Quantification de l’activité du système de sécrétion de Yersinia pseudotuberculosis de type III après une carence en fer et une croissance anaérobie

Les bactéries pathogènes utilisent des facteurs de virulence pour coloniser différentes niches au sein de l’organisme hôte. Nous cherchons à comprendre comment les agents pathogènes bactériens détectent des signaux environnementaux spécifiques dans les tissus de l’hôte pour réguler l’expression du facteur de virulence. L’agent pathogène humain Yersinia pseudotuberculosis utilise le facteur de virulence du système de sécrétion de type trois pour injecter des protéines effectrices dans les cellules hôtes.

Le système de sécrétion de type trois permet aux bactéries de subvertir les mécanismes de défense de l’hôte et de coloniser les tissus de l’hôte. Cependant, l’expression du système de sécrétion de Yersinia de type III est métaboliquement lourde, de sorte que l’expression des gènes du système de sécrétion de type trois est strictement régulée en réponse à des signaux environnementaux tels que la température. Nos publications précédentes ont montré que l’expression du système de sécrétion de Yersinia de type III est contrôlée par la disponibilité du fer et la tension de l’oxygène par le biais d’un facteur de transcription appelé ISCR.

Ces résultats sont significatifs car Yersinia colonise les tissus de l’hôte dont la teneur en fer et la tension de l’oxygène varient. Par exemple, la lumière intestinale contient suffisamment de fer pour la croissance de Yersinia, mais a une faible tension d’oxygène. En revanche, les tissus comme le sang ont une très faible disponibilité en fer mais une tension d’oxygène plus élevée.

Notre méthode nous permet de cultiver Yersinia dans des conditions de culture qui varient dans la quantité de fer et d’oxygène disponible, d’étudier comment ces signaux environnementaux affectent l’expression du système de sécrétion de type trois. Cette méthode nous aidera à déterminer le mécanisme moléculaire par lequel la disponibilité du fer et de l’oxygène contrôle l’expression du système de sécrétion de type trois, et nous aidera à comprendre comment cela contrôle l’issue de l’infection à Yersinia. Pour commencer, striez Yersinia Pseudo tuberculosis sur des plaques de gélose au bouillon de Lysogénie.

Incuber les plaques à température ambiante pendant 48 heures. Une fois que les colonies visibles se forment, inoculez une seule colonie isolée dans quatre millilitres de milieu M9. Cultivez-le pendant la nuit à 26 degrés Celsius avec une aération à 250 tr/min.

Placez une cuvette contenant la culture dans un spectromètre, puis diluez la culture dans 14 millilitres de milieu stérile chélaté M9 sans supplémentation en fer pour atteindre une valeur OD600 de 0,1. Placez les flacons dans un agitateur à 26 degrés Celsius et incubez pendant huit heures. Une fois l’incubation terminée, utilisez la culture pour démarrer trois nouvelles cultures ; deux pour la croissance anaérobie et un pour la croissance aérobie.

Pour la culture aérobie, diluer la culture à une valeur OD600 de 0,1 dans 14 millilitres de milieu chélaté M9 stérile sans supplémentation en fer. Ensuite, culture avec aération à 26 degrés Celsius pendant 12 heures. Pour la culture anaérobie, diluez la culture dans 14 millilitres de milieu M9 chélaté stérile dans deux tubes en verre lavé à l’acide.

Dans le premier tube, ajoutez du sulfate de fer stérilisé par filtre à une concentration finale d’un milligramme par litre. Dans le deuxième tube, ajoutez du sulfate de fer pour une concentration finale de 0,01 milligramme par litre. Incuber les deux tubes dans une chambre anaérobie à température ambiante pendant 12 heures.

Ensuite, induisez l’activité du système de sécrétion de type trois en déplaçant les cultures anaérobies à 37 degrés Celsius et en poursuivant l’incubation pendant quatre heures. Ensuite, diluez les cultures en croissance aérobie à une valeur OD600 de 0,2 en ajoutant 14 millilitres de milieu M9 chélaté dans deux flacons lavés à l’acide. Ajouter dans les flacons du sulfate de fer aux concentrations finales requises.

Incuber les deux flacons avec une aération à 26 degrés Celsius à 250 tr/min pendant deux heures. Après deux heures, déplacez les cultures à 37 degrés Celsius avec une aération à 250 tr/min pendant quatre heures pour induire l’activité du système de sécrétion de type trois. Après avoir induit le système de sécrétion de type trois chez Yersinia pseudotuberculosis, transférez des volumes normalisés de cette culture incubés dans des tubes de 15 millilitres.

Ajoutez quatre microlitres d’albumine sérique bovine dans chaque tube pour contrôler la précipitation des protéines. Centrifuger les cultures à 3 200 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Filtrez le surnageant dans un tube frais de 15 millilitres à l’aide d’un filtre PVDF de 0,22 micron fixé à une seringue.

Ensuite, ajoutez de l’acide trichloracétique équivalent à 10 % du volume surnageant. Agitez vigoureusement les tubes pendant une minute. Incuber les tubes sur de la glace dans une pièce froide à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de chaque échantillon dans un tube de deux millilitres, puis centrifugez à 21 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant à l’aide d’un accessoire d’aspiration. Répétez le pipetage de deux millilitres d’échantillon dans le même tube, centrifugez et aspirez le surnageant.

Consolidez les réactions de précipitation dans un seul tube de deux millilitres. Lavez les granulés avec un millilitre d’acétone 100 % glacé, suivi d’une centrifugation et d’une aspiration de surnageant. Après avoir retiré le surnageant pour la dernière fois, séchez la pastille sur le banc pendant une heure.

La protéine précipitée doit ressembler à une brume sur le côté du tube. Ensuite, remettre en suspension chaque pastille dans 50 microlitres de solution F-S-B-DTT. Agitez complètement pendant une minute.

Ensuite, faites bouillir les échantillons sur un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez brièvement à vitesse maximale à température ambiante. Chargez 15 microlitres de chaque échantillon anaérobie et 10 microlitres de chaque échantillon aérobie dans un gel SDS-PAGE à 12,5 % pour analyse.

Une fois l’exécution du gel terminée, utilisez la coloration à l’argent pour visualiser les protéines sur le gel. Pour commencer, placez un gel SDS-PAGE contenant des échantillons aérobies séparés de Yersinia pseudotuberculosis dans un système d’imagerie. Dans le logiciel, sélectionnez les bandes représentant la protéine effectrice du système de sécrétion de type trois, YopE, dans tous les puits.

Réglez la bande YopE de référence sur l’échantillon approprié. Exportez les valeurs de quantification relatives calculées par logiciel pour toutes les bandes YopE. Ensuite, sélectionnez toutes les bandes BSA dans tous les puits.

Assurez-vous que la bande BSA de référence correspond à l’échantillon de la bande YopE de référence. Exportez les valeurs de quantification relatives pour toutes les bandes BSA. Divisez la valeur YopE par la valeur BSA pour chaque condition afin d’obtenir des résultats normalisés.

Le gel SDS-PAGE coloré à l’argent a révélé que dans les échantillons anaérobies, 38 fois plus de YopE était présent dans les échantillons à faible teneur en fer par rapport aux échantillons à forte teneur en fer. Dans les échantillons aérobies, ces protéines ont été sécrétées en quantités presque similaires.