Name: Détection de l’interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour détecter l'interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle. Cette technique minimise la perte d'échantillon et améliore la précision des données sans équipement spécialisé.

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Nous exprimons notre sincère gratitude pour le soutien financier reçu du Projet de Construction Connotation du 14ème Plan Quinquennal de l’Université de Médecine Tibétaine (2022ZYYGH12), des Sujets Ouverts 2022 du Laboratoire Clé de Médecine Tibétaine et de l’Éducation de Base du Ministère de l’Éducation à l’Université de Médecine Tibétaine (ZYYJC-22-04), du Programme Clé de Recherche et Développement du Ningxia (2023BEG02012), et le projet de promotion de la recherche Xinglin Scholar de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (XKTD2022013).

La solution composée, la solution protéique et le colorant ont été introduits dans une solution PBS. Par la suite, les échantillons ont subi un chauffage progressif à l’aide d’un bain sec numérique secouant un chauffage, et la stabilité thermique des protéines a été évaluée en mesurant la variation de l’intensité de la fluorescence au sein du système complexe. Les étapes détaillées sont décrites ci-dessous, et la figure 1 illustre une vue d’ensemble du protocole.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Préparez une solution d’ombellifère de 1 mM en ajoutant 0,1 mg d’ombelliférone à 616,75 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Préparez une solution de protéine CD40 de 200 μg/mL en ajoutant 0,1 mg de CD40 à 500 μL de solution de ddH2O (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Préparez une solution de colorant orange 500x en ajoutant 1 μL de colorant orange 5000x à 9 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Effectuez les opérations ci-dessus sur de la glace et, comme la pipette a une plage minimale de 0,1 μL, diluez d’abord le colorant protéique orange d’un facteur 10 pour faciliter l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>2. Tests de performance des colorants
<ol><li>Ajoutez le colorant orange 500x à une solution PBS et diluez-le pour obtenir des rapports colorant : PBS de 1:500, 1:1000, 1:2000 et 1:4000. REMARQUE : S’assurer que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 2 % (v/v).</li>
	<li>Allumez le lecteur de microplaques fluorescent et préchauffez-le pendant 10 min.</li>
	<li>Ouvrez l’ordinateur et le logiciel d’acquisition de données dans l’ordre (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Cliquez sur Instrument, choisissez le modèle de microplaque de fluorescence correspondant et sélectionnez OK dans le logiciel d’acquisition de données. REMARQUE : Attendez que la microplaque de fluorescence ait fini de préchauffer et d’afficher la température sur le panneau avant d’ouvrir le logiciel d’acquisition de données pour assurer une connexion réussie entre l’instrument et le logiciel.</li>
	<li>Cliquez sur Paramètres d’acquisition et sélectionnez Fluorescence dans le logiciel d’acquisition de données.</li>
	<li>Modifiez le programme dans l’interface Longueurs d’onde : Lm1 = 470 nm, 570 nm, puis sélectionnez OK. REMARQUE : Le colorant orange peut être excité avec de la lumière UV à 300 nm ou de la lumière visible à 470 nm, et l’émission peut être mesurée à 570 nm.</li>
	<li>Ajouter différentes concentrations de colorant orange (1:500, 1:1000, 1:2000 et 1:4000) et de PBS à des plaques de 96 puits à 100 μL/puits. REMARQUE : Dissoudre la solution dans du DMSO avant de l’ajouter au PBS, et tourbillonnez-la à 2000 x g pendant le processus de préparation pour assurer une dissolution complète en raison de la tendance du colorant à précipiter.</li>
	<li>Placez la plaque à 96 puits dans la platine de détection de l’instrument, cliquez sur le bouton Lire dans le logiciel d’acquisition de données et mesurez la fluorescence de chaque concentration de colorant 13 fois à température ambiante, avec un intervalle de 2 minutes à chaque fois.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Exporter après chaque détermination, sélectionnez Exporter au format XML XLS TXT, choisissez Toutes les plaques, puis sélectionnez Plaque au format de sortie, et enfin cliquez sur OK pour enregistrer les données dans un dossier au format « XLS » pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : Ces étapes permettent de déterminer l’impact de la mesure continue sur l’autofluorescence du colorant orange à température ambiante et d’identifier la concentration optimale de coloration.</li>
	<li>Allumez le chauffage numérique en secouant le bain sec, réglez la température de chauffage sur 35 °C et le temps de chauffage sur 2 min.</li>
	<li>Préparez le taux de dilution optimal du colorant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placez-le dans le bain sec de chauffage numérique en secouant pendant 2 min.</li>
	<li>Ajouter la solution de PBS et la solution de coloration, chauffées à 35 °C, dans la plaque de 96 puits à un volume de 100 μL par puits.</li>
	<li>Placez la plaque à 96 puits dans la platine de détection de l’instrument et cliquez sur le bouton Lire dans le logiciel d’acquisition de données.</li>
	<li>Réglez la température de chauffage sur 40 °C et le temps de chauffage sur 2 min.</li>
	<li>Pipeter la solution de colorant dans la plaque à 96 puits dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL et la chauffer dans l’instrument pendant 2 min.</li>
	<li>Répéter les opérations des étapes 2.12 à 2.15 et de l’étape 2.9 pour tester l’absorbance de la solution de colorant à 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement. REMARQUE : Ces étapes permettent de déterminer la stabilité de l’autofluorescence du colorant orange sous chauffage continu dans un gradient de 35 °C à 95 °C. Il est crucial de travailler rapidement pour éviter les chutes de température rapides ou l’ajout d’un mauvais liquide, ce qui pourrait entraîner des erreurs expérimentales.</li>
</ol>3. Détection de la température de fusion (Tm) de la protéine
<ol><li>Combiner la protéine CD40 et le colorant orange avec une solution de PBS pour obtenir des concentrations finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL et 1:500, respectivement.</li>
	<li>Répéter les opérations décrites aux étapes 2.2 à 2.6 et aux étapes 2.10 à 2.16 pour évaluer l’absorbance de la solution de protéine CD40 à des températures de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement.</li>
	<li>Réitérez l’étape 2.9 pour enregistrer et analyser les données, puis calculer la valeur Tm à l’aide d’un logiciel d’analyse de données (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Ajouter la protéine CD40, l’ombelliférone et le colorant orange à la solution de PBS pour obtenir des concentrations finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM et 1:500, respectivement. REMARQUE : Un vortex vigoureux pendant la préparation de la solution est essentiel pour assurer une distribution uniforme du colorant, de la protéine CD40 et de l’ombellifère dans le PBS.</li>
	<li>Répéter les opérations des étapes 3.2 et 3.3 pour mesurer l’absorbance de la solution de complexes CD40-ombelliférones à des températures de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C et 95 °C, respectivement. REMARQUE : Ces étapes ont été menées pour déterminer les valeurs Tm de la protéine CD40 et des complexes CD40-ombelliférone, dans le but d’identifier la concentration optimale de liaison de la protéine CD40 à l’ombellifère.</li>
</ol>

Détection haute sensibilité de la liaison de protéines composées par fluorescence

<ol><li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+%26%2334%3Bfive+roots%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Guid+J+Trad+Chin+Med+Pharm%22%5BJournal%5D)">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &#34;five roots&#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dali+Univ%22%5BJournal%5D)">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li>
<li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+constituents%2C+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Ethnomed+Ethnopharm%22%5BJournal%5D)">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li>
<li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+%28Oenanthe+Javanica%29+on+immune+function+of+immunosuppression+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Trad+Med+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li>
<li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li>
<li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li>
<li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471(2014).</li>
<li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meltdown%3A+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li>
<li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+EnzymeInhib+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).</li>
<li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li>
<li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical%2C+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238(2023).</li>
<li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Test+Technol+Instruments%22%5BJournal%5D)">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).</li>
<li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+%28BLI%29+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li>
<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).</li>
<li>Grädler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Life%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le DSF, également connu sous le nom de test de décalage thermique ou test de fluorescence thermique, est une technique utilisée pour détecter le processus de dénaturation thermique des protéines dans les échantillons en surveillant les changements dans le signal de fluorescence de l’échantillon ou du colorant lors d’une augmentation lente et programmée de la température. Initialement établie par Pantoliano14, la DSF est une méthode à haut débit. La procédure principale consiste à élever la température sur une plaque chauffante contrôlée par ordinateur, à émettre une lumière d’excitation à l’aide d’une lampe ultraviolette à longue longueur d’onde et à capturer les changements d’intensité du signal fluorescent résultant de la liaison des colorants fluorescents aux protéines à travers une caméra de formation de phase de dispositif à couplage de charge.
La valeur Tm, un indicateur crucial caractérisant la structure de niveau supérieur des protéines, représente la température correspondant à la moitié de la dénaturation du médicament protéique lors d’une augmentation de température. Des valeurs Tm plus élevées suggèrent une plus grande exigence de température pour la dénaturation des protéines, indiquant une structure protéique plus stable. La méthode actuellement reconnue pour détecter les valeurs de Tm est la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), qui a été initiée dans les années 196015. La DSC mesure la différence de puissance délivrée à l’objet testé et à un objet de référence en fonction de la température sous contrôle de température programmé pour obtenir la quantité de chaleur absorbée et évacuée. Il s’agit de la référence en matière d’analyse de stabilité thermique16,17.
La DSF est largement utilisée en raison de trois avantages par rapport à la DSC : (1) Consommation d’échantillon réduite : la DSC nécessite généralement un volume d’échantillon de 400 μL, tandis que la DSF n’en nécessite que 20-25 μL. (2) Plage de concentration plus large : la DSC nécessite généralement des concentrations de protéines de 0,2 à 2 mg/mL pour obtenir un pic de dénaturation significatif, tandis que la DSF peut analyser des échantillons dans la plage de 0,005 à 200 mg/mL. (3) Débit d’échantillons plus élevé : DSC ne peut analyser qu’un seul échantillon à la fois, tandis que DSF peut scanner simultanément jusqu’à 96 échantillons ouplus 18. En raison de ces avantages, le DSF est largement utilisé dans l’étude de la stabilité des protéines, de la structure et de la conformation des protéines, des interactions protéine-ligand et des effets des stabilisateurs de protéines, des inhibiteurs, des cofacteurs, etc.
En plus de la DSF et de la DSC, plusieurs autres techniques d’interaction moléculaire existent. La résonance plasmonique de surface (SPR) est un phénomène optique se produisant à l’interface de deux milieux et pouvant être induit par des photons ou des électrons. Il s’agit d’une réflexion totale lorsque la lumière est émise d’un milieu optiquement dense vers un milieu optiquement clairsemé. L’angle auquel la résonance plasmonique de surface se produit est connu sous le nom d’angle SPR. Les biocapteurs SPR utilisent les changements d’angles SPR pour surveiller les interactions intermoléculaires en temps réel19,20. La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une technique d’analyse des interactions biomoléculaires en détectant les changements de taille, de charge et de couche d’hydratation des biomolécules causés par la liaison. Il enregistre les changements de fluorescence dans la région irradiée par un laser infrarouge à l’intérieur de l’échantillon avant, pendant et après l’allumage du laser, ce qui permet des déterminations relativement rapides21. L’interférométrie de biocouche (BLI) mesure les réactions de surface du capteur en suivant les changements de déplacement dans le spectre de l’interférométrie. Dans les expériences BLI, une molécule est immobilisée à la surface d’un capteur submersible pour détecter une autre molécule qui peut se lier à elle. L’interaction de liaison induit un déplacement d’interférence, et le suivi en temps réel de ce changement de déplacement donne la courbe de liaison22. La titration calorimétrie isotherme (ITC) quantifie les interactions biomoléculaires en mesurant directement la chaleur libérée ou absorbée lors de la liaison biomoléculaire. Il fournit des informations thermodynamiques complètes sur les interactions moléculaires23. Par rapport à ces technologies d’interaction moléculaire, DSF a des exigences moindres en matière d’instruments, de consommables et de techniques d’exploitation. Il peut détecter efficacement les interactions entre les composés et les protéines dans la plupart des laboratoires.
Le mode opératoire de la technologie DSF est relativement simple. Initialement, des échantillons de substance blanche, des tampons de réaction, des colorants fluorescents et des ligands candidats sont combinés dans un système réactionnel. Ce système est ensuite transféré vers un instrument de PCR de fluorescence où les conditions de chauffage et de détection pour la détermination de la fluorescence sont mises en place24,25. Le colorant protéique le plus couramment utilisé pour la DSF est actuellement le colorant orange, et l’instrument de détection est généralement un instrument de PCR quantitative à fluorescence26. Cependant, en raison de la longueur d’onde d’excitation du colorant orange de 470 nm et de la longueur d’onde d’émission de 570 nm, tous les instruments de PCR quantitative par fluorescence sur le marché ne sont pas parfaitement adaptés. Par conséquent, cette étude adopte un lecteur de microplaques fluorescent comme nouvel instrument de détection pour explorer les interactions protéine-ligand.
Cette approche offre deux avantages principaux par rapport à la DSF utilisant un instrument de PCR quantitative fluorescente. Tout d’abord, la gamme de longueurs d’onde du marqueur enzymatique fluorescent peut être personnalisée, ce qui la rend plus compatible avec la gamme de longueurs d’onde du colorant et garantit une détection de fluorescence plus précise. Deuxièmement, le programme d’un instrument de PCR quantitative en fluorescence ne peut pas être arrêté une fois lancé, ce qui rend difficile le dépannage de tout problème pendant le processus de chauffage. En revanche, un lecteur de microplaques fluorescent permet d’éliminer les interférences en modifiant de manière itérative le rapport du système et les conditions de détection tout au long du processus de détection. Cependant, l’utilisation d’un lecteur de microplaques fluorescent pour le DSF présente également certains inconvénients, notamment la quantité relativement importante d’échantillon requise, allant généralement de 50 à 200 μL, alors que le DSF traditionnel utilise généralement 20 à 25 μL d’échantillon.
Dans cet article, la validation de la DSF basée sur un lecteur de microplaques fluorescentes a été effectuée pour détecter Tm à l’aide de la protéine CD40 et de l’ombellifère dans la gamme de concentration de 5 à 20 μg/mL. Les résultats ont démontré la spécificité et la précision élevées de la méthode, affirmant son aptitude à la détection de la Tm. La comparaison ultérieure des résultats de détection de Tm à différentes concentrations d’échantillon a révélé une tendance à la baisse de la valeur Tm de la protéine CD40 à mesure que la concentration augmentait, ce qui suggère un effet potentiel de la concentration sur la détection de Tm (figure 3). De plus, l’étude a détecté une augmentation de la valeur Tm de la protéine CD40 après l’ajout d’ombelliférone au système par rapport à avant l’ajout. Cela indique que l’ombellifère possède la capacité de se lier à la protéine CD40, ce qui entraîne une amélioration de la stabilité thermique de la protéine CD40 lors de leur combinaison (Figure 3).
Les étapes critiques du protocole ont été identifiées comme étant les étapes 2.7 à 2.16, dont la réussite influence directement la détection ultérieure de la fluorescence des protéines. En résumé, cette étude a établi une nouvelle méthode de détection de la DSF basée sur les principes de la technologie DSF, en utilisant la protéine CD40 et l’ombelliférone comme exemple. La méthode a analysé efficacement la force de liaison entre les protéines et les ligands à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescent. De plus, cette technique peut être étendue à l’analyse de la stabilité des protéines et à la recherche sur la structure des protéines, approfondissant ainsi l’application de la technologie DSF dans l’étude des voies de signalisation cellulaire et l’exploration de la pathogenèse des maladies.

Vicatia thibetica H. Boissieu, plante de la famille des ombellifères, est couramment utilisée en médecine tibétaine et représente l’un des composants essentiels des cinq ingrédients de base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., et Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Principalement distribuée dans le sud-ouest de la Chine, comme le nord-ouest du Yunnan, l’ouest du Sichuan, le Tibet et d’autres régions, sa racine séchée sert de substitut local à l’angélique1. La racine, connue pour son parfum, est souvent utilisée comme assaisonnement pour ragoût, et les feuilles, appelées céleri tibétain, contribuent à des plats délicieux. Ainsi, Vicatia thibetica a une importance non seulement en tant que plante médicinale unique, mais aussi en tant que source de nourriture au Tibet.
Des recherches nationales et internationales indiquent que Vicatia thibetica possède des propriétés de reconstitution du sang et de revigoration du qi (puissance ou énergie), bénéfiques pour réguler les menstruations. Il est utilisé pour traiter les symptômes de la dysménorrhée menstruelle irrégulière causée par des palpitations et une carence sanguine, présentant des effets pharmacologiques tels que la régulation antioxydante de l’immunité corporelle2. L’extrait alcoolique de Vicatia thibetica a démontré sa capacité à restaurer la masse corporelle et l’indice d’organe chez des souris immunodéprimées induites par le cyclophosphamide. De plus, il augmente l’activité de la superoxyde dismutase dans le sérum et réduit la teneur en malondialdéhyde, suggérant une amélioration de la capacité antioxydante et un effet équilibrant sur la peroxydation lipidique 2,3. Simultanément, il augmente le nombre de cellules sanguines et l’hémoglobine, ce qui reflète non seulement objectivement la fonction hématopoïétique de l’organisme, mais joue également un rôle crucial dans le système immunitaire 2,3.
L’ombellifère, caractérisée par des cristaux aciculaires et un goût amer, possède un faible poids moléculaire, est volatile et peut être distillée à la vapeur. Il se sublime facilement, a une faible solubilité dans l’eau et une solubilité élevée dans la matière organique. En tant que l’un des principaux composants chimiques de Vicatia thibetica, l’ombelliférone présente des effets immunomodulateurs sur l’immunité cellulaire, l’immunité humorale et l’immunité non spécifique dans les modèles murins d’immunosuppression induite par l’hydrocortisone 4,5.
La molécule de surface cellulaire CD40, membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale, est largement exprimée dans les cellules immunitaires6. Son ligand homologue, CD154, également connu sous le nom de CD40L, est une protéine transmembranaire de type II exprimée par les lymphocytes T activés. L’activation de CD40 a la capacité de réguler à la hausse l’expression des molécules co-stimulatrices à la surface des cellules dendritiques (DC) et des monocytes. Ce processus favorise la fonction de présentation de l’antigène des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et active davantage les lymphocytes T CD8+7.
Les macrophages jouent un rôle crucial dans la formation et la régulation du microenvironnement tumoral, et l’activation de CD40 peut améliorer le remodelage du microenvironnement tumoral par les macrophages8. L’activation du signal CD40 influence significativement la prolifération et l’activation des lymphocytes B. Les lymphocytes B, lorsqu’ils sont activés par CD40, peuvent fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigènes efficaces. Ils présentent des antigènes, génèrent une activité des lymphocytes T effecteurs et contribuent ainsi aux effets antitumoraux9. De plus, l’activation de CD40 dans les cellules tumorales peut induire l’apoptose et inhiber la croissance tumorale10. CD40 transduit principalement les signaux en contrôlant l’activité des protéines kinases tyrosine non réceptrices, notamment Lyn, Fyn, Syk et autres. De plus, il a la capacité de stimuler les protéines Bcl-xL, Cdk4 et Cdk6, d’activer les facteurs de transcription Rel/NF-kB et de phosphoryler CG-2 et PI3K10.
La méthode de fluorescence différentielle à balayage (DSF) est largement utilisée pour évaluer l’impact de diverses conditions environnementales, telles que la composition du tampon, la température et les ligands de petites molécules, sur la stabilité thermique des structures protéiques. Le colorant couramment utilisé pour le DSF est un colorant hydrophobe orange, sensible à l’environnement. Dans des conditions normales, la structure de la protéine est repliée, dissimulant son segment hydrophobe à l’intérieur. À mesure que la température augmente, la région hydrophobe de la protéine devient plus exposée, ce qui entraîne une dégradation progressive de la structure naturelle de la protéine. Le colorant se lie sélectivement à cette partie protéique exposée, amplifiant ainsi sa fluorescence. Les valeurs Tm sont ensuite calculées en surveillant les modifications de la détection du signal de fluorescence11. Dans une certaine mesure, les variations des valeurs Tm peuvent évaluer les changements dans la stabilité des protéines dus à des mutations, des changements dans les tampons ou la liaison aux ligands. De plus, il peut indiquer des altérations structurelles au cours du processus de repliement des protéines12. Cette approche offre des données précises, une large plage de températures, une sensibilité élevée et une perte minimale d’échantillons de protéines13.
Dans cette étude, la détermination de la fluorescence a été effectuée à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescentes au lieu d’un appareil d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en fluorescence. Cette modification permet la détection de la DSF dans les laboratoires dépourvus d’un instrument de PCR quantitative fluorescente, ce qui rend la méthode moins complexe et réduit les étapes nécessaires à la configuration de l’instrument, simplifiant ainsi le processus expérimental. Cependant, cette approche présente certains inconvénients. Au fur et à mesure que la complexité est réduite, la procédure devient plus lourde. La détection manuelle de la fluorescence à différentes températures est nécessaire, et la collecte automatique et continue de la fluorescence du système ne peut pas être réalisée. Ainsi, cette étude a utilisé la technique DSF pour explorer l’interaction entre la protéine CD40 et l’ombellifère, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires de la médecine tibétaine.

<table><tbody><tr><td>Protéine CD40</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P75408</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation 3 lecteur de microplaques multifonctionnel</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>FlexStation 3</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel OriginPro 8</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate ( 1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 7.1</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>SoftMax Pro 7.1</td><td></td></tr><tr><td>SSYPRO colorant orange</td><td>Sigma</td><td>S5942</td><td></td></tr><tr><td>Umbelliferone</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td><td>Réf. B21854</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de l’interaction protéine-ombellifère cd40 par fluorescence différentielle

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

L’étude des interactions entre différentes molécules est un aspect crucial de la compréhension de la pathogenèse des maladies et du dépistage de cibles médicamenteuses. L’ombelliférone, un ingrédient actif de la médecine tibétaine Vicatia thibetica, présente un effet immunomodulateur avec un mécanisme inconnu. La protéine CD40 est une cible clé de la réponse immunitaire. Par conséquent, cette étude utilise le principe de la technologie de fluorescence à balayage différentiel pour analyser les interactions entre la protéine CD40 et l’ombelliférone à l’aide de marqueurs enzymatiques fluorescents. Initialement, la stabilité de la protéine orange fluorescent a été vérifiée expérimentalement et le rapport de dilution optimal de 1:500 a été déterminé. Par la suite, il a été observé que la valeur de fusion à la température (Tm) de la protéine CD40 avait tendance à diminuer avec une augmentation de la concentration. Il est intéressant de noter que l’interaction entre la protéine CD40 et l’ombelliférone améliore la stabilité thermique de la protéine CD40. Cette étude représente la première tentative de détection du potentiel de liaison de composés et de protéines à petites molécules à l’aide de microplaques de fluorescence et de colorants fluorescents. La technique se caractérise par une sensibilité et une précision élevées, ce qui promet des avancées dans les domaines de la stabilité des protéines, de la structure des protéines et des interactions protéine-ligand, facilitant ainsi la poursuite de la recherche et de l’exploration.

Le colorant orange a toujours montré une excitation de fluorescence stable à Ex = 470 nm et Em = 570 nm, à la fois à température ambiante et à des températures élevées. Un taux de dilution optimal de 1:500 a été déterminé (figures 2A, B). La détection de la valeur Tm s’est avérée difficile lorsque la concentration de protéine CD40 était inférieure à 15 μg/mL (figures 3A,B). Cependant, à une concentration de 15 μg/mL, une valeur Tm stable de 51,82 °C était détectable, qui a diminué à 45,79 °C avec une augmentation de la concentration en protéine CD40 (figures 3C et D).

Comme le montre la figure 3, il est évident que la liaison de la protéine CD40 à l’ombelliférone influence la valeur Tm de la protéine CD40. Plus précisément, les valeurs Tm de la protéine CD40 à des concentrations de 15 μg/mL et de 20 μg/mL, ainsi que de l’ombellifère de 10 μM, ont augmenté à 62,08 °C et 65,27 °C, respectivement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig1.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Organigramme du processus d’enregistrement de la capacité de liaison de la protéine CD40 à l’ombelliférone selon le principe DSF à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig2.jpg"> Figure 2 : Criblage des taux de dilution des colorants orange et des tests de stabilité. (A) Stabilité à la fluorescence des colorants avec différents taux de dilution à température ambiante. (B) Stabilité à la fluorescence des colorants avec un rapport de dilution de 1:500 à 35-95 °C. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± MEB, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig3.jpg"> Figure 3 : Graphiques de résultats de l’utilisation d’un lecteur de microplaques fluorescent pour enregistrer la capacité de liaison de la protéine CD40 à l’ombelliférone selon le principe de la DSF. (A-D) Profils Tm de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL de protéine CD40 et CD40 + 10 μM d’ombelliférone, respectivement. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± MEB, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit une méthode unique de détection de la liaison entre les composés et les molécules de protéines, offrant les avantages d’une perte minimale d’échantillons de protéines et d’une grande précision des données.

Détection de l’interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Notre protocole offre un avantage significatif en permettant une utilisation sans équipement spécialisé. Contrairement aux méthodes traditionnelles de PCR quantitative par fluorescence, elle simplifie le processus expérimental, nécessitant moins d’étapes et réduisant la complexité globale, ce qui le rend plus sûr et plus facile à réaliser. Cette expérience nécessite que l’opérateur soit très familier avec le procédé expérimental et le lecteur de microplaques fluorescentes, et qu’il ne perde pas trop de temps lors du chauffage de la solution et de la détection de fluorescence.Nous nous concentrerons sur le mécanisme moléculaire par lequel l’ombellifère se lie à la protéine CD14 pour produire des effets immunitaires.

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