Name: Révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Découvrez l'induction de la ferroptose dans les cellules de médulloblastome pour développer de nouvelles thérapies pédiatriques. Cette méthode par cytométrie en flux évalue le potentiel thérapeutique contre les populations résistantes au traitement.

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Ce travail a été soutenu par le gouvernement de la Principauté de Monaco, ainsi que par le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer (GEMLUC) et la Fondation Flavien, qui ont fourni les moyens de l’achat de BD FACS Melody.

La présente étude a été menée à l’aide de lignées cellulaires de médulloblastome de type sauvage (WT) DAOY, qui ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un milieu DMEM complété par 8 % de FBS. La lignée cellulaire délétée xCT a été maintenue dans les mêmes conditions, avec des expériences réalisées dans des milieux complétés par 1 mM de N-acétylcystéine (NAC). Les cellules ont été régulièrement dépistées pour les mycoplasmes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et ont été cultivées jusqu’au 10e passage.
1. Récolte et ensemencement des cellules
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’aide de techniques aseptiques stériles dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. Les cellules du médulloblastome DAOY sont adhérentes, ce qui signifie que toutes les cellules non attachées peuvent être éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2+ et Mg2+.
<ol><li>Prenez la boîte de Pétri (boîte de Pétri de 100 mm de diamètre) avec les cellules et retirez les cellules flottantes et le milieu de la plaque à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Ajoutez 5 à 10 ml de PBS dans le plat, lavez le fond en effectuant des mouvements circulaires du plat, puis retirez le PBS de l’assiette à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de trypsine (dilution 10x) dans le plat. Incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Prenez 10 ml de milieu de culture DMEM complété par 8% de FBS et récoltez mécaniquement les cellules de la boîte.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml.</li>
	<li>Prélever 500 μL de suspension cellulaire et les mettre dans une cuvette pour le comptage. Comptez le nombre de cellules par mL de suspension cellulaire. Un compteur cellulaire automatisé a été utilisé pour cette étude (voir la Table des matières).</li>
	<li>Calculez le volume nécessaire à prélever de la suspension cellulaire pour avoir 1,00,000 cellules.</li>
	<li>Prenez une plaque à 6 puits et ajoutez le volume calculé de la suspension cellulaire dans chaque puits, puis ajoutez du milieu de culture DMEM complété par 8 % de FBS à 2 mL dans chaque puits.</li>
</ol>2. Traitement des cellules
REMARQUE : Le contrôle et les traitements sont effectués en trois exemplaires. Les groupes sont les suivants : Contrôle (DMSO), 1 μM d’érestine, 0,3 μM de RSL3, 250 μM de FAC, 2 μM de Ferrostatine 1, 1 μM d’érastine + 2 μM de Ferrostatine 1, 0,3 de μM RSL3 + 2 μM de Ferrostatine 1, 250 μM de FAC + 2 μM de Ferrostatine 1. Quatre plaques à 6 puits sont nécessaires pour l’expérience, comme indiqué dans le tableau 1). Les détails commerciaux de tous les réactifs nécessaires sont répertoriés dans la table des matériaux.
<ol><li>24 h après l’ensemencement, ajoutez le traitement correspondant dans le puits avec les cellules.</li>
	<li>Laissez les plats à 37 °C et 5% de CO2 dans l’incubateur.</li>
</ol>3. Coloration aux hydroperoxydes lipidiques des cellules traitées avec la sonde BODIPY 581/591 C11
REMARQUE : La solution mère de la sonde spécifique de l’hydroperoxyde lipidique est préparée dans du DMSO à une concentration de 1 mM. Les aliquotes de la solution mère sont stockées à -20 °C dans des tubes non transparents. Pour la coloration, préparer une solution de travail de 2 μM de la sonde dans un milieu DMEM complétée par 8 % de FBS.
<ol><li>6 h après le traitement, observez les cellules au microscope optique (l’arrondi des cellules doit être visible).</li>
	<li>Retirez les plats de l’incubateur et placez-les dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. À l’aide d’un aspirateur, retirez le média et les cellules flottantes (mortes).</li>
	<li>Ajoutez délicatement 2 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis retirez le PBS des puits à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de la solution de travail de la sonde (concentration finale de 2 μM dans le DMEM complétée par du FBS).</li>
	<li>Laissez le plat dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant 30 min dans l’obscurité (les assiettes peuvent être enveloppées dans du papier d’aluminium).</li>
</ol>4. Analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules traitées
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans l’obscurité (pas de lumières dans la hotte à flux laminaire).
<ol><li>Sortez les plats de l’incubateur et placez-les dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. À l’aide d’un aspirateur, retirez la solution de coloration.</li>
	<li>Ajoutez délicatement 2 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis retirez le PBS des puits à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Répétez l’étape de lavage une fois de plus et aspirez tout PBS restant du puits à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Ajouter 150 μL d’un réactif de dissociation cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) au fond de chaque puits et incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Prélever 250 μL de tampon FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5 % BSA) et prélever mécaniquement les cellules des puits.</li>
	<li>Transférez les cellules dans le tube FACS correspondant (préalablement marqué) avec le capuchon du filtre. Placez le tube avec les cellules sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée (l’analyse doit être effectuée dans l’heure suivant la coloration). REMARQUE : La configuration et l’étalonnage de la machine FACS dépendent de la machine utilisée (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Créez une nouvelle expérience et donnez-lui un nom (Ferroptose dans DAOY - hydroperoxydes lipidiques).</li>
	<li>Dans le plan d’expérience, choisissez le laser (488 nm) et le filtre (FITC).</li>
	<li>Dans les données de vue, sélectionnez la taille de cellule appropriée (>12 μm), réglez les tensions PMT (la population de cellules doit apparaître dans le premier quadrant du graphique à points SSC-H/FSC-H) et contrôlez le graphique à points.</li>
	<li>Ajoutez un nouveau graphique - histogramme, avec FITC-A sur l’axe des y et l’échelle logarithmique.</li>
	<li>Vortex les échantillons dans le tube FACS, placez-les dans la machine FACS et chargez l’échantillon. Enregistrez 10 000 événements de singulet FSC et nommez le fichier (par exemple, DAOY WT CTL 6h). Exportez le fichier au format .fcs.</li>
</ol>5. Coloration à l’iodure de propidium (PI) des cellules mortes lors du traitement
REMARQUE : La conception de l’expérience est exactement la même que pour la mesure de l’hydroperoxyde lipidique (voir l’étape 1 et l’étape 2).
<ol><li>24 h après l’ensemencement, sortez les plats de l’incubateur et placez-les dans la hotte à flux laminaire.</li>
	<li>Prélever le milieu (avec les cellules mortes) dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Ajoutez 1 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis recueillez le PBS dans le tube avec le milieu respectif.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de trypsine (dilution 10x) au fond de chaque puits et incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Utilisez le milieu respectif + PBS pour récolter les cellules des puits.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 180 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.</li>
	<li>Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 300 μL de tampon FACS et la placer sur de la glace jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Juste avant l’analyse, ajouter la solution d’IP (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 2 μg/mL.</li>
</ol>6. Analyse par cytométrie en flux des cellules mortes 24h après le traitement
REMARQUE : Les réglages et l’étalonnage de la machine FACS sont effectués comme indiqué précédemment (voir étape 4).
<ol><li>Créez une nouvelle expérience et donnez-lui un nom (Ferroptose dans DAOY - mort cellulaire).</li>
	<li>Dans le plan d’expérience, choisissez le laser (488 nm) et le filtre (PE).</li>
	<li>Dans les données d’affichage, sélectionnez la taille de cellule appropriée (>12 μm), réglez les tensions PMT (la population de cellules doit apparaître dans le premier quadrant du graphique à points SSC-H/FSC-H) et contrôlez le graphique à points.</li>
	<li>Ajoutez un nouveau tracé - histogramme, avec PE-A sur l’axe des y et l’échelle logarithmique.</li>
	<li>Vortex les échantillons dans le tube FACS, placez-les dans la machine FACS et chargez l’échantillon.</li>
	<li>Enregistrez 10 000 événements de singulet FSC et nommez le fichier (par exemple, DAOY WT CTL 6h). Exportez le fichier au format .fcs.</li>
</ol>7. Analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules DAOY xCT-/-
REMARQUE : les cellules xCT-/- ont été générées comme décrit précédemment24.
<ol><li>Pour cette expérience, ensemencez les cellules comme indiqué à l’étape 2, mais au lieu du traitement, complétez le milieu avec 1 mM de NAC pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, conservez NAC dans un groupe et retirez-le de l’autre.</li>
	<li>Effectuez l’analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique exactement de la même manière que celle décrite à l’étape 6.</li>
</ol>8. Analyse des résultats du cytomètre en flux
<ol><li>Ouvrez le document .fcs dans le logiciel FlowJo (voir la Table des matériaux).</li>
	<li>Double-cliquez sur le fichier individuel pour ouvrir tous les événements (pas seulement les singulets FCS) enregistrés dans l’échantillon individuel (diagramme à points SSC-A/FSC-A). Étant donné que les paramètres sont tels que le gate effectué sur la machine n’est pas conservé, il est nécessaire de refaire le gate et de nommer la population (par exemple, DAOY WT).</li>
	<li>Double-cliquez sur la population fermée pour ouvrir une autre fenêtre avec l’histogramme.</li>
	<li>Remplacez l’axe Y par le filtre fluorescent utilisé (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>Changez l’axe des X en modal (normalisez chaque pic à son mode, c’est-à-dire en % du nombre maximum de cellules trouvées dans un bac particulier).</li>
	<li>Copiez l’histogramme dans l’éditeur de mise en page. Répétez cette opération pour tous les échantillons, et chaque fois qu’un nouvel histogramme est collé dans l’éditeur de mise en page, faites-le glisser sur le précédent afin que les histogrammes soient superposés (demi-décalage).</li>
</ol>

Analyse FACS des hydroperoxydes lipidiques dans les cellules de médulloblastome ferroptotique

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
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<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
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<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
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<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts pour l’étude présentée ci-dessous.

La principale caractéristique de la mort cellulaire ferroptotique est l’accumulation incontrôlée d’hydroperoxydes lipidiques dans la membrane plasmique. Ces dommages oxydatifs peuvent se produire de manière enzymatique ou non enzymatique, mais dans les deux cas, la réaction est dépendante du fer/catalysée, d’où le nom de ce type de mort cellulaire. L’hydroperoxydation lipidique est souvent estimée indirectement en mesurant les produits de dégradation de l’hydroperoxydation lipidique, tels que le 4-hydroxy-2,3-trans-nonénal (4-HNE) ou le malonaldéhyde (MDA). Ces produits, générés par la décomposition peroxydative des acides gras polyinsaturés, peuvent réagir avec diverses macromolécules, entraînant une grande variété de pathologies, telles que les troubles neurodégénératifs, le diabète et l’insuffisance cardiaque chronique, entre autres. Néanmoins, ce sont les conséquences de l’événement de peroxydation, et des efforts considérables ont été investis dans la mise au point de bonnes sondes spécifiques aux hydroperoxydes lipidiques.
Une sonde fréquemment utilisée est la BODIPY 581/591 C11, qui a également ses inconvénients à prendre en considération. Plus précisément, la couleur de fluorescence BODIPY 591/581 présente deux pics d’émission, l’un à l’état réduit (590 nm) et l’autre à l’état oxydé (510 nm). Le rapport entre la fluorescence à ces deux longueurs d’onde est d’une importance particulière si l’objectif est une quantification précise. Cependant, l’intensité de la fluorescence à émission unique de BODIPY 591/581 nm a été largement utilisée dans toute la littérature 1,25,26,27,28, d’autant plus que l’intensité réduite de l’émission rouge à 510 nm est fréquemment masquée par le débordement de la fluorescence de la molécule oxydée 22,29. C’est l’une des principales raisons pour lesquelles la fluorescence de BODIPY 591/581 est généralement représentée de manière qualitative en fonction de l’intensité de fluorescence unique (verte).
Une autre limitation importante de cette sonde est sa suppression de l’émission de fluorescence par les antioxydants d’une manière dépendante de la concentration30. Par conséquent, la coloration doit être effectuée dans un milieu sans supplémentation en antioxydants. Dans le protocole actuel, la ferrostatine 1, un puissant piégeur d’hydroperoxydes lipidiques, a été utilisée ; néanmoins, avant l’ajout de la sonde, la ferrostatine 1 a été retirée et les cellules ont été lavées avec du PBS afin que la sonde ne soit pas exposée à son activité antioxydante.
En ce qui concerne l’induction de la ferroptose, de nombreux médicaments disponibles dans le commerce pourraient être utilisés. Ici, l’érastine, un inhibiteur irréversible du transporteur xCT31, a été utilisée. Étant donné qu’il se lie de manière covalente au transporteur, des concentrations encore plus élevées peuvent être utilisées (jusqu’à 100 μM) pendant une période de temps plus courte (5 min), suivie d’une étape de lavage31. Pour évaluer la cinétique exacte de la ferroptose lors de l’inhibition complète de xCT, les cellules xCT-/- ont été utilisées en l’absence de NAC. Une accumulation massive d’hydroperoxydes lipidiques a été détectée après 6 heures, et pratiquement aucune cellule viable n’a été détectée 24 heures après l’ensemencement. Quant à RSL3, un inducteur très puissant de la ferroptose dans la gamme nanomolaire, il présentait une cinétique similaire à celle observée avec les cellules xCT-/-. Son mode d’action est encore assez controversé, mais il semble qu’il n’affecte pas l’activité mais induit plutôt la dégradation de l’enzyme GPx432,33.
Un aspect important de l’induction de la ferroptose in vitro est la confluence cellulaire. Il a longtemps été observé qu’une couche cellulaire confluente est beaucoup plus résistante à la privation de cystéine, à l’inhibition de xCT ou GPx4, à l’appauvrissement en GSH, etc.34. La principale raison invoquée est que le contact physique, c’est-à-dire la confluence, conduit à l’activation de la voie Hippo, qui, à son tour, régule à la baisse le métabolisme et la production interne d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, la navette de cystéine réduite pourrait également contribuer à la résistance à l’inhibition incomplète de xCT35. Dans la présente étude, une concentration de 1 00 000 cellules par puits (plaque à 6 puits) a été utilisée afin de maintenir une faible confluence avec des cellules plutôt grandes et plates. Cependant, avec des cellules plus petites et de forme ronde, telles que HD-MB03, ce nombre pourrait être porté à 1,50 000-2 000 000 cellules par puits (plaque à 6 puits).
La dernière limite de la présente étude est la détection de la mort cellulaire par la méthode de l’iodure de propidium (PI). Cette méthode est conviviale pour détecter tout type de mort cellulaire, et la ferroptose pourrait être distinguée des autres types de mort cellulaire en utilisant des inhibiteurs spécifiques de la ferroptose, tels que la ferrostatine-1. La coloration PI est basée sur le fait que les cellules mourantes perdent l’intégrité de la membrane, ce qui permet à PI de pénétrer dans les cellules, de s’intercaler entre les bases de l’ADN et d’émettre un signal fluorescent. Cependant, il convient de noter que l’hydroperoxydation des lipides induit une « fuite » membranaire, ce qui permet la pénétration de l’IP avant même que la mort cellulaire ne se produise. Ainsi, il est difficile d’estimer la cinétique de la ferroptose sur la base de cette seule méthode.

La ferroptose est un typede mort cellulaire 1 dépendant des espèces réactives de l’oxygène (ROS) nouvellement contextualisé. Outre les ROS, le fer joue un rôle crucial dans ce type de mort cellulaire, d’où le nom2. L’étape finale et exécutive de la ferroptose est l’accumulation catalysée par le fer de dommages oxydatifs des lipides dans la membrane plasmique qui conduit finalement à une compromission de l’intégrité de la membrane et à une perméabilité sélective, et, enfin, à la mort cellulaire par bouillonnement. L’hydroperoxydation des lipides est un phénomène naturel ; Cependant, sa propagation dans toute la membrane cellulaire est empêchée par la défense antioxydante de la cellule. L’acteur majeur dans ce contexte est la protéine Sè glutathion peroxydase 4 (GPx4), qui peut s’approcher de la membrane et convertir les hydroperoxydes lipidiques en leurs dérivés alcooliques moins toxiques3. Le pouvoir réducteur de GPx4 est principalement, mais pas exclusivement, fourni par le glutathion (GSH), un tripeptide composé des acides aminés non essentiels : glycine, glutamate et cystéine. L’acide aminé limitant le taux de biosynthèse du GSH est la cystéine4. Bien que la cystéine soit classée comme un acide aminé non essentiel, ses besoins peuvent facilement dépasser sa production interne dans les cellules hautement prolifératives (telles que les cellules cancéreuses). Il a donc été reclassé dans le groupe des acides aminés semi-essentiels. L’importation nécessaire de cystéine se produit principalement par le biais du système Xc-, qui permet l’importation de la forme oxydée (dominante) de la cystéine (alias cystine) au détriment de l’exportation de glutamate5. Le système Xc- est composé d’une sous-unité de transport indépendante du Na+ et dépendante de Cl, connue sous le nom de xCT, et d’une sous-unité chaperonne, connue sous le nom de CD98. Jusqu’à récemment, les propriétés anti-ferroptotiques de l’axe xCT-GSH-GPx4 étaient considérées comme uniques et irréplicables6. Cependant, en 2019, une voie alternative anti-ferroptotique, composée d’ubiquinol (coenzyme Q10) et de son enzyme régénérative - la protéine suppressive de ferroptose 1 (FSP1), a été décrite 7,8. Peu de temps après, un autre système de détoxification à base d’hydroperoxyde lipidique impliquant la GTP cyclohydrolase-1/tétrahydrobioptérine (GCH1/BH4) a été signalé9. Néanmoins, le rôle central de l’axe xCT-GSH-GPx4 dans la prévention de la ferroptose ne semble pas être remis en question.
Au cours de la dernière décennie, la ferroptose a été largement étudiée dans une variété de types de tumeurs, montrant un grand potentiel en tant que stratégie anticancéreuse (examiné par Lei et al.10). De plus, il a été rapporté que les cellules cancéreuses présentant une résistance élevée aux chimiothérapies conventionnelles et/ou une propension à métastaser sont étonnamment sensibles aux inducteurs de ferroptose, tels que les inhibiteurs de GPx4 11,12,13. Cependant, dans le contexte des tumeurs cérébrales, le potentiel des inducteurs ferroptotiques reste largement sous-étudié. Bien que ce type de mort cellulaire ait été étroitement associé aux lésions d’ischémie-reperfusion cérébrale14et aux maladies neurodégénératives15, son potentiel dans le contexte des tumeurs cérébrales a principalement été limité au glioblastome, la tumeur craniocérébrale maligne la plus courante (examiné par Zhuo et al.16). D’autre part, la sensibilité du médulloblastome, la tumeur cérébrale maligne pédiatrique la plus courante et l’une des principales causes de mortalité infantile, aux inducteurs de ferroptose reste largement inexplorée. À notre connaissance, il existe peu de littérature évaluée par des pairs établissant un lien entre la ferroptose et le médulloblastome. Néanmoins, certaines études ont révélé que le fer joue un rôle crucial dans la survie, la prolifération et le potentiel tumorigène des cellules souches cancéreuses du médulloblastome et du glioblastome (CSC)17,18, ce qui les rend potentiellement plus vulnérables à l’induction de la ferroptose. Ceci est particulièrement important car le médulloblastome est connu pour sa sous-population de CSC, ou cellules initiatrices/propagatrices de tumeurs, qui semblent être en grande partie responsables de la chimiorésistance, de la dissémination et de la rechute des tumeurs19.
La sensibilité à l’induction de la ferroptose est généralement étudiée en mesurant la teneur/l’accumulation d’hydroperoxyde lipidique, qui peut ou non conduire à la mort cellulaire. Les inducteurs de ferroptose les plus couramment utilisés sont (1) l’ératine, un inhibiteur du transporteur xCT20, (2) RSL3, un inhibiteur de l’enzyme GPx42, et/ou (3) les donneurs de fer, tels que le citrate de ferro-ammonium (FAC)21. La teneur en hydroperoxyde lipidique est évaluée à l’aide de la sonde sélective BODIPY 581/591 C1122, qui a des maxima d’excitation et d’émission à 581/591 nm à l’état réduit. Lors de l’interaction et de l’oxydation par les hydroperoxydes lipidiques, la sonde décale ses maxima d’excitation et d’émission à 488/510 nm. En règle générale, une augmentation significative de la teneur en hydroperoxyde lipidique précède la mort cellulaire ferroptotique. Comme la ferroptose n’est pas une mort cellulaire programmée, il n’y a pas de cascade de signalisation moléculaire menant à son exécution. Par conséquent, la seule façon de le confirmer est de surveiller la teneur en hydroperoxyde lipidique et d’utiliser des inhibiteurs spécifiques de ce type de mort cellulaire, tels que la ferrostatine 123. La ferrostatine 1 est un antioxydant lipophile qui peut pénétrer dans le compartiment lipidique de la cellule et détoxifier les hydroperoxydes lipidiques, prévenant ainsi les événements ferroptotiques.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de ferroamminium</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatine-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase Réactif de dissociation cellulaire</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest Kit de détection de mycoplasmes</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

L’interaction du fer et de l’oxygène fait partie intégrante du développement de la vie sur Terre. Néanmoins, cette chimie unique continue de fasciner et d’intriguer, conduisant à de nouvelles entreprises biologiques. En 2012, un groupe de l’Université Columbia a reconnu que cette interaction était un événement central menant à un nouveau type de mort cellulaire régulée appelée « ferroptose ». La principale caractéristique de la ferroptose est l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques due à (1) une défense antioxydante dysfonctionnelle et/ou (2) un stress oxydatif écrasant, qui coïncide le plus souvent avec une teneur accrue en fer labile libre dans la cellule. Ceci est normalement empêché par l’axe canonique anti-ferroptotique comprenant le transporteur de cystine xCT, le glutathion (GSH) et la GSH peroxydase 4 (GPx4). La ferroptose n’étant pas un type programmé de mort cellulaire, elle n’implique pas de voies de signalisation caractéristiques de l’apoptose. La façon la plus courante de prouver ce type de mort cellulaire est d’utiliser des antioxydants lipophiles (vitamine E, ferrostatine-1, etc.) pour la prévenir. Ces molécules peuvent approcher et détoxifier les dommages oxydatifs dans la membrane plasmique. Un autre aspect important dans la mise en évidence du phénotype ferroptotique est la détection de l’accumulation préalable d’hydroperoxydes lipidiques, pour lesquels le colorant spécifique BODIPY C11 est utilisé. Le présent manuscrit montrera comment la ferroptose peut être induite dans les cellules de médulloblastome de type sauvage en utilisant différents inducteurs : l’ératine, la RSL3 et le donneur de fer. De même, les cellules xCT-KO qui se développent en présence de NAC et qui subissent une ferroptose une fois que la NAC est retirée seront utilisées. Le phénotype caractéristique « bouillonnant » est visible au microscope optique dans les 12 à 16 heures suivant le déclenchement de la ferroptose. De plus, une coloration BODIPY C11 suivie d’une analyse FACS pour montrer l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques et la mort cellulaire subséquente à l’aide de la méthode de coloration PI sera utilisée. Pour prouver la nature ferroptotique de la mort cellulaire, la ferrostatine-1 sera utilisée comme agent spécifique de prévention de la ferroptose.

La lignée cellulaire de médulloblastome DAOY a été cultivée dans un milieu DMEM standard complété par 8 % de FBS jusqu’à ce qu’elle atteigne environ 60 % de confluence. Le jour de l’expérience, les cellules ont été récoltées et 1 000 000 cellules par puits ont été plaquées dans des plaques à 6 puits, selon le tableau 1. Le lendemain, les cellules (en trois exemplaires) ont été traitées avec soit 1 μM d’érastine, 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de FAC. Les plaques ont ensuite été placées dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Après 6 h, les cellules ont été observées au microscope pour détecter les cellules bouillonnantes, comme l’indiquent les flèches de la figure 1. Cela a servi d’indicateur que le médicament était efficace pour induire la ferroptose avant que les cellules ne soient préparées pour la coloration à l’hydroperoxyde lipidique et l’analyse FACS ultérieure.
Pour la détection de la teneur en hydroperoxyde lipidique, le colorant spécifique BODIPY 581/591 C11 a été utilisé à une concentration finale de 2 μM pendant 30 min. Comme ce colorant est sensible à l’oxydoréduction, il a été nécessaire de retirer tout traitement des cellules et de les laver avec du PBS préchauffé. Après une demi-heure de coloration, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, détachées à l’aide de la solution de détachement cellulaire et préparées pour l’analyse FACS. Les données obtenues à cette étape ont montré une augmentation de la fluorescence verte du colorant dans les échantillons traités avec les trois médicaments (figure 2). Cependant, l’effet le plus puissant a été observé avec 0,3 μM de RSL3 (Figure 2B), tandis que 1 μM d’érastine (Figure 2A) et 250 μM de FAC (Figure 2C) ont montré un effet un peu moindre après 6 h de traitement.
Pour établir que l’accumulation d’hydroperoxyde lipidique détectée conduit à la mort cellulaire, en particulier à la ferroptose, les mêmes traitements décrits dans le tableau 1 ont été appliqués pendant 24 heures. Pour l’analyse des cellules mortes par cytométrie en flux, les cellules et le surnageant ont été prélevés. Les cellules vivantes et mortes ont été granulées par centrifugation, puis remises en suspension dans un tampon FACS pour une analyse ultérieure par cytométrie en flux. Les données présentées dans la figure 3 ont démontré que les trois traitements ont induit une mort cellulaire massive, qui a été complètement évitée par l’utilisation de l’inhibiteur spécifique de la ferroptose, la ferrostatine-1. Cela soutient clairement l’apparition de la mort cellulaire ferroptotique lors de l’inhibition de xCT, de l’inhibition de GPx4 ou de la surcharge en fer dans les cellules de médulloblastome.
Étant donné que les trois médicaments ont montré des effets quelque peu différents sur l’accumulation d’hydroperoxyde lipidique, probablement en raison de différences de puissance, une approche génétique a été utilisée pour étudier la pleine puissance des inducteurs ferroptotiques. Les cellules DAOY xCT-/- obtenues précédemment (figure supplémentaire 1A) ont été cultivées dans le même milieu que leurs homologues WT, mais avec une supplémentation en NAC. Cette sélection positive a permis aux cellules xCT-/- de se développer en culture. Cependant, 6 h après l’élimination de la NAC du milieu de culture, les cellules ont commencé à accumuler des hydroperoxydes lipidiques au même niveau que les cellules WT traitées avec RSL3 (figure 4). À l’instar de l’inhibition pharmacologique, l’élimination de la NAC du milieu a induit le bouillonnement caractéristique des cellules xCT-/- après 6 h (Figure supplémentaire 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> Figure 1 : Phénotype ferroptotique des cellules du médulloblastome. Micrographies représentatives de cellules DAOY WT traitées (ou non) pendant 6 h avec 1 μM d’érastine (ERA), 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de citrate de ferroammonium (FAC) en présence ou non d’un inhibiteur de ferroptose 2 μM Ferrostatine-1 (Ferro-1). Les flèches blanches indiquent des cellules rondes et « bouillonnantes », indiquant un phénotype ferroptotique visible au microscope optique. Grossissement : 20x, inserts : 40x. Barres d’échelle : 50 μm, encarts : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> Figure 2 : L’hydroperoxyde lipidique comme marqueur clé de la ferroptose dans les cellules de médulloblastome. Données représentatives de la coloration à l’hydroperoxyde lipidique par cytométrie en flux dans les cellules traitées pendant 6 h avec (A,B) 1 μM d’érastine (ERA), (C,D) 0,3 μM de RSL3, ou (E,F) 250 μM de citrate de ferroammonium (FAC), en présence ou non de 2 μM d’inhibiteur de ferrostatine-1 (Ferro-1). (A,C,E) Graphiques à points des événements enregistrés ; (B, D, F) Représentation histogramique de la teneur en hydroperoxyde lipidique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> Figure 3 : Induction de la mort cellulaire ferroptotique par approche pharmacologique. Graphiques à points représentatifs de cytométrie en flux de cellules colorées à l’iodure de propidium après 6 h de traitement avec 1 μM d’érastine (ERA), 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de citrate de ferroammonium (FAC), en présence ou non de ferrosatine-1 inhibiteur de la ferrostatine-1 (Ferro-1). Le gate sépare les populations vivantes (Q4) et mortes (Q3) des cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> Figure 4 : Induction de la ferroptose par approche génétique. Données représentatives de la coloration à l’hydroperoxyde lipidique par cytométrie en flux dans les cellules DAOY WT et xCT-/- après 6 h en présence ou non d’un inhibiteur de ferrostatine-1 (Ferro-1), un inhibiteur de ferroptose de 2 μM. Sur la gauche se trouve la représentation histogramique de la teneur en hydroperoxyde lipidique. Sur la droite se trouvent les diagrammes à points des événements enregistrés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Planche I</td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 μM d’érastine I</td>
			<td>1 μM d’érastine II</td>
			<td>1 μM d’érastine III</td>
		</tr><tr><td>Planche II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 I</td>
			<td>0,3 μM RSL3 II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 μM FAC I</td>
			<td>250 μM FAC II</td>
			<td>250 μM FAC III</td>
		</tr><tr><td>Planche III</td>
			<td>2 μM Ferro-1 I</td>
			<td>2 μM Ferro-1 II</td>
			<td>2 μM Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M d’érastine + 2 M de Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td>Planche IV</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Détails du traitement des cellules témoins et expérimentales.
Figure supplémentaire 1 : Mort cellulaire ferroptotique des cellules DAOY xCT-/- . (A) Analyse par transfert Western du taux de xCT dans les cellules DAOY WT et xCT-/- dans des milieux DMEM complétés ou non par 2 μM de ferrostatine-1. (B) Micrographies représentatives des cellules DAOY xCT-/- en présence (à gauche) et en absence (à droite) de 1mM de N-acétylcystéine pendant 6 h. Les flèches blanches indiquent des cellules rondes et « bouillonnantes », indiquant un phénotype ferroptotique visible au microscope optique. Grossissement : 40x. Barres d’échelle : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

La teneur en hydroperoxyde lipidique représente l’indicateur le plus couramment utilisé de la mort cellulaire ferroptotique. Cet article présente l’analyse par cytométrie en flux étape par étape de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules lors de l’induction de la ferroptose.

Révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

Le but ultime de notre recherche est de développer de nouvelles thérapies pour les cancers pédiatriques tels que le myoblastome. Dans ce but, notre équipe développe de nouveaux systèmes modèles mettant en évidence le patrimoine génétique de la maladie, ainsi que l’exploitation de nouvelles pistes thérapeutiques. Au cours des dernières années, la génomique unicellulaire a révélé comment l’engagement altéré de la lignée influence les résultats cliniques des cancers pédiatriques, ainsi que la réponse aux traitements et, finalement, le développement de populations de cellules résistantes au traitement au sein de la tumeur.Le spectre de l’état différencié des progéniteurs neuraux semble sous-tendre l’issue clinique du cancer pédiatrique. Les principaux défis sont de comprendre ces progéniteurs hautement plastiques connus ou insuffisamment présents dans les tumeurs, ainsi que de développer de nouveaux traitements plus efficaces et moins nocifs pour ces maladies. De ce point de vue, nos recherches sur la ferroptose apparaissent extrêmement prometteuses.La dépendance au fer est l’une des principales vulnérabilités des cellules cancéreuses, également appelées cellules souches cancéreuses, tous les éléments essentiels. Le fer est une arme à double tranchant car sa réaction avec les espèces réactives de l’oxygène peut conduire au type spécifique de mort cellulaire, appelé ferroptose. Nos données ont clairement montré que la ferroptose est un grand potentiel contre ce type de cellules cancéreuses.

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Nous décrivons ici un protocole efficace et polyvalent pour induire, surveiller et analyser de nouveaux glioblastomes (GBM) à l’aide d’ADN transposon injecté dans les ventricules de souris néonatales. Les cellules de la zone sous-ventriculaire, qui absorbent le plasmide, se transforment, prolifèrent et génèrent des tumeurs présentant des caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

Présenté ici est un protocole pour effectuer la manipulation génétique dans le cerveau de furet embryonnaire en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode permet de cibler les cellules progénitrices neuronales dans le néocortex in vivo.

In Vivo Ciblage des cellules progénitrices neuronales dans le néocortex de Ferret par In Utero Electroporation

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Nous présentons ici un protocole pour utiliser injection guidée par ultrason du neuroblastome (NB) et cellules (ES) le sarcome d’Ewing (établi de lignées cellulaires et les cellules tumorales dérivées de patient) aux sites biologiquement pertinentes pour créer des modèles précliniques fiables pour le cancer recherche.

Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire.

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

Découvrez l'induction de la ferroptose dans les cellules de médulloblastome pour développer de nouvelles thérapies pédiatriques. Cette méthode par cytométrie en flux évalue le potentiel thérapeutique contre les populations résistantes au traitement.

Révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome

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