Name: La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Découvrez un criblage cellulaire dans la levure Schizosaccharomyces pombe pour identifier des composés ciblant les protéines du cytosquelette bactérien FtsZ et MreB. Cette méthode facilite le développement de nouveaux antibiotiques.

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SMP, SR et AKS reconnaissent les bourses reçues de l’Institut national de l’éducation et de la recherche scientifiques, Département de l’énergie atomique. RS reconnaît le soutien financier intra-muros du Département de l’énergie atomique, et ce travail est soutenu par une subvention de recherche à RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) du Département de biotechnologie (DBT). Les auteurs remercient également V Badireenath Konkimalla pour ses commentaires, suggestions et discussions tout au long de l’élaboration du protocole.

1. Expression des protéines du cytosquelette bactérien marquées à la GFP chez S. pombe
REMARQUE : Veuillez consulter le tableau 1 pour obtenir des renseignements sur tous les plasmides et souches utilisés ici. Veuillez consulter le tableau 2 pour toutes les compositions de supports.
<ol><li>Effectuer le clonage d’E. coli MreB avec une fusion GFP N-terminale (GFP-MreB) et de S. aureus FtsZ porteur d’une GFP C-terminale (SaFtsZ-GFP) dans le vecteur d’expression de S. pombe, pREP42 avec un promoteur répressible à la thiamine de force moyenne, nmt4118,19 comme décrit précédemment14,15. Maintenir, amplifier et isoler les plasmides des souches d’E. coli (DH10β) comme décrit en20,21. REMARQUE : D’autres souches d’E. coli telles que DH5α, XL1Blue, TOP10, etc. ou d’autres cellules compétentes disponibles dans le commerce et couramment utilisées pour le clonage moléculaire peuvent également être utilisées.</li>
	<li>Transformation des plasmides pREP42-GFP-EcMreB et pREP42-SaFtsZ-GFP en S. pombe
	<ol><li>Transformez les plasmides pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) et pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) en souche de S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) en utilisant la méthode de l’acétate de lithium22, comme mentionné dans les étapes ci-dessous.</li>
		<li>Jour 1 - Culture primaire : Inculquer une boucle de culture de S. pombe fraîchement striée dans 3 mL de bouillon d’extrait et de suppléments de levure autoclavé (YES). Incubez-le dans un agitateur orbital à 30 °C pendant la nuit (O/N).</li>
		<li>Jour 2 :<ol><li>Culture secondaire : Ajouter environ 500 μL de culture primaire à 30 mL de bouillon YES autoclave. Incuber à 30 °C pendant 3 à 4 h en secouant jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,4 à 0,6. REMARQUE : Pour chaque transformation, 30 mL sont utilisés.</li>
			<li>Granulez la culture de 30 mL à 2 500 x g pendant 6 à 8 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules avec 50 mL d’eau distillée stérile (D/W). Granulez à nouveau et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de D/W stérile et les transférer dans un tube à centrifuger de 2 mL. Centrifuger comme ci-dessus et jeter le surnageant.</li>
			<li>Ajouter 1 mL d’acétate de lithium 0,1 M, une solution de Tris-EDTA (LiAc-TE) et centrifuger comme ci-dessus. Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans 1 mL de LiAc-TE 0,1 M. Centrifuger et jeter le surnageant, en laissant 100 μL de solution derrière eux.</li>
			<li>Ajoutez 10 à 20 g d’ADN porteur (ADN de spermatozoïde de saumon, dénaturé et refroidi par évaporation sur glace) et 2 à 3 g d’ADN plasmidique, qui doit être transformé. Mélangez délicatement. Incuber à température ambiante pendant 10 min.</li>
			<li>Ajouter 260 μL de 40 % de PEG/LiAc-TE ; Mélangez doucement. Incuber pendant 60 min dans l’agitateur ou un thermomixeur à 30 °C avec un mélange doux. Ajouter 43 μL de DMSO ; Mélangez doucement.</li>
			<li>Choc thermique à 42 °C pendant 10 min dans le thermomixeur. Granuler à 2 500 x g pendant 6 à 8 min et jeter le surnageant. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de D/W stérile.</li>
			<li>Granuler, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de D/W stérile. Plaque de 100 μL sur des plaques de milieu minimal (EMM) d’Édimbourg contenant 5 μg/mL de thiamine (pour réprimer le promoteur nmt41 ) et des suppléments d’acides aminés adénine (0,225 mg/mL), d’histidine (0,225 mg/mL) et de leucine (0,225 mg/mL) mais manquant d’uracile (marqueur de sélection pour le plasmide pREP42). REMARQUE : Alternativement, les plaques 70 μL et 130 μL dans deux plaques différentes. Deux volumes différents (70 μL et 130 μL) sont plaqués pour obtenir des colonies isolées sur au moins une des plaques en fonction de l’efficacité de la transformation, qui peut varier d’une expérience à l’autre.</li>
			<li>Incuber les plaques à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition des colonies. Mélanger une seule colonie avec 100 μL de D/E stérile et étaler sur une plaque EMM fraîche contenant de la thiamine mais dépourvue d’uracile comme décrit ci-dessus.</li>
			<li>Incuber à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à ce qu’une pelouse complète apparaisse. Grattez la pelouse cultivée des cellules à l’aide d’une boucle d’inoculation et mettez-la en suspension dans 1 mL de milieu YES contenant 30 % de glycérol dans un cryo-flacon.</li>
			<li>Congelez rapidement le cryo-flacon dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C pour conserver les stocks de levures congelés.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Expression de protéines du cytosquelette bactérien dans la levure de fission<ol><li>Striez aseptiquement un patch du stock de glycérol sur une plaque fraîche spécifique à la levure pour obtenir une culture suffisante pour d’autres expériences. REMARQUE : Dans le cas de pREP42, nous avons utilisé une plaque de gélose EMM (milieu minimal) contenant de l’adénine, de l’histidine et de la leucine (comme avec la souche S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) sans uracile (uracile présent dans pREP42 comme marqueur de sélection). Nous ajoutons 15 à 20 μM de thiamine aux plaques de gélose (car pREP42 a un promoteur nmt41 répressible de thiamine) pour réprimer l’expression du gène d’intérêt lors de la croissance sur la plaque.</li>
		<li>Inculquer une petite boucle de l’inoculum de la plaque striée dans 5 mL de milieu EMM spécifique à la levure dépourvu de thiamine et l’incuber pendant 10 à 12 h à 30 °C. REMARQUE : L’expression de FtsZ et de MreB de différentes espèces sous le promoteur nmt41 chez S. pombe peut varier, généralement de 16 à 30 h. Le moment optimal pour l’expression des protéines GFP-EcMreB et SaFtsZ-GFP chez S. pombe est de 20 à 24 h et de 16 à 20 h à 30 °C, respectivement, sans thiamine.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Traitement de cultures de S. pombe exprimant des protéines cytosquelettiques bactériennes marquées à la GFP
REMARQUE : Un certain nombre de molécules médicamenteuses différentes sont testées sur la culture de levure cultivée pendant la nuit dans une plaque de 96 puits.
<ol><li>Inoculez une culture fraîche en transférant 50 μL de la culture de nuit dans chaque puits d’une plaque à 96 puits contenant 150 μL de milieu EMM de levure fraîche à l’aide de l’instrument de pipetage multicanaux semi-automatisé à 96 puits.</li>
	<li>Tout en pipetant à l’intérieur et à l’extérieur pour un mélange approprié à l’aide d’une pipette multicanaux semi-automatisée à 96 puits, introduisez lentement différentes concentrations croissantes de médicaments dans la culture en croissance, chacune effectuée en trois exemplaires, comme le montre le schéma de la figure 1.</li>
	<li>Comme contrôle positif, utiliser les médicaments déjà connus, PC190723 pour (S. aureus FtsZ) et A22 (pour E. coli MreB) en double. REMARQUE : Comme indiqué précédemment, PC190723 et A22 ont été utilisés à une concentration de 56,2 μM17 et 72,6 μM 14,17, respectivement. Pendant ce temps, le traitement A22 de SaFtsZ et le traitement PC190723 d’EcMreB ont servi de contrôles négatifs, respectivement.</li>
	<li>Utilisez le DMSO comme contrôle des solvants à trois concentrations différentes selon les concentrations les plus basses et les plus élevées de médicaments. REMARQUE : Le solvant dans lequel les médicaments sont dissous est utilisé comme témoin de solvant.</li>
	<li>Incuber les cultures témoins et traitées à 30 °C pendant 6 à 10 h (jusqu’à ce que les cellules montrent l’expression de protéines fluorescentes bactériennes), puis imager à l’aide de la microscopie à épifluorescence.</li>
</ol>3. Visualisation des polymères
<ol><li>Appliquer une couche de 20 μL de concanavaline A à 1 mg/mL dans chaque puits de la plaque inférieure à 96 puits optiquement transparente (à paroi noire pour l’imagerie par fluorescence) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Aspirez le liquide et laissez-le sécher à l’air libre pendant 10 min.</li>
	<li>Transférez 20 μL de cellules de la plaque de culture dans chaque puits respectif et laissez reposer pendant 10 min. Lavez la cellule 3x-4x avec le milieu EMM stérile.</li>
	<li>Une fois l’objectif à utiliser en place (voir étape 3.6), utilisez le mode navigateur dans le panneau d’acquisition du logiciel d’acquisition d’images pour l’alignement et la couverture des plaques à 96 puits. Alignez les bords du puits sur le navigateur.</li>
	<li>Ensuite, sélectionnez les paramètres de couverture du puits, qui incluent une sélection multiposition de la région d’intérêt dans le puits, et utilisez le contrôle autofocus adaptatif avec le mode à la demande pour maintenir la mise au point sur l’échantillon pendant l’imagerie.</li>
	<li>Acquérez des images à l’aide du contraste interférentiel différentiel (DIC) et de la fluorescence. Réglez des filtres d’excitation et d’émission de 475/28 nm et 525/48 nm, respectivement, pour imager les protéines bactériennes marquées à la GFP exprimées dans la levure. Obtenir des empilements Z à une taille de pas de 0,2 μm à travers l’épaisseur des cellules de levure (5 μm).</li>
	<li>Capturez des images à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 100x, 1,4 NA et d’une caméra sCMOS 2 000 x 2 000 (taille de pixel de 6,5 μm x 6,5 μm). Utilisez un système d’éclairage LED pour l’excitation du fluorophore. REMARQUE : Tout système de microscope à épifluorescence doté d’une platine motorisée pour une plaque de 96 puits avec un positionnement multipoint précis devrait convenir. Acquérir toutes les images cellulaires du témoin et du médicament traité avec un temps d’exposition similaire (généralement de l’ordre de 0,3 à 0,5 s) à un binning de 1 x 1 et un éclairage à 15 % à 20 % afin de minimiser les variables de l’expérience et de maintenir l’uniformité.</li>
</ol>4. Quantification des images à l’aide d’ImageJ
<ol><li>Traitez les images de cellules et mesurez le nombre de points par cellule et la densité pour FtsZ17. Dans le cas de MreB, mesurer la densité et l’anisotropie23 et comparer entre les cellules témoins et les cellules traitées à l’aide de Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.</li>
	<li>À l’aide des images du canal DIC, tracez d’abord le contour des cellules de levure individuelles à l’aide de l’outil de dessin à main levée et enregistrez-les en tant que région d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de ROI. Cette étape n’est pas encore automatisée, mais des outils récemment développés utilisant l’apprentissage automatique25,26 pourraient être tentés et intégrés dans un avenir proche.</li>
	<li>Masquez la zone extérieure de la cellule et remplissez en noir comme décrit à lasection 27.</li>
	<li>Utilisez la macro d’analyse du seuil OPS IJ1, une fonctionnalité intégrée aux Fidji, pour compter le nombre de points24.</li>
	<li>Utilisez la méthode otsu pour le seuillage automatique et masquez les particules segmentées. Exécutez le plug-in pour analyser les particules à l’aide d’une macro.</li>
	<li>Pour mesurer la densité des polymères (quantité de cytosquelette par unité de surface dans une cellule), traitez les images comme décrit, y compris les étapesde masquage et de squelettisation 27,28. Utilisez Lpx 2Dfilter dans le plug-in lpx pour squelettiser les images.</li>
	<li>Pour plus de détails, consultez cette publication récente17. Effectuez la quantification du polymère EcMreB comme mentionné précédemment en23, utilisez l’anisotropie pour quantifier l’organisation spatiale à l’aide de FibrilTool29 comme décrit précédemment23. REMARQUE : Ces méthodes d’analyse peuvent être utilisées pour quantifier toute autre protéine du cytosquelette bactérien qui est traitée ou non par les médicaments.</li>
</ol>

Identification des médicaments qui affectent la polymérisation des protéines cytosquelettiques bactériennes

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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ%2C+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li>
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</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une grave menace pour la santé mondiale, et il existe un besoin urgent de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles. Le cytosquelette bactérien est apparu comme une cible attrayante pour le développement de nouveaux antibiotiques, avec des inhibiteurs de petites molécules de la protéine de division cellulaire FtsZ, tels que TXA709, déjà en essais cliniques de phase I30. Plusieurs méthodes ont été développées pour identifier les inhibiteurs de la polymérisation de FtsZ 7,31. Nous avons récemment utilisé la levure de fission eucaryote dans un test cellulaire pour montrer que le médicament stabilisateur de FtsZ, PC190723, peut cibler HpFtsZ17. De plus, nous avons également montré que bien que des médicaments tels que la berbérine et la sanguinarine affectent la polymérisation de FtsZ, ils affectent également la morphologie des cellules de levure17. Poussés par ces études et observations, nous avons entrepris de développer un test cellulaire en une seule étape pour dépister les modulateurs de petites molécules du cytosquelette bactérien à l’aide de la plateforme d’expression de levure de fission. Étant donné que le criblage repose sur l’inhibition de l’assemblage des protéines cytosquelettiques marquées à la GFP, de petites molécules partageant des propriétés fluorophores similaires peuvent donner lieu à des faux positifs. Éviter les filtres passe-long et choisir des filtres passe-bande étroite peut aider à réduire ces faux positifs provenant de petites molécules fluorescentes. Nous montrons ici les étapes de la mise en place d’un criblage à débit moyen à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’un support de platine à plaque de 96 puits qui peut être utilisé pour dépister des médicaments ciblant SaFtsZ ou EcMreB. Le flux de travail implique l’acquisition et l’analyse d’images semi-automatisées, qui peuvent facilement être mises à l’échelle sur des écrans à haut débit à l’avenir à l’aide de systèmes robotisés de manipulation de liquides et de pipelines de traitement d’images.
De plus, le criblage devrait être utile pour d’autres protéines cytosquelettiques bactériennes, telles que la protéine de maintien du plasmide ParM32 contenant le repliement de l’actine et contre toute protéine qui s’assemble en structures polymères dans la levure de fission. Cependant, les niveaux d’expression optimaux pour chaque protéine d’intérêt devront être normalisés avant d’être utilisés dans tout criblage de médicaments. Alors que pour les FtsZ, nous avons constaté que nmt41 était un promoteur optimal, pour d’autres protéines d’intérêt, une version plus forte ou plus faible du promoteur nmt1 (Force du promoteur (et fuite) : nmt1 > nmt41 > nmt81) ou d’autres promoteurs constitutifs tels que la levure adh1 ou act118,33 peut être essayé pour obtenir des niveaux optimaux d’expression et d’assemblage de structures polymères. De plus, lors de l’utilisation de plasmides épisomaux, les variations du nombre de copies d’une cellule à l’autre posent également des problèmes pour l’expression uniforme des gènes. Pour contourner ces problèmes, plusieurs vecteurs intégrables dans le génome de la levure de fission (SIV pour vecteurs d’intégration stables) porteurs de promoteurs de différentes forces ont été récemment mis au point34. L’utilisation de ces vecteurs peut offrir des résultats plus uniformes et quantitatifs par rapport aux vecteurs épisomiques utilisés dans cette étude. L’utilisation de SIV pourrait éviter la grande hétérogénéité des niveaux d’expression, considérée comme une variation des intensités de fluorescence à travers les cellules, et devrait être mieux adaptée aux cribles à haut débit.
De plus, des médicaments comme le PC190723 agissent pour stabiliser les polymères FtsZ, ce qui entraîne l’assemblage précoce des filaments FtsZ par rapport aux cellules non traitées. Bien que le crible soit adapté au criblage de médicaments qui inhibent la polymérisation des protéines cytosquelettiques bactériennes, en raison de l’évaluation visuelle de la fluorescence diffuse au point final, le criblage de médicaments stabilisant les polymères FtsZ nécessite une optimisation supplémentaire des niveaux d’expression des protéines et du temps nécessaire pour atteindre le nombre maximal de cellules ayant des polymères. Il est donc essentiel d’avoir une estimation raisonnable du temps nécessaire à l’expression des protéines pour atteindre la concentration critique requise pour l’assemblage et de décider du critère d’évaluation de l’essai en conséquence. Dans le cas de médicaments susceptibles d’agir pour diminuer la concentration critique requise pour la polymérisation de la protéine, le choix du point final serait généralement un moment où une population considérable de cellules non traitées présenterait une fluorescence diffuse, mais les cultures traitées avec des médicaments présenteraient des assemblages de polymères.
L’une des limites, qui est également une étape chronophage du flux de travail, est la nécessité d’identifier et de segmenter des cellules individuelles pour l’analyse quantitative d’images. À l’heure actuelle, dans le schéma proposé, il s’agit d’une étape manuelle permettant d’identifier les cellules de levure individuelles et d’attribuer la région d’intérêt (ROI) pour la quantification de l’effet des médicaments. Cependant, nous prévoyons que les algorithmes d’apprentissage automatique récemment développés à l’aide d’ensembles d’apprentissage tels que ceux implémentables dans ilastik35 devraient minimiser le besoin d’intervention manuelle.
Bien que notre approche utilisant la plateforme de levure soit utile pour identifier les coups et les petites molécules potentielles ciblant le cytosquelette bactérien, il faudra éventuellement tester leur activité antibactérienne en utilisant les tests standard de concentration inhibitrice minimale et leur efficacité dans des modèles animaux. Néanmoins, le plus grand défi à l’augmentation mondiale de la résistance aux antimicrobiens (RAM) réside toujours dans la perméabilité de la membrane externe des bactéries à Gram négatif et les nombreuses pompes d’efflux chez de nombreuses espèces bactériennes pathogènes. De plus, les pompes d’efflux dans la levure de fission peuvent également poser des problèmes similaires et des concentrations de médicament plus élevées peuvent être nécessaires pour le processus de dépistage. Alternativement, des souches de levure à fission qui sont hypersensibles aux médicaments (S. pombe MDR-supML), à la suite de la délétion des sept gènes de multirésistance aux médicaments, y compris quatre gènes de transport et un facteur de transcription, peuvent être utilisées comme hôtes pour le criblage32,33. Des développements futurs dans les technologies qui combinent la découverte ciblée d’antibactériens et s’attaquent à la résistance due à des phénomènes généraux tels que la perméabilité membranaire seront nécessaires pour lutter contre la résistance croissante aux antimicrobiens.

La résistance généralisée à presque tous les antibiotiques actuellement utilisés pour lutter contre les infections bactériennes a créé un besoin immédiat de nouvelles catégories d’antibiotiques. Un rapport de 2019 a indiqué que les infections résistantes aux antibiotiques ont entraîné la perte de 1,27 million de vies, contribuant à un décompte global de 4,95 millions de décès si l’on considère les complications des infections bactériennes résistantes1. Bien qu’il soit toujours efficace dans la pratique clinique, l’arsenal actuel d’antibiotiques cible principalement un spectre étroit de processus cellulaires, en se concentrant principalement sur la paroi cellulaire, l’ADN et la synthèse des protéines. Au cours du dernier demi-siècle, moins de 30 protéines ont été exploitées commercialement comme cibles pour le développement de nouveaux antibactériens 2,3. Cette gamme limitée de cibles viables crée des contraintes significatives à la découverte de nouveaux antibiotiques ou de leurs dérivés pour lutter contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, pour surmonter le problème émergent de la résistance aux antibiotiques, il est nécessaire de développer de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles et de nouveaux mécanismes d’action.
Une cible antibactérienne devrait idéalement être un composant essentiel de la croissance cellulaire bactérienne, être conservée dans toutes les espèces phylogénétiquement diverses, présenter une homologie eucaryote minimale et être accessible aux antibiotiques4. Depuis la découverte de protéines cytosquelettiques bactériennes impliquées dans la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire, elles sont devenues un point focal prometteur pour le développement de composés antibactériens5. Ces protéines sont essentielles à la viabilité bactérienne et jouent un rôle central dans le maintien de la forme cellulaire (MreB, CreS), de la division (FtsZ, FtsA) et de la ségrégation de l’ADN (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semblable au cytosquelette dans les cellules eucaryotes. Notamment, FtsZ présente un niveau de conservation remarquablement élevé chez un large éventail d’organismes procaryotes, tandis que MreB se trouve dans presque toutes les bactéries en forme de bâtonnet. Une telle distribution et une telle pertinence dans la viabilité cellulaire font de ces protéines une cible fascinante dans la recherche sur les antibiotiques 5,6,7.
Il est crucial d’adopter une approche à plusieurs volets qui combine des observations in vivo, des interactions in vitro et des expériences enzymatiques pour valider en profondeur les protéines du cytosquelette bactérien en tant que cible principale d’un inhibiteur potentiel7. Des procédures laborieuses ou des implications financières importantes alourdissent de nombreux tests disponibles à cette fin. Ce sont des obstacles notables à leur utilisation généralisée dans le criblage des composés principaux qui pourraient avoir un impact sur le cytosquelette bactérien. Parmi celles-ci, la microscopie se distingue par une méthode exceptionnellement efficace et rapide pour évaluer l’efficacité des composés en examinant directement les changements de morphologie cellulaire. Pourtant, l’hétéro-association de la protéine cible avec d’autres complexes du cytosquelette, les effets indirects dus à la liaison hors cible et aux modifications du potentiel membranaire, la difficulté à pénétrer efficacement dans la cellule et la présence de pompes d’efflux, en particulier chez les bactéries à Gram négatif, rendent collectivement complexe l’identification de la cause précise de la déformation cellulaire bactérienne 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, ou levure à fission comme on l’appelle communément, est un organisme eucaryote unicellulaire en forme de bâtonnet. La levure de fission est largement utilisée comme organisme modèle en biologie cellulaire et moléculaire en raison de la conservation extraordinaire des processus cellulaires tels que le cycle et la division cellulaires, l’organisation cellulaire et la réplication des chromosomes chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains11,12. De plus, Errington et ses collègues ont exprimé une protéine cytosquelettique bactérienne localisée au pôle DivIVA dans la levure à fission pour démontrer que DivIVA s’accumulait sur des surfaces à courbure négative13. Encore une fois, Balasubramanian et son groupe ont d’abord établi la levure de fission comme système modèle cellulaire pour apporter de nouvelles connaissances sur le mécanisme, l’assemblage et la dynamique de la protéine du cytosquelette d’actine E. coli comme MreB14 et l’homologue de la tubuline FtsZ15. Ils démontrent également la capacité d’A22 à empêcher efficacement la polymérisation de MreB par microscopie à épifluorescence lorsqu’il est exprimé dans la levure14. Par la suite, d’autres groupes ont également utilisé avec succès des levures de fission pour étudier les propriétés d’assemblage des protéines FtsZ1 et FtsZ216 du chloroplaste. Plus récemment, nous avons établi une preuve de concept de la viabilité de l’utilisation de la levure de fission comme plateforme cellulaire pour dépister spécifiquement les inhibiteurs du cytosquelette bactérien en effectuant une évaluation complète de l’impact de trois inhibiteurs connus de FtsZ - la sanguinarine, la berbérine et PC190723-- sur les protéines FtsZ dérivées de deux bactéries pathogènes, à savoir Staphylococcus aureus et Helicobacter pylori17. De plus, ce test cellulaire en une seule étape s’avère essentiel pour minimiser le risque d’identifier des composés potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes.
Dans ce rapport, en utilisant le système de levure à fission, nous proposons un flux de travail systématique utilisant la plaque standard à 96 puits pour le criblage semi-automatisé et la quantification de l’effet des inhibiteurs de petites molécules ciblant FtsZ de Staphylococcus aureus et MreB d’Escherichia coli. Ici, nous mettons en place et optimisons le flux de travail semi-automatisé à l’aide des inhibiteurs établis PC190723 et A22 qui ciblent spécifiquement FtsZ et MreB, respectivement. Ce flux de travail utilise un microscope à épifluorescence équipé d’une platine motorisée de haute précision et d’une acquisition d’image automatisée dans une plaque standard à 96 puits pour améliorer la normalisation actuelle. Par conséquent, il peut être appliqué à des cribles à moyen et à haut débit de bibliothèques chimiques synthétiques et contourne certains des défis énumérés ci-dessus.

<table><tbody><tr><td>96 puits CC2 optique CVG stérile, avec couvercle. Noir</td><td>Thermo Scientific&commerce ;</td><td></td><td></td>160376</tr><tr><td>plaque à 96 puits</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>&nbsp ; </td><td></td>CLS3370</tr><tr><td>Chlorhydrate A22</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>SML0471</td><td>Dissous dans du DMSO</td></tr><tr><td>Adénine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0229</td><td>225 mg/L de milieu</td></tr><tr><td>Concanavalin A&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>C5275-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>317275</tr><tr><td>Edinburg minimal medium (Gélose EMM ou Bouillon EMM)</td><td>FormediumTM</td><td>PMD0210</td><td>Voir ci-dessous pour la composition</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>epMotion&reg ; 96 avec curseur à 2 positions</td><td>Eppendorf</td><td>5069000101</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0144</td><td>225 mg/L de support.</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée Leica DMi8</td><td>La société allemande</td><td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0157</td><td>225 mg/L de support.</td></tr><tr><td>Acétate de lithium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>517992-100G</td><td></td></tr><tr><td>PC190723</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>344580</td><td>Dissous dans</td>du</tr><tr><td>polyéthylène glycol DMSO (PEG)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>202398</tr><tr><td>Thiamine</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td>Filtre stérilisé</td></tr><tr><td>Tris-Chlorhydrate</td><td>MP</td><td>194855</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0214</td><td>225 mg/L de média, Conserver la solution à 36&deg ; C</td></tr><tr><td>OUI (Extrait de levure + suppléments) Agar</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0410</td><td>Voir ci-dessous pour</td></tr><tr><td>la composition OUI (Extrait de levure + suppléments) Bouillon</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0310</td><td>Voir ci-dessous pour la composition</td></tr><tr><td><forte>Levure (S. pombe) media&nbsp ; <</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Extrait de levure + compléments (OUI)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Composition</td><td>g/L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Extrait de levure</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dextrose</td><td>30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agar</td><td>17</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adénine</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-Histidine</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-Leucine</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-Lysine HCl</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Uracil</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td>Edinburg minimal medium (EMM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Composition</forte></td><td><forte>g/L</forte></td><td><forte>concentration</forte></td></tr><tr><td></td><td>hydrogénophallate&nbsp ;</td><td>3</td><td>14,7 mM</td></tr><tr><td></td><td>Na2HPO4&nbsp ;</td><td>2,2</td><td>15,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>NH4Cl&nbsp ;</td><td>5</td><td>93,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>de glucose</td><td>à 2 % (p/v) ou 20 g/L</td><td>&nbsp ; 111 mM</td></tr><tr><td></td><td>Sels (stock x 50)</td><td>20 mL/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vitamines (stock x 1000)</td><td>1 mL/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Minéraux (stock x 10 000)</td><td>0,1 mL/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td>Sels <forts> x 50&nbsp ; </fort></td><td>52,5 g/l MgCl2.6H20 (0,26 M)&nbsp ;</td><td>52,5</td><td>0,26 M</td></tr><tr><td></td><td>0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM)&nbsp ;</td><td>0,000735</td><td>4,99 mM</td></tr><tr><td></td><td>50 g/l KCl (0,67 M)&nbsp ;</td><td>50</td><td>0,67 M</td></tr><tr><td></td><td>2 g/l de Na2SO4 (14,l mM)</td><td>2</td><td>14,1 mM</td></tr><tr><td><forts>Vitamines x 1000&nbsp ; </fort></td><td>1 g/l d’acide pantothénique&nbsp ;</td><td>1</td><td>4,20 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l d’acide nicotinique&nbsp ;</td><td>10</td><td>81,2 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l d’inositol&nbsp ;</td><td>10</td><td>55,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 mg/l de biotine&nbsp ;</td><td>0,01</td><td>40,8 et micro ; M</td></tr><tr><td><fort>Minéraux x 10 000&nbsp ; Acide </>borique fort</td><td></td> <td>5</td><td>80,9 mM</td></tr><tr><td></td><td>MnSO4&nbsp ; &nbsp ;</td><td>4</td><td>23,7 mM</td></tr><tr><td></td><td>ZnSO4.7H2O</td><td>4</td><td>13,9 mM</td></tr><tr><td></td><td>FeCl2.6H2O&nbsp ; &nbsp ;</td><td>2</td><td>7,40 mM</td></tr><tr><td></td><td>d’acide molybdique&nbsp ;</td><td>0,4</td><td>2,47 mM</td></tr><tr><td></td><td>KI&nbsp ;</td><td>1</td><td>6,02 mM</td></tr><tr><td></td><td>CuSO4.5H2O&nbsp ;</td><td>0,4</td><td>1,60 mM</td></tr><tr><td></td><td>d’acide citrique&nbsp ;</td><td>10</td><td>47,6 mM</td></tr><tr><td><fortes>Souches/Plasmides</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fortes></fortes></td><td><fortes>Description</fortes></td><td><fortes>Référence</fortes></td><td></td></tr><tr><td>CCD190</td><td>Escherichia coli DH10&beta ; &nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>CCDY4&nbsp ;</td><td>MBY3532 ; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan et al., 2007</td><td></td></tr><tr><td>CCDY340</td><td>CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma et al., 2023</td><td></td></tr><tr><td>CCDY346</td><td>MBY192 ; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]</td><td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCCD3</td><td>pREP42-GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan et al., 2007</td><td></td></tr><tr><td>pCCD713</td><td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma et al., 2023</td><td></td></tr></tbody></table>

la levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Les protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB remplissent des fonctions essentielles telles que la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire. De plus, FtsZ et MreB sont apparus comme des cibles importantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Plusieurs tests ont été mis au point pour identifier des composés ciblant la liaison nucléotidique et la polymérisation de ces protéines cytosquelettiques, principalement axés sur FtsZ. De plus, de nombreux tests sont soit laborieux, soit coûteux et nécessitent souvent plusieurs méthodes pour déterminer si ces protéines sont la cible cellulaire du médicament. Enfin, la toxicité des médicaments pour les cellules eucaryotes pose également un problème. Ici, nous décrivons un test cellulaire en une seule étape pour découvrir de nouvelles molécules ciblant le cytosquelette bactérien et minimiser les coups qui pourraient être potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes. La levure de fission se prête aux cribles à haut débit basés sur la microscopie, et un écran visuel peut facilement identifier toute molécule qui modifie la polymérisation de FtsZ ou de MreB. Notre test utilise la plaque standard à 96 puits et repose sur la capacité des protéines cytosquelettiques bactériennes à polymériser dans une cellule eucaryote telle que la levure de fission. Bien que les protocoles décrits ici concernent les levures à fission et utilisent le FtsZ de Staphylococcus aureus et le MreB d’Escherichia coli, ils sont facilement adaptables à d’autres protéines cytosquelettiques bactériennes qui s’assemblent facilement en polymères chez n’importe quel hôte d’expression eucaryote. La méthode décrite ici devrait faciliter la découverte de nouveaux antimicrobiens ciblant les protéines cytosquelettiques bactériennes.

Mise en place de la plaque à 96 puits pour le criblage des drogues L’utilisation de S. pombe pour exprimer un S. aureus FtsZ marqué en C-terminal GFP à partir d’un vecteur (pREP42) contenant le promoteur répressible de thiamine de force moyenne nmt41a été précédemment établie17 et de même, le MreB d’E. coli marqué avec une GFP N-terminale a également été exprimé chez S. pombe14. Nous avons également montré que PC190723, un inhibiteur spécifique de SaFtsZ et A22, un inhibiteur de MreB, peuvent exercer leurs effets sur les protéines cytosquelettiques bactériennes respectives d’une manière spécifique lorsqu’elles sont exprimées dans la levure14,17.
Ici, nous proposons d’utiliser le système d’expression de levures pour développer un criblage à moyen ou haut débit de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien. Un microscope à épifluorescence doté d’une platine motorisée peut être automatisé pour imager une plaque à 96 puits, et des bibliothèques de médicaments commerciales sont également facilement disponibles dans des formats de plaques à 96 puits. Nous préférons donc utiliser une plaque à 96 puits pour le dépistage proposé des médicaments. Les plaques sont réglées comme indiqué sur la figure 1. La première rangée (figure 1A) est constituée de SaFtsZ-GFP exprimant la culture de levure. La deuxième rangée (figure 1B) est constituée de cultures de levures exprimant GFP-EcMreB. Les deux premières colonnes des deux premières rangées (A1 :B2) sont définies comme vides. Les six colonnes suivantes des deux premières rangées (A3 :B12) sont définies comme contrôle DMSO avec trois concentrations différentes en fonction des dilutions du médicament en double. Ensuite, PC190723 (56,2 μM) et A22 (72,6 μM) sont ajoutés aux cellules de levure exprimant SaFtsZ-GFP ou GFP-EcMreB. PC190723 et A22 servent de contrôles positifs pour FtsZ et MreB, respectivement. Tous les autres puits (C1 :F12) sont utilisés pour ajouter divers médicaments (à trois concentrations différentes et en double) utilisés dans le crible pour identifier les effecteurs des protéines du cytosquelette bactérien, SaFtsZ ou EcMreB. Des cultures de levures exprimant le SaFtsZ ou le MreB marqué GFP sont distribuées dans ces plaques à 96 puits et cultivées jusqu’à ce que les effets des médicaments sur l’assemblage des polymères soient visualisés.
Évaluation des effets de croissance sur les cellules de levure Après avoir incubé les cellules sous-cultivées contenant 96 puits à 30 °C pendant 6 à 10 h, la densité optique (DO) de la culture de levure est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. La mesure de la DO permet d’évaluer l’effet inhibiteur de croissance des médicaments contre les cellules de levure eucaryotes et éventuellement les effets délétères sur les cellules humaines. Ainsi, ce test peut être utilisé pour éliminer plusieurs médicaments en fonction de leur toxicité dans le système de levure. Cependant, ni PC190723 ni A22 ne présentent d’effets sur la croissance ou de toxicité pour les cellules de levure, et la DO600 des cultures exprimant SaFtsZ-GFP traitées avec du DMSO, du PC190723 ou de l’A22 était respectivement de 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 et de 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). De même, la DO600 des cultures exprimant la GFP-EcMreB et traitées avec du DMSO, du PC190723 ou de l’A22 était respectivement de 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 et de 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).
Visualisation de l’effet des médicaments sur les structures polymères assemblées par SaFtsZ et EcMreB exprimées chez S. pombe Afin d’évaluer l’effet des médicaments sur la polymérisation de SaFtsZ ou d’EcMreB, une aliquote des cellules de levure de la plaque à 96 puits contenant des médicaments mentionnée ci-dessus est transférée sur une autre plaque à 96 puits avec un fond en verre optiquement transparent à 96 puits adaptée à l’imagerie par fluorescence. Cette plaque de 96 puits est également recouverte de concanavaline A pour permettre l’adhésion des cellules de levure exprimant le SaFtsZ ou l’EcMreB marqué GFP. La plaque à 96 puits est imagée à l’aide d’un microscope à épifluorescence couvrant tous les 96 puits de la plaque aux positions prédéterminées contrôlées par le logiciel d’acquisition d’images (Figure 2). Dans les puits de contrôle (traités au DMSO), les cellules de levure exprimant SaFtsZ-GFP ont montré des structures polymères sous forme de taches ou de patchs répartis dans les cellules, après 16 à 18 h de croissance en l’absence de thiamine. Cependant, 10 à 12 h après la croissance en l’absence de thiamine, les cellules ne présentaient qu’une fluorescence diffuse ou quelques taches, ce qui suggère que l’expression de FtsZ-GFP n’avait pas atteint la concentration critique requise pour la polymérisation (Figure 3A). Au contraire, le médicament stabilisant FtsZ, PC190723, a montré une augmentation considérable des structures polymères (taches ou taches) de SaFtsZ-GFP par rapport au contrôle DMSO après 12 h de croissance (Figure 3B), servant de contrôle positif. En revanche, les cellules traitées avec A22 n’ont montré aucune différence dans les structures SaFtsZ-GFP assemblées (Figure 3C). Cependant, contrairement aux cultures traitées avec PC190723, SaFtsZ-GFP ne s’est assemblé en plaques dans les cultures non traitées que lorsqu’il a été induit pendant de plus longues périodes, montrant que PC190723 a agi pour réduire la concentration critique de polymérisation de SaFtsZ (Figure 3D). De même, GFP-EcMreB exprimée chez S. pombe a formé des réseaux linéaires de longs filaments le long de l’axe longitudinal de la levure de fission (Figure 4A). Bien que PC190723 n’ait aucun effet sur la polymérisation d’EcMreB (Figure 4B), le traitement des cellules avec A22 a entraîné une fluorescence diffuse dans tout le cytoplasme des cellules de levure (Figure 4C). Les images du reste des plaques de 96 puits sont inspectées visuellement pour détecter tout effet stabilisant ou inhibiteur des médicaments sur le SaFtsZ ou l’EcMreB, selon le cas.
L’impact des médicaments sur l’assemblage des protéines cytosquelettiques bactériennes peut ensuite être quantifié à l’aide d’outils d’analyse d’images et de plug-ins dans ImageJ ou Fiji, comme indiqué précédemment pour SaFtsZ17 et EcMreB21. L’acquisition automatisée d’images au format de plaque à 96 puits et la mise en œuvre de macros et de scripts personnalisés pour le traitement d’images peuvent accélérer le temps d’imagerie et la quantification des effets des médicaments. Ainsi, en utilisant la levure eucaryote unicellulaire, S. pombe, comme système hôte, nous proposons qu’un criblage à moyen ou haut débit de petites molécules ciblant les protéines cytosquelettiques bactériennes puisse être réalisé avec succès, conduisant éventuellement à la découverte de nouveaux antibiotiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma montrant l’utilisation de cellules de levure de fission pour dépister des médicaments ciblant l’assemblage de protéines cytosquelettiques bactériennes SaFtsZ ou EcMreB. FtsZ de S. aureus et MreB d’E. coli ont été clonés dans le vecteur d’expression de la levure, pREP42 ayant une étiquette GFP à l’extrémité C- et N-, respectivement, et transformés en S. pombe pour l’étude phénotypique et médicamenteuse. Les cultures ont été cultivées pendant 8 à 12 heures. Par la suite, les cultures ont été sous-cultivées dans des plaques de 96 puits avec des témoins appropriés et les différents médicaments étant criblés. De plus, la plaque a été incubée à 30 °C pendant 6 à 8 h jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,5-0,6, et la densité optique est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques pour évaluer la toxicité des médicaments envers les cellules de levure. Une autre plaque à fond de verre optiquement transparent à 96 puits a été pré-recouverte de concanavaline A, pour l’adhérence des cellules de levure. Cette plaque de 96 puits a été utilisée pour la visualisation et l’acquisition d’images avec un microscope à épifluorescence. Les images obtenues ont ensuite été analysées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma du logiciel d’acquisition d’images pour l’imagerie automatisée d’une plaque de 96 puits. À l’aide du navigateur du logiciel d’acquisition d’images, une plaque de 96 puits a été alignée en marquant les bords. Les paramètres de couverture du puits tels que le nombre d’images à prendre de chaque puits et son emplacement (aléatoire ou du centre du puits) ont été sélectionnés comme souhaité. Enfin, les paramètres de l’image tels que le jeu de filtres à utiliser (filtre DIC et FITC ; Ex 475/28 nm et Em 525/48 nm), le pourcentage d’intensité de la lumière d’éclairage, l’autofocus et le temps d’exposition pour la capture d’image ont été réglés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig03v2.jpg"> Figure 3 : Visualisation de l’effet des médicaments PC190723 et A22 sur SaFtsZ-GFP exprimé chez S. pombe. La culture de S. pombe exprimant SaFtsZ-GFP a été cultivée en l’absence de thiamine pendant 8 à 9 h à 30 °C avant le DMSO et le traitement médicamenteux. La culture a ensuite été cultivée dans une plaque de 96 puits pendant 7 à 9 h à 30 °C en présence ou en l’absence des médicaments. (A) Dans le contrôle du DMSO, où une quantité équivalente de DMSO a été ajoutée, les cellules présentaient quelques structures polymères. (B) En présence de PC190723 (56,2 μM), SaFtsZ exprime des cellules de levure montrant une augmentation considérable des structures polymères par rapport à celle du témoin DMSO. (C) L’inhibiteur de MreB, A22 (72,6 μM), n’a pas affecté les structures SaFtsZ-GFP. (D) Des heures plus longues d’expression de la protéine ont été nécessaires pour l’assemblage de SaFtsZ-GFP en l’absence de PC190723, et par conséquent, les cultures témoins cultivées à 30 °C pendant 12 à 15 h après la sous-culture dans des plaques à 96 puits contenant du DMSO présentent également des polymères FtsZ. La barre d’échelle est de 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig04.jpg"> Figure 4 : Visualisation de l’effet des médicaments PC190723 et A22 sur la GFP-EcMreB exprimée chez S. pombe. Une culture de S. pombe exprimant GFP-EcMreB a été cultivée en l’absence de thiamine pendant 9 à 11 h à 30 °C avant d’ajouter du DMSO ou les médicaments (A22 ou PC190723). La culture a ensuite été cultivée dans une plaque de 96 puits pendant 8 à 10 h à 30 °C avec et sans médicaments comme témoin. (A) Dans les cultures où une quantité équivalente de DMSO a été ajoutée comme contrôle, les cellules présentaient des filaments linéaires d’EcMreB orientés le long de l’axe longitudinal des cellules de levure. (B) L’assemblage de GFP-EcMreB n’a pas été affecté dans les cultures traitées avec PC190723 (56,2 μM). (C) La petite molécule A22 (72,6 μM), un inhibiteur connu de la polymérisation de MreB, a empêché l’assemblage de GFP-EcMreB dans les cellules de levure à fission. La barre d’échelle est de 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Tableau 1 : Souches et plasmides utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Composition des milieux et des tampons utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

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La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien (Vidéo) | JoVE Journal

La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

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