairement aux approches microfluidiques, le protocole présenté ici ne nécessite pas de petits canaux et de tubes. Par conséquent, la réaction CFE peut être encapsulée dès qu’elle est assemblée, et le temps plus court d’assemblage du GUV en raison du manque de débit et d’un éventuel colmatage empêche le démarrage prématuré de la réaction CFE. Bien que la démonstration de l’expression des protéines membranaires dans ce protocole soit exclusive aux réactions PUREfrex, on peut étendre cette méthode à la synthèse de protéines à l’aide de différents systèmes CFE disponibles, tels que les systèmes CFE bactériens ou mammifères à base de lysat.
L’approche présentée ici présente des limites qui sont causées par la nature dépendante du pétrole du processus de formation des GUV et l’intention d’avoir des GUV stables. Cette approche est généralement plus longue que celle d’autres méthodes, telles que le cDICE ou la microfluidique, en raison du long temps d’incubation de l’interface huile-eau nécessaire à la stabilisation de l’interface et au rendement GUV élevé. De plus, la composition lipidique est principalement limitée aux POPC avec de petites doses d’autres lipides ou copolymères séquencés, tandis que d’autres méthodes, telles que l’électroformation, sont plus adaptées à l’incorporation de lipides ayant des propriétés physiques et chimiques différentes. Bien que la composition de la membrane GUV dans cette méthode soit un mélange de POPC et de PBD-PEO pour maximiser le rendement CFE, d’éventuelles variations de la composition de la membrane GUV peuvent être testées. Cependant, une optimisation supplémentaire des paramètres pourrait être nécessaire pour d’autres protéines membranaires. Étant donné que l’émulsification des gouttelettes se produit par pipetage manuel, les GUV générées par cette méthode sont polydispersées et de taille assez hétérogène. De plus, le fait que les lipides soient dissous dans la phase organique peut parfois provoquer une couche d’huile entre les deux feuillets de la membrane GUV ou contaminer la chambre d’imagerie avec de l’huile qui peut nuire à la qualité de l’image. Une solution possible au défi de l’huile résiduelle consiste à remplacer l’huile minérale par un solvant organique volatil, tel que l’éther diéthylique, comme l’ont montré Tsumoto et al.38, pour s’appuyer sur l’évaporation du solvant en même temps que la centrifugation pendant la formation de GUV.
Bien qu’il n’y ait aucune démonstration de la fonction des canaux dans ce travail, inspiré par des tests antérieurs utilisés pour sonder la fonctionnalité des canaux mécanosensibles ou sensibles à la lumière reconstitués, un test basé sur la microscopie à fluorescence est décrit. L’ouverture du canal GluR0 augmenterait la conductivité membranaire des ions K+ 24. Étant donné que les réactions CFE contiennent déjà une forte concentration de K+, les indicateurs de potassium typiques ne conviennent pas pour évaluer la fonctionnalité des canaux. Cependant, comme l’afflux de potassium modifie le potentiel membranaire, des indicateurs sensibles du potentiel membranaire tels que DiBAC4(3)22 ou BeRST 139 pourraient signaler l’activité de GluR0 en présence de glutamate.
La reconstitution réussie des protéines membranaires dans les cellules synthétiques ouvre de nombreuses possibilités pour créer des cellules synthétiques aux capacités sans précédent qui imitent plus fidèlement les cellules naturelles. L’un des principaux inconvénients actuels des cellules synthétiques est leur incapacité à reproduire et à recycler l’énergie. Cependant, avec des schémas de régénération d’énergie dépendants de la lumière et des produits chimiques qui reposent fortement sur les protéines membranaires, on peut envisager des cellules synthétiques de longue durée40. L’utilisation de systèmes CFE permet la reconstitution de plusieurs protéines membranaires qui peuvent effectuer collectivement certaines tâches. Par exemple, la reconstitution d’un canal ionique ligand-dépendant similaire à GluR0 décrit ici, ainsi que différents canaux ioniques voltage-dépendants, peut conduire à la construction d’une cellule synthétique excitable semblable à un neurone.

La biologie synthétique ascendante a suscité un intérêt croissant au cours de la dernière décennie en tant que domaine émergent avec de nombreuses applications potentielles en bio-ingénierie, en administration de médicaments et en médecine régénérative 1,2. Le développement des cellules synthétiques en tant que pierre angulaire de la biologie synthétique ascendante, en particulier, a attiré un large éventail de communautés scientifiques en raison des applications prometteuses des cellules synthétiques ainsi que de leurs propriétés physiques et biochimiques similaires à celles des cellules qui facilitent les études biophysiques in vitro 3,4,5,6 . Les cellules synthétiques sont souvent conçues dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV) de la taille d’une cellule dans lesquelles différents processus biologiques sont recréés. La reconstitution du cytosquelette cellulaire 7,8, la régénération de l’énergie dépendante de la lumière9, la communication cellulaire10,11 et la biodétection12 sont des exemples d’efforts déployés pour reconstruire des comportements semblables à ceux des cellules dans les cellules synthétiques.
Alors que certains processus cellulaires reposent sur des protéines solubles, de nombreuses caractéristiques des cellules naturelles, telles que la détection et la communication, utilisent souvent des protéines membranaires, notamment des canaux ioniques, des récepteurs et des transporteurs. Un défi majeur dans le développement des cellules synthétiques est la reconstitution des protéines membranaires. Bien que les méthodes traditionnelles de reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques reposent sur la purification médiée par les détergents, ces méthodes sont laborieuses, inefficaces pour les protéines toxiques pour l’hôte d’expression, ou ne sont souvent pas adaptées à la reconstitution des protéines membranaires dans les GUVs13.
Les systèmes d’expression acellulaire (EFC) constituent une autre méthode d’expression des protéines. Les systèmes CFE ont été un outil puissant en biologie synthétique qui permet l’expression in vitro de diverses protéines à l’aide de lysats cellulaires ou de machines de transcription-traduction purifiées14. Les systèmes CFE peuvent également être encapsulés dans des GUV, permettant ainsi des réactions de synthèse de protéines compartimentées qui peuvent être programmées pour diverses applications, telles que la création de cellules synthétiques collectrices de lumière9 ou de biocapteurs mécanosensibles15,16. À l’instar des méthodes d’expression des protéines recombinantes, l’expression des protéines membranaires est difficile dans les systèmes CFE17. L’agrégation, le mauvais repliement et l’absence de modification post-traductionnelle dans les systèmes CFE sont des goulets d’étranglement majeurs qui entravent la synthèse réussie des protéines membranaires à l’aide des systèmes CFE. La difficulté de la reconstitution ascendante des protéines membranaires à l’aide des systèmes CFE est due en partie à l’absence d’une voie complexe de biogenèse des protéines membranaires qui repose sur des peptides de signal, des particules de reconnaissance de signaux, des translocons et des molécules chaperonneuses. Cependant, récemment, de multiples études ont suggéré que la présence de structures membraneuses telles que des microsomes ou des liposomes pendant la traduction favorise l’expression réussie des protéines membranaires 18,19,20,21. De plus, Eaglesfield et al. et Steinküher et al. ont constaté que l’inclusion de domaines hydrophobes spécifiques connus sous le nom de peptides signaux dans l’extrémité N-terminale de la protéine membranaire peut améliorer considérablement son expression22,23. Dans l’ensemble, ces études suggèrent que le défi de la reconstitution des protéines membranaires dans les cellules synthétiques peut être surmonté si la traduction des protéines se produit en présence de la membrane GUV et si le peptide signal N-terminal approprié est utilisé.
Ici, un protocole d’encapsulation de la synthèse protéique à l’aide d’éléments recombinants (PURE) pour la reconstitution des protéines membranaires dans les GUVs est présenté. Le récepteur24 du glutamate bactérien (GluR0) est sélectionné comme protéine membranaire modèle, et l’effet de son peptide signal N-terminal sur sa reconstitution membranaire est étudié. L’effet du peptide signal de la protéorhodopsine, dont Eaglesfield et al.22 ont montré qu’il améliorait l’efficacité de la reconstitution des protéines membranaires, est étudié en construisant une variante mutée de GluR0 désignée PRSP-GluR0 et en comparant son expression et sa localisation membranaire avec GluR0 de type sauvage (ci-après appelé WT-GluR0) qui héberge son peptide signal natif. Ce protocole est basé sur la méthode de l’émulsion inversée25 avec des modifications qui le rendent robuste pour l’encapsulation CFE. Dans la méthode présentée, les réactions CFE sont d’abord émulsionnées à l’aide d’une solution lipidique dans l’huile qui génère des gouttelettes de la taille d’un micron contenant le système CFE et stabilisées par la monocouche lipidique. Les gouttelettes d’émulsion sont ensuite superposées sur une interface huile-eau saturée d’une autre monocouche lipidique. Les gouttelettes d’émulsion sont ensuite forcées de se déplacer à travers l’interface huile-eau par la force centrifuge. Grâce à ce processus, les gouttelettes obtiennent une autre monocouche, générant ainsi une vésicule lipidique bicouche. Les GUVs contenant la réaction CFE sont ensuite incubés, au cours desquels la protéine membranaire est exprimée et incorporée dans la membrane GUV. Bien que ce protocole soit spécifié pour l’expression acellulaire de GluR0, il peut être utilisé pour la synthèse acellulaire d’autres protéines membranaires ou différentes applications cellulaires synthétiques telles que la reconstitution du cytosquelette ou les études de fusion membranaire26.

<table><tbody><tr><td>Filtre en polycarbonate 100 nm</td><td>STERLITECH</td><td>1270193</td><td></td></tr><tr><td>96 Plaque inférieure bien transparente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode</td><td>Reader Agilent</td><td>11-120-533</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de créatine</td><td>Millipore Sigma</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Scanner confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Milieu à gradient de densité (Optiprep)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>Facultatif pour le remplacement avec du saccharose dans la solution interne</td></tr><tr><td>Supports de filtre</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes Fisherbrand (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique calcium sel hydraté</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 appareil photo&nbsp ;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-glutamique sel de potassium monohydraté</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale légère</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de magnésium tétrahydraté.</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse kit (y compris porte-seringue et support d’extrudeuse)</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 Microscope inversé&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Objectif de microscope à huile&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933°</td><td></td></tr><tr><td>PEO-b-PBD</td><td>Source polymère</td><td>P41745-BdEO</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP ADN plasmidique</td><td>Fait maison</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) ADN plasmidique Cherry(1-10)</td><td>Fait maison</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP ADN plasmidique</td><td>POPC N/A</td><td></td><td>fait maison</td></tr><tr><td>dans le chloroforme&nbsp ;</td><td>Avanti</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>PUREfrex 2.0</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>GFK-PF201</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucléotide Solution Set</td><td>New England BioLabs</td><td>N0450</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase, Murine</td><td>New England BioLabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RTS Échantillonneur d’acides aminés</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre de pression de vapeur VAPRO Modèle 5600</td><td>ELITechGroup</td><td>VAPRO 5600</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

Les systèmes d’expression acellulaire (CFE) sont des outils puissants en biologie synthétique qui permettent le biomimétisme des fonctions cellulaires telles que la biodétection et la régénération d’énergie dans les cellules synthétiques. La reconstruction d’un large éventail de processus cellulaires nécessite toutefois une reconstitution réussie des protéines membranaires dans la membrane des cellules synthétiques. Alors que l’expression des protéines solubles est généralement réussie dans les systèmes CFE courants, la reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques des cellules synthétiques s’est avérée être un défi. Ici, une méthode de reconstitution d’une protéine membranaire modèle, le récepteur du glutamate bactérien (GluR0), dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en tant que cellules synthétiques modèles, basée sur l’encapsulation et l’incubation de la réaction CFE à l’intérieur de cellules synthétiques, est démontrée. En utilisant cette plateforme, l’effet de la substitution du peptide signal N-terminal de GluR0 par le peptide signal de la protéorhodopsine sur la translocation cotraductionnelle réussie de GluR0 dans les membranes de GUVs hybrides est démontré. Cette méthode fournit une procédure robuste qui permettra la reconstitution acellulaire de diverses protéines membranaires dans des cellules synthétiques.

Avant l’encapsulation des réactions CFE, deux variantes de GluR0-sfGFP hébergeant des peptides signaux natifs et protéorhodopsines (les séquences de peptides signaux sont présentées dans le tableau supplémentaire 1), et la sfGFP soluble ont été exprimées individuellement dans des réactions globales, et leur expression a été surveillée en détectant le signal sfGFP à l’aide d’un lecteur de plaques (Figure 2A). Les protéines membranaires ont été exprimées en l’absence ou en présence de SUV de 100 nm. De plus, à l’aide d’une courbe d’étalonnage qui corrèle le signal sfGFP à sa concentration (figure supplémentaire 1), les concentrations de protéines synthétisées ont été estimées (tableau supplémentaire 2). De toute évidence, la sfGFP soluble avait l’expression la plus élevée parmi les trois protéines, ce qui suggère que l’expression des protéines membranaires impose une charge au système CFE, ralentissant ainsi la réaction et diminuant son rendement. De plus, en moyenne, les réactions exprimant des protéines membranaires en présence de SUV ont montré un signal sfGFP plus élevé par rapport aux réactions dépourvues de SUV. Cette observation s’aligne sur les résultats de Steinküher et al., qui ont montré que l’expression des protéines membranaires réduit la capacité des systèmes CFE à produire des protéines23. Néanmoins, étant donné la démonstration réussie de l’expression des protéines dans la réaction CFE en vrac, on peut penser que les CFE encapsulées synthétisent également des protéines à l’intérieur des GUV. 
Ensuite, des réactions CFE individuelles ont été encapsulées dans des GUV à l’aide de la méthode de l’émulsion inversée pour exprimer des variantes de GluR0, à savoir WT-GluR0, PRSP-GluR0 et sfGFP soluble. Alors que WT-GluR0, hébergeant le peptide signal natif GluR0, a démontré une excellente expression et une excellente localisation membranaire (Figure 2B, panneau de gauche), son homologue, PRSP-GluR0, qui a un peptide signal N-terminal de protéorhodopsine, n’a pas montré une forte localisation membranaire similaire. Le PRSP-GluR0 s’est avéré plus sujet à l’agrégation et à la formation de ponctuations (figure 2B, panneau du milieu). Comme prévu, la sfGFP soluble était exprimée dans les GUV et restait dans le lumen GUV (figure 2B, panneau de droite ; voir la figure supplémentaire 2 pour des images de cohortes de GUV).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig01.jpg"> Figure 1 : Étapes expérimentales de l’émulsion inversée. (1) Les étapes 2.3.1 à 2.3.3 du protocole sont visualisées pour démontrer l’assemblage de la monocouche lipidique à l’interface du mélange lipide-huile et de la solution tampon externe. (2) La visualisation de l’étape 2.3.5 du protocole est montrée ici pour représenter la formation de la monocouche lipidique autour des gouttelettes émulsionnées encapsulant la solution interne de CFE. (3) L’étape 2.3.6 du protocole montre l’ajout des GUV monocouches dans le tube de microcentrifugation avec la monocouche lipidique à l’interface d’un mélange lipide-huile et d’une solution tampon externe. (4) L’étape 2.3.7 est décrite ici, au cours de laquelle la centrifugation conduit à la formation d’une pastille GUV dans la solution extérieure. (5) L’étape 2.3.8 est illustrée ici, indiquant le processus d’élimination de l’excès de mélange de lipides dans l’huile et de la solution externe. (6) Enfin, l’étape 2.3.9 est décrite ici, où la pastille de GUV est remise en suspension dans la solution extérieure, et les GUV sont prêts pour l’incubation, suivie de l’imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig02.jpg"> Figure 2 : Expression des protéines dans les réactions CFE en vrac et dans les GUV encapsulant des réactions CFE. (A) Lectures de fluorescence de réactions CFE en vrac individuelles exprimant WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP et sfGFP soluble. Le graphique sfGFP soluble représente le signal d’une réaction de 2,5 μL (le volume de réaction standard est de 20 μL) pour éviter la sursaturation des mesures du lecteur de plaques. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, n = 3. (B) À gauche : Une image confocale représentative d’une réaction CFE encapsulant GUV exprimant WT-GluR0-sfGFP. Au milieu : Une image confocale représentative des GUVs encapsulant la réaction CFE exprimant PRSP-GluR0-sfGFP. À droite : Une image confocale représentative d’une réaction CFE encapsulant GUV exprimant une sfGFP soluble. Barres d’échelle : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : La courbe d’étalonnage du signal sfGFP et son analyse de régression linéaire correspondante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Image confocale représentative de cohortes de GUVs exprimant (à gauche) WT-GluR0-sfGFP, (au milieu) PRSP-GluR0-sfGFP et (à droite) sfGFP soluble. Barre d’échelle : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : La séquence d’acides aminés des peptides signaux de type sauvage et de protéorhodopsine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Concentration des protéines synthétisées dans les réactions CFE en vrac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit la méthode d’émulsion inversée utilisée pour encapsuler un système d’expression acellulaire (CFE) dans une vésicule unilamellaire géante (GUV) pour l’étude de la synthèse et de l’incorporation d’une protéine membranaire modèle dans la bicouche lipidique.

Reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Notre protocole porte sur la reconstitution d’une protéine membranaire au sein de la bicouche lipidique d’une cellule synthétique réalisée par la méthode de l’émulsion de gouttelettes inversées. L’avantage d’utiliser la méthode d’émulsion de gouttelettes inversées est sa capacité à générer des cellules synthétiques qui fournissent un environnement stable pour l’expression acellulaire des protéines membranaires. Notre protocole offre aux chercheurs sur le terrain une méthode robuste pour synthétiser des protéines membranaires à l’intérieur de cellules synthétiques à l’aide d’un système d’expression acellulaire.Mon laboratoire travaille sur la reconstitution de divers canaux ioniques dans des cellules synthétiques par la reconstitution du potentiel d’action par un ensemble bien défini de canaux ioniques.

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Procédures pour les reconstitution complète d'un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d'électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d'autres protéines membranaires.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Ce protocole de cinq jours décrit toutes les étapes, de l'équipement et des logiciels supplémentaires nécessaires pour la création et l'exécution d'une Escherichia coli endogène efficace basé TX-TL système d'expression acellulaire à partir de zéro. Avec des réactifs, le protocole prend 8 heures ou moins de configurer une réaction, collecter et traiter les données.

Protocoles pour la mise en œuvre d'un Escherichia coli Sur la base du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Cet article décrit les méthodes de marquage de spin dirigé par site et de reconstitution des canaux pentamères ligand-dépendants pour les études de résonance paramagnétique électronique. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine membranaire. La méthode de reconstitution décrite ici peut également être utilisée pour des mesures par patch-clamp de courants macroscopiques et monocanaux dans un système lipidique défini.

Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

Un protocole d’expression acellulaire facile à utiliser pour l’incorporation spécifique de résidus d’analogues d’acides aminés non canoniques dans les protéines, y compris l’analyse en aval, est présenté pour des études médicales, pharmaceutiques, structurelles et fonctionnelles.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Une procédure est présentée pour le repliement de la domaine de liaison du ligand périplasmique dCACHE de Campylobacter jejuni zone chémoréceptrice Tlp3 de corps d’inclusion et de la purification pour produire des quantités de milligramme de protéine.

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

À l’interface des solvants organiques et aqueux, les protéines amphiphiliques sur mesure de type élastine s’assemblent en structures supramoléculaires complexes telles que les vésicules, les fibres et les coacervates déclenchés par des paramètres environnementaux. Les protocoles d’assemblage décrits donnent des compartiments à base de membrane protéique (PMBCs) avec des propriétés de thon, permettant l’encapsulation de diverses cargaisons.

Assemblage dirigé des protéines elastin-like en structures supramoléculaires définies et encapsulation de fret in Vitro

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Ce protocole décrit le système de synthèse des protéines libres (CFPS) utilisé dans la construction des cellules synthétiques. Il décrit les étapes clés avec des résultats représentatifs dans différents micro-compartiments. Le protocole vise à établir les meilleures pratiques pour divers laboratoires de la communauté des cellules synthétiques, faisant ainsi progresser le développement des cellules synthétiques.

SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

Découvrez la reconstitution de protéines membranaires dans des cellules synthétiques par encapsulation d'un système d'expression acellulaire. Cette méthode permet d'étudier les canaux ioniques et les potentiels d'action.

Reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire

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