Name: Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez la construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules lipidiques nanométriques et micrométriques. Cette méthode permet de créer des cellules synthétiques capables de croissance autonome.

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Les auteurs remercient Aditya Iyer pour le clonage du gène pBAD-PercevalHR et Gea Schuurman-Wolters pour son aide à la production et à la purification des protéines. La recherche a été financée par le programme de gravitation du NWO « Building a Synthetic Cell » (BaSyC).

Protocole d’encapsulation de vésicules lipidiques pour des réseaux protéiques complexes

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Nous présentons un protocole pour la synthèse de protéines (membranaires) contenant des vésicules lipidiques de taille submicrométrique (proteoLUVs), et la conversion de proteoLUVs en vésicules géantes-unilamellaires (proteoGUVs). Le protocole devrait être applicable à la reconstitution d’autres protéines membranaires 13,19,30,40 et à l’encapsulation de réseaux métaboliques autres que les voies de dégradation de la L-arginine et de synthèse du glycérol 3-phosphate présentées ici.
La reconstitution des protéines membranaires dans les liposomes donne généralement une orientation aléatoire des protéines à l’intérieur de la membrane lipidique. Pour ArcD et Glpt, l’orientation n’a pas d’importance, car les protéines fonctionnent de manière bidirectionnelle et les solutés se déplacent en fonction du signe du potentiel électrochimique total. Pour les protéines qui fonctionnent dans une direction, la moitié des molécules ne seront pas disponibles pour l’activité lorsque leur orientation est de 50/50.
L’extrusion des vésicules à travers un filtre en polycarbonate rétrécit la distribution granulométrique, et les vésicules deviennent plus homogènes à mesure que la taille des pores des filtres est petite. Cependant, les vésicules plus petites se font au prix d’un volume plus petit et donc, d’un très petit nombre de protéines (enzymes, protéines membranaires) par vésicule. Pour minimiser la fraction de LUV ayant un ou plusieurs composants manquants, la concentration des protéines peut être ajustée comme le montre la figure 3A,B, mais avec de très petites vésicules, les effets stochastiques sont inévitables.
La méthode de gonflement assisté par gel repose sur le dépôt de vésicules soniquées (SUV) sur une surface d’agarose séchée. Au cours du processus de séchage, un gradient de concentration de vésicules se forme et la concentration en lipides est la plus élevée à la périphérie de la tache. Cela est dû à un phénomène connu sous le nom d’effet de tache de café41,42. En conséquence, seule une petite région de la tache contient une concentration de lipides adaptée à la formation de GUV. Les taches lipidiques circulaires inégales et concentrées entraînent de grandes zones inutilisées qui ne sont pas disponibles pour la fusion des vésicules ; par conséquent, l’efficacité de la formation de GUV devient faible dans cette approche. Pour augmenter le rendement des GUV, il faut viser un dépôt lipidique uniforme, ce qui peut être réalisé en appliquant un revêtement par centrifugation42 ou en tirant parti de l’effet de coloration au café41.
Autres notes sur le protocole :
Il faut veiller à ce que plusieurs protéines membranaires (>10) soient reconstituées en moyenne par vésicule pour éviter les effets stochastiques. Ainsi, évitez les rapports lipides/protéines supérieurs à 400:1 p/p. Une orientation aléatoire est supposée pour la plupart des protéines.
Idéalement, le volume des protéines membranaires totales est aussi petit que possible et ne dépasse de toute façon pas 10 à 20 % du volume des liposomes. L’ajout de plus grands volumes introduira plus de détergent et la majorité des liposomes préformés peuvent se lyser, ce qui peut avoir un effet négatif sur l’efficacité de la reconstitution.
Le pré-équilibrage de l’extrudeuse avec la solution appropriée est important pour éviter la dilution des composants lors de l’encapsulation. Idéalement, la solution de prééquilibrage devrait également contenir les enzymes solubles, mais l’inclusion d’enzymes peut être trop coûteuse en raison du volume relativement important nécessaire à la pré-équilibrage de l’extrudeuse. Par conséquent, nous omettons généralement ces composants et acceptons une dilution de 5% des enzymes.
Des ionophores doivent être ajoutés aux mélanges contenant des protéoliposomes car les molécules sont très hydrophobes et peuvent s’adsorber sur les surfaces si les vésicules ne sont pas présentes. Il faut veiller à ce que le volume de solvant ajouté soit faible (<1 % du volume total de la réaction). Des contrôles sont effectués pour vérifier que les solvants n’affectent pas les réseaux métaboliques dans les vésicules. Des concentrations d’ionophores d’environ 1 μM sont généralement sans danger pour des concentrations de lipides totaux de ~3 mg/mL.
Il faut prendre soin de bien sécher les gouttelettes. Si les gouttelettes ne sont pas assez sèches, la formation de GUV est moins efficace car les lipides formeront des agrégats de lipides et des MLV peuvent se former lorsque la solution gonflante est ajoutée.
Le glucose est utilisé pour faire correspondre l’osmolarité du milieu externe au milieu interne ; ce dernier contient du saccharose à la place du glucose pour augmenter la densité des vésicules et ainsi faciliter la sédimentation des GUVs. De plus, le glucose dans l’environnement extérieur améliore le contraste de phase, ce qui rend la vésicule plus facilement visible.
Les effets stochastiques sont beaucoup moins problématiques avec les GUV ; Mais ici, le rapport surface/volume peut devenir inacceptablement bas, de sorte que le nombre de protéines membranaires (par exemple, les transporteurs) devient limitant pour le réseau métabolique interne. La méthode décrite dans ce protocole ne permet pas un contrôle précis de la taille des proteoGUVs, mais la majorité se situe dans la gamme de taille de 5 à 50 μm.
En conclusion, les travaux présentés ici fournissent un aperçu complet de la reconstitution des protéines membranaires et de l’encapsulation enzymatique dans des vésicules lipidiques de tailles variables. Nous démontrons la construction de vésicules fonctionnelles pour la synthèse de l’ATP et des blocs de construction à partir de précurseurs simples tels que les acides aminés et le glycérol. La reconstitution des protéines membranaires dans les GUV reste un défi, mais les protocoles présentés ici ouvrent la voie à de nouveaux développements dans la recherche en biologie synthétique ascendante.

Le domaine de la biologie synthétique ascendante se concentre sur la construction de cellules (minimales) 1,2 et de bioréacteurs métaboliques à des fins biotechnologiques 3,4 ou biomédicales 5,6,7,8. La construction de cellules synthétiques fournit une plate-forme unique qui permet aux chercheurs d’étudier les protéines (membranaires) dans des conditions bien définies imitant celles des environnements natifs, permettant la découverte de propriétés émergentes et de fonctions biochimiques cachées des protéines et des réseaux de réactions9. En tant qu’étape intermédiaire vers une cellule synthétique fonctionnant de manière autonome, des modules sont développés qui capturent les caractéristiques essentielles des cellules vivantes telles que la conservation de l’énergie métabolique, la synthèse des protéines et des lipides et l’homéostasie. De tels modules améliorent non seulement notre compréhension de la vie, mais ont également des applications potentielles dans les domaines de la médecine8 et de la biotechnologie10.
Les protéines transmembranaires sont au cœur de pratiquement tous les réseaux métaboliques, car elles transportent des molécules à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule, signalent et répondent à la qualité de l’environnement et jouent de nombreux rôles biosynthétiques. Ainsi, l’ingénierie de modules métaboliques dans des cellules synthétiques nécessite dans la plupart des cas la reconstitution de protéines membranaires intégrales et/ou périphériques en une bicouche membranaire composée de lipides spécifiques et d’une grande intégrité (faible perméabilité). La manipulation de ces protéines membranaires est un défi et nécessite des connaissances spécifiques et des compétences expérimentales.
Plusieurs méthodes ont été développées pour reconstituer des protéines membranaires au sein des vésicules phospholipidiques, le plus souvent dans le but d’étudier la fonction11,12, la régulation13, les propriétés cinétiques14,15, la dépendance lipidique15,16 et/ou la stabilité17 d’une protéine spécifique. Ces méthodes impliquent la dilution rapide des protéines solubilisées au détergent dans un milieu aqueux en présence de lipides18, l’élimination des détergents par incubation de protéines solubilisées au détergent avec des vésicules lipidiques déstabilisées par le détergent et l’absorption du ou des détergents sur des billes de polystyrène19, ou l’élimination des détergents par dialyse ou chromatographie d’exclusion stérique20. Des solvants organiques ont été utilisés pour former des vésicules lipidiques, par exemple, via la formation d’interphases huile-eau21, mais la majorité des protéines membranaires intégrales sont inactivées lorsqu’elles sont exposées à de tels solvants.
Dans notre laboratoire, nous reconstituons principalement les protéines membranaires par la méthode d’absorption détergente pour former de grandes vésicules unilamellaires (LUVs)19. Cette méthode permet la co-reconstitution de plusieurs protéines membranaires et l’encapsulation dans la lumière vésiculaire d’enzymes, de métabolites et de sondes22,23. Les LUV contenant des protéines membranaires peuvent être convertis en vésicules unilamellaires géantes (GUV) avec/sans encapsulation de composants solubles dans l’eau, en utilisant soit l’électroformation24, soit le gonflement assisté par gel25 et des conditions spécifiques pour préserver l’intégrité des protéines membranaires26.
Cet article présente un protocole pour la reconstitution dans les LUV d’un réseau métabolique hors équilibre qui régénère l’ATP par la décomposition de la L-arginine en L-ornithine27. La formation d’ATP est couplée à la production de glycérol-3-phosphate (G3P), un élément constitutif important pour la synthèse des phospholipides22,28. La voie métabolique se compose de deux protéines membranaires intégrales, une arginine/ornithine (ArcD) et un antiporteur G3P/Pi (GlpT). De plus, trois enzymes solubles (ArcA, ArcB, ArcC) sont nécessaires au recyclage de l’ATP, et GlpK est utilisé pour convertir le glycérol en glycérol 3-phosphate, en utilisant l’ATP issu de la dégradation de la L-arginine, voir la figure 1 pour une vue d’ensemble schématique de la voie. Ce protocole représente un bon point de départ pour la construction future de réseaux réactionnels encore plus complexes, pour la synthèse de lipides ou de protéines ou la division des cellules. La composition lipidique des vésicules soutient l’activité d’une grande variété de protéines membranaires intégrales et a été optimisée pour le transport de diverses molécules dans ou hors des vésicules 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la voie de production de l’ATP et de la synthèse et de l’excrétion du glycérol 3-phosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
En bref, des protéines membranaires purifiées (solubilisées dans du dodécyl-β-D-maltoside, DDM) sont ajoutées à des vésicules lipidiques préformées qui ont été déstabilisées avec Triton X-100, ce qui permet l’insertion des protéines dans la membrane. Les molécules de détergent sont ensuite (lentement) éliminées par l’ajout de billes de polystyrène activées, ce qui entraîne la formation de protéoliposomes bien scellés. Des composants solubles peuvent ensuite être ajoutés aux vésicules et encapsulés via des cycles de gel-dégel, ce qui piège les molécules dans le processus de fusion membranaire. Les vésicules obtenues sont très hétérogènes et beaucoup sont multilamellaires. Ils sont ensuite extrudés à travers un filtre en polycarbonate avec une taille de pores de 400, 200 ou 100 nm, ce qui donne des vésicules de taille plus uniforme ; Plus la taille des pores est petite, plus les vésicules sont homogènes et unilamellaires, mais au prix d’un volume interne plus petit. Les protéines non incorporées et les petites molécules sont éliminées de la solution externe par chromatographie d’exclusion stérique. Les proteoLUV peuvent être convertis en vésicules de taille micrométrique par gonflement assisté par gel, et ces proteoGUVs sont ensuite collectés et piégés dans une puce microfluidique pour la caractérisation et la manipulation microscopiques. La figure 2 présente une vue d’ensemble schématique de l’ensemble du protocole.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble du protocole de reconstitution des protéines membranaires et d’encapsulation d’enzymes et de composants hydrosolubles dans des vésicules lipidiques submicrométriques (LUV) et micrométriques (GUV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les protocoles de reconstitution et d’encapsulation fonctionnent bien et la fonctionnalité des protéines est conservée, mais les proteoLUVs et les proteoGUVs sont de taille hétérogène. Les approches microfluidiques31,32 permettent la formation de vésicules de taille micrométrique de taille plus homogène, mais la reconstitution fonctionnelle des protéines membranaires n’est généralement pas possible car le solvant résiduel dans la bicouche inactive les protéines. La taille des protéoLUV varie de 100 à 400 nm, et à de faibles concentrations d’enzymes, l’encapsulation peut conduire à des vésicules avec des voies métaboliques incomplètes (effets stochastiques ; voir Figure 3). Les LUV sont idéaux pour construire des modules métaboliques spécifiques, comme le montre ici la production d’ATP et de blocs de construction comme le G3P. De tels protéoLUV peuvent potentiellement être encapsulés dans des GUV et servir de compartiments semblables à des organites pour les vésicules hôtes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Figure 3 : Nombre de molécules par vésicule d’un diamètre de 100, 200 ou 400 nm. (A) Lorsque les protéines encapsulées (enzymes, sondes) sont dans la gamme de 1 à 10 μM. (B) La reconstitution se fait à 1 à 1 000, 1 à 10 000 et 1 à 100 000 protéines membranaires par lipide (mol/mol). Nous faisons l’hypothèse que les molécules sont encapsulées aux concentrations indiquées et incorporées dans la membrane à ces ratios protéines/lipides. Pour certaines enzymes, nous avons vu qu’elles se lient aux membranes, ce qui peut augmenter leur concentration apparente dans les vésicules. Abréviation : LPR = Lipid-Protein-Ratio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de coupure Amicon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore unités de filtre centrifuge Amicon Ultra&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Produits chimiques fins</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td> <td>Formedium-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Saccharose</td> <td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp ;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Extrudeuse Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Jasco</td><td>Spectrofluoreur FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Colonne d’écoulement par gravité</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton 100 &micro ; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton seringue 1000 & micro ; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur LCP portable</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur portable</td><td>Hielscher Technologie d’échographie</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Grande centrifugeuse à tube Falcon</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Laser Scanning Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Puce microfluidique</td><td>Maison&nbsp ;</td>DOI <td>basé sur PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre Nanodrop</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 Spectrophotomètre NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles pour GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Aiguilles pour microfluidique</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Osmolalmètre</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 point de congélation de base osmomètre</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Filtre en polycarbonate</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membrane Produit : 10417104</td><td>0.4 &micro ; m</td></tr><tr><td>Tube ultracentrifuge en polycarbonate</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette en quartz (noir)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 résine&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Matériaux INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 & micro ; m</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Entretoise en téflon</td><td>Fait maison&nbsp ;</td><td>À base de téflon</td><td>45 x 26 x 1,5 ou 45 x 26 x 3 ou 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spectromètre</td><td>Jasco</td><td>V730 spectrophotomètre</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence grand champ</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Caséine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Nous présentons une méthode pour incorporer dans les vésicules des réseaux de protéines complexes, impliquant des protéines membranaires intégrales, des enzymes et des capteurs basés sur la fluorescence, en utilisant des composants purifiés. Cette méthode est pertinente pour la conception et la construction de bioréacteurs et l’étude de réseaux de réactions métaboliques complexes hors équilibre. Nous commençons par reconstituer des protéines membranaires (multiples) en grandes vésicules unilamellaires (LUV) selon un protocole préalablement développé. Nous encapsulons ensuite un mélange d’enzymes purifiées, de métabolites et de capteurs basés sur la fluorescence (protéines fluorescentes ou colorants) par congélation-décongélation-extrusion et éliminons les composants non incorporés par centrifugation et/ou chromatographie d’exclusion stérique. La performance des réseaux métaboliques est mesurée en temps réel en surveillant le rapport ATP/ADP, la concentration en métabolites, le pH interne ou d’autres paramètres par lecture de fluorescence. Nos vésicules contenant des protéines membranaires de 100 à 400 nm de diamètre peuvent être converties en vésicules unilamellaires géantes (GUV), en utilisant des procédures existantes mais optimisées. L’approche permet d’inclure des composants solubles (enzymes, métabolites, capteurs) dans des vésicules de taille micrométrique, augmentant ainsi le volume des bioréacteurs de plusieurs ordres de grandeur. Le réseau métabolique contenant les GUVs est piégé dans des dispositifs microfluidiques pour être analysé par microscopie optique.

La reconstitution des protéines membranaires solubilisées dans les liposomes nécessite la déstabilisation des vésicules préformées. L’ajout de faibles quantités de Triton X-100 entraîne initialement une augmentation de l’absorbance à 540 nm (A540) en raison d’une augmentation de la diffusion de la lumière par le gonflement des vésicules (Figure 4). La valeur maximale de A540 est le point où les liposomes sont saturés de détergent (Rsat), après quoi tout ajout supplémentaire de Triton X-100 entraînera une solubilisation partielle des vésicules. À Rsol, les liposomes sont complètement solubilisés (Figure 4). Pour la reconstitution des protéines membranaires, on utilise typiquement des vésicules déstabilisées à 60% au-delà de Rsat (indiqué par une flèche).
La protéine membranaire reconstituée ArcD est utilisée pour transporter la L-arginine dans les vésicules et la L-ornithine hors des vésicules et est utilisée avec les enzymes encapsulées ArcA, ArcB et ArcC pour recycler l’ATP de l’ADP et du phosphate inorganique. Le GlpT est un antiporteur du glycérol 3-phosphate/phosphate qui, avec le GlpK, est nécessaire à la synthèse (et à l’excrétion) du glycérol 3-phosphate à partir du glycérol et de l’ATP produit par la dégradation de la L-arginine. L’ajout de 5 mM de L-arginine à t = 0 aux protéoliposomes entraîne une forte augmentation du rapport de fluorescence PercevalHR à 500 et 430 nm d’excitation39, ce qui reflète le rapport ATP/ADP à l’intérieur des vésicules (Figure 5). Lors de l’ajout de glycérol, l’ATP est utilisé pour la synthèse du glycérol 3-phosphate, ce qui entraîne une diminution du rapport ATP/ADP28. La dégradation de la L-arginine entraîne également des changements de pH, qui peuvent être quantifiés à l’aide de la pyranine ou de la pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Figure 5 : Recyclage de l’ATP par la voie de dégradation de la L-arginine. Les LUV à 2,7 mg de lipides/mL sont placés dans une cuvette et le rapport de fluorescence à 500 nm et 430 nm est enregistré. 5 mM de L-arginine sont ajoutés à t = 0. Le rapport F500/F430 est une mesure du rapport ATP/ADP à l’intérieur des vésicules. Abréviation : LUVs = grandes vésicules unilamellaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les LUV produisant de l’ATP peuvent également être utilisés pour former des GUV. La réhydratation de protéo-LUV séchés sur un gel d’agarose LGT entraîne la formation de vésicules de taille micrométrique (Figure 6). La formation de protéo-GUVs dans les taches de LUV séchées dépend fortement de la concentration locale en lipides et du degré de déshydratation. Certaines zones ont de grandes taches de GUV, tandis qu’à d’autres endroits dans la même gouttelette, il n’y a pas ou peu de GUV peuvent être formés. La formation de GUV par gonflement assisté par l’agarose LGT entraîne une gamme de tailles de GUV, généralement de quelques micromètres à plus de 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Figure 6 : Images DIC des proteoGUVs formés par gonflement assisté par gel. Barre d’échelle = 25 μm. Abréviations : DIC = contraste interférentiel différentiel ; GUVs = vésicules géantes-unilammellaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les GUV sont récoltés et piégés dans un dispositif microfluidique à base de PDMS passivé à la caséine β (Figure 7). L’appareil est conçu de manière à ce que de nombreuses vésicules puissent être piégées et analysées au sein d’une seule expérience, et l’appareil est utilisé pour contrôler l’environnement externe (débit, composition du tampon, etc.) 34. Même lorsque le rendement des protéo-GUVs est faible, le flux constant de GUVs à travers la puce microfluidique permet de collecter de nombreuses vésicules. Une fois qu’un nombre suffisant de GUV sont piégés, le système est lavé avec un tampon osmotiquement équilibré pour éliminer les composants externes tels que les protéines solubles, les petites molécules et les sondes fluorescentes. Le tampon de lavage est ensuite remplacé par une solution de substrat d’osmolalité égale contenant 50 mM KPi (pH 7,0), des quantités variables de glucose (pour ajuster l’osmolalité) et des substrats tels que 10 mM de L-arginine. Une expérience de séries temporelles est réalisée sur plusieurs pièges de la puce microfluidique et des images sont prises toutes les 90 s (excitation 405 nm et 488 nm lorsque PercevalHR est utilisé). De plus, une image en fond clair est prise à chaque point temporel. Le rapport des intensités d’émission après excitation à 488 et 405 nm est une mesure du rapport ADP/ATP dans les vésicules.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Figure 7 : Piégeage des vésicules avec la puce microfluidique. (A) Piégeage des vésicules, accompagné de la capacité de contrôler l’environnement extérieur et le débit. (B) ProteoGUVs piégés dans un dispositif microfluidique et excités avec un laser de 405 nm (vert) et un laser 488 (rouge). L’émission des deux canaux est mesurée à &gt;500 nm. L’image en fond clair permet de visualiser les vésicules sans fluorescence. Barre d’échelle = 25 μm. Abréviation : GUVs = vésicules géantes-unilamellaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons un protocole pour reconstituer les protéines membranaires et encapsuler des enzymes et d’autres composants solubles dans l’eau dans des vésicules lipidiques de taille submicrométrique et micrométrique.

Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Aux Pays-Bas, le consortium BaSyC vise à construire des cellules synthétiques à partir de composants moléculaires. Le consortium BaSyC est composé de groupes de recherche allant de la biologie moléculaire à la chimie, en passant par la physique et les sciences informatiques. L’objectif de ce consortium est de créer un système auto-réplicatif capable de croissance autonome, de transmission d’informations et de division.Et nous nous concentrons actuellement sur la construction de réseaux moléculaires qui sont intégrés vers des systèmes moléculaires plus complexes. Les développements récents en biologie synthétique comprennent l’ingénierie de modules pour les fonctions cellulaires, leur intégration dans des réseaux complexes pour des applications dans le diagnostic, la thérapie, l’immunologie synthétique et les matériaux adaptatifs. Ces progrès s’étendent à des groupes en Europe, en Amérique et en Asie, faisant progresser à la fois les approches descendantes et ascendantes de la construction de cellules synthétiques.Les technologies actuelles dans notre domaine comprennent les méthodes d’ingénierie et d’évolution pour construire et optimiser les réseaux métaboliques. Nous utilisons l’IA pour la sélection moléculaire et des techniques biochimiques et biophysiques avancées pour l’isolement des composants et la formation de réseaux. Nous utilisons également la reconstitution membranaire, l’encapsulation physique et la visualisation par spectroscopie fluorescente et microscopie.Avec l’intégration des modules, le nombre de protéines membranaires et d’enzymes augmente énormément, ce qui pose des contraintes sur nos technologies de reconstitution et d’encapsulation. L’encapsulation stochastique devient un problème avec les vésicules de taille submicronique, et l’efficacité de la formation de vésicules de taille micrométrique diminue lorsque plusieurs protéines membranaires sont reconstituées dans la membrane lipidique. À Groningue, nous avons développé des réseaux métaboliques pour la production d’ATP et le maintien d’un état de déséquilibre par l’alimentation en substrat et l’exportation de produits.De plus, nous avons lié le recyclage de l’ATP à la synthèse et à l’excrétion de précurseurs lipidiques, permettant aux vésicules secondaires de produire des lipides, ce qui constitue une avancée significative dans notre domaine.

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