Name: Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Apprenez l'isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris par dissociation douce et tri magnétique. Cette méthode permet d'étudier la vascularisation pancréatique et ses mécanismes dans la santé et la maladie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Rationalisation de l’extraction de cellules endothéliales pancréatiques de souris pour les études de maladies

<table><tbody><tr><td>1,5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique de 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 25G</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>plaque 6 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; passoire m</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotine</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin traité par choc thermique à l’albumine</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1, à partir de peau de veau</td><td>Sigma Aldrich& nbsp ;</td><td>C9791</td><td>Réactif d’attachement dans le protocole</td></tr><tr><td>Collagénase Type 1&nbsp ;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess Compteur de Cellules Automatique</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>D1306</td><td>immunofluorescence</td></tr><tr><td>Scalpels de sécurité jetables</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Fisher</td><td></td> 10437028 <td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td>Maintenu à 37 &deg ; C 5 % CO2</td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand avec le séparateur QuadroMACS&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Pour évaluer la morphologie cellulaire</td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Innova 44/44R Agitateur orbital&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>immunofluorescence</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (10X) (pas de Ca2+,pas de Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Souris avant</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Souris Revese&nbsp ;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Souris avant&nbsp ;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Souris inversée</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Souris inversée&nbsp ;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Souris avant</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Souris avant</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Souris inverse</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Pince stérile 12" longue</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine stérile</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins stériles</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire 2cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la trypsine&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadhérine Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

En suivant ce protocole, environ 2 x 106 cellules vivantes peuvent être obtenues en regroupant 3 pancréas de souris et 750 000 cellules d’un seul pancréas de souris. Pour valider l’enrichissement de la CE, nous avons effectué les analyses suivantes : 1) PCR quantitative : par rapport aux échantillons à flux continu (FT) (c’est-à-dire les fractions non liées aux anticorps CD31), les fractions EC présentaient des niveaux significativement plus élevés de Pecam1 (codant pour CD31) et de Kdr (codant pour VEGFR2), deux gènesmarqueurs EC 33, et des niveaux plus faibles de NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), un facteur de transcription dans les cellules endocrines pancréatiques (Figure 4A); 2) Western blot : Des échantillons enrichis en EC provenant de trois préparations (pEC-1-3) ont montré de forts signaux de CD31 à la taille attendue (~130 kDa). En comparaison, les échantillons d’entrée et FT ont montré un signal CD31 minimal. En tant que contrôle positif, les lysats de cellules MS1, une lignée cellulaire pEC, ont également montré un fort signal CD31 (Figure 4B) ; 3) coloration au bleu de trypan : nous avons constaté que la viabilité des cellules isolées était d’environ 50 % (Figure 4C) ; 4) cytométrie en flux selon un protocole publié15 : grâce à un contrôle sur la population de cellules vivantes (Figure 4D), nous avons constaté que les cellules CD31+ étaient à 88 % et les cellules TdTomato+ à 76 %. Il est à noter que la majorité des cellules isolées co-expriment CD31 et TdTomato (Figure 4E). En tant que témoins négatifs, les cellules MS1 non colorées et MS1 incubées avec des IgG n’ont montré aucune cellule vivante marquée par CD31. En tant que témoin positif, c’est-à-dire les cellules MS1 colorées pour CD31, a montré près de 100 % de cellules CD31+ vivantes (Figure 4F). Nous avons également cultivé les cellules isolées, effectué une coloration par immunofluorescence de PECAM1 selon un protocole36 publié, et imagé TdTomato, qui a montré des signaux robustes des deux marqueurs dans les cellules isolées, suggérant la présence de CE (Figure 4G).
<img alt="Diagramme du pancréas illustrant les CE intra-îlots pour l’étude de la structure vasculaire et l’analyse des interactions cellulaires." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Illustration de la vascularisation du pancréas et des îlots pancréatiques. Une représentation graphique des cellules endothéliales pancréatiques (CE) et des cellules endothéliales intra-îlots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de préparation du pancréas unicellulaire ; centrifugation, marquage CD31-biotine, analyse en flux continu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Vue d’ensemble du flux de travail. 1) dissection pancréasique, 2) digestion mécanique, 3) incubation enzymatique, 4) centrifugation, 5a) élimination des surnageants et 5b) digestion secondaire des granules cellulaires par collagénase avec trituration pour filtrer dans 6), 7) et 8) reconstitution des granulés et liaison des anticorps, 9) incubation des microbilles, 10) enrichissement de la colonne MACS, 11) comptage des cellules pour la viabilité et 12) analyse en aval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Dissection tissulaire montrant le processus de récolte, d’isolement et de parage du pancréas dans la recherche biologique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Étapes de traitement des tissus. Images de (A) la cavité abdominale, (B) le pancréas isolé de la souris et (C) le pancréas de souris coupé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Expression génique, analyse CD31, DAPI, tri cellulaire, fluorescence et cytométrie en flux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Validation de fractions EC isolées du pancréas de souris. (A) qPCR d’échantillons FT et fraction EC enrichie en CD31 pour l’enrichissement. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) et Nkx6.1 (facteur de transcription spécifique des cellules β pancréatiques)33. * désigne p &lt;0,05 par rapport à FT sur la base des tests t. n = 3-4 échantillons groupés, composés de 3 souris chacun. (B) Transfert Western de CD31. pEC-1-3 indiquent des CE enrichies à partir de 3 échantillons de souris regroupés distincts. Des lysats cellulaires de 30 mg ont été chargés sur chaque voie, suivis d’une coloration au Ponceau S. (C) Comptage cellulaire et coloration au bleu trypan des pEC enrichis pour l’essai de viabilité. (D) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour les pEC de souris colorées par l’anticorps 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et CD31. (E) Histogrammes de cytométrie en flux de MS1 non colorés (en haut à gauche), de MS1 colorés avec l’anticorps secondaire AlexaFluor-488 (contrôle IgG ; en haut à droite), de MS1 colorés avec CD31 (en bas à gauche) et des pEC de souris isolées colorées avec CD31 (en bas à droite). (F) Pourcentage de cellules vivantes quantifié à l’aide de la cytométrie en flux. (G) Immunofluorescence de l’expression de CD31 (vert) avec contre-coloration DAPI (bleu) et rapporteur fluorescent endogène TdTomato (rouge). Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie d’immunofluorescence CD31/CD144/DAPI, analyse de l’expression génique UMAP de Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5 : Spécificité des CD31 et CD144 dans le pancréas de souris. (A) Immunofluorescence du pancréas de souris avec CD31 (Magenta) et CD144 (Cyan), avec contre-coloration DAPI. Image capturée à l’aide d’un objectif 10x sous un microscope inversé fluorescent à grand champ. Barre d’échelle = 100 μm. Des lignes pointillées délimitent la zone de l’îlot. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) montrant l’expression de Cdh5 et Pecam1 dans les EC des îlots de Langerhans de souris C57BL6 détectées par scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzyme</td>
			<td>Utiliser</td>
			<td>Température et temps</td>
			<td>Référence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase I</td>
			<td>Dissociation unicellulaire, enrichissement CE du pancréas entier</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Ce protocole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase IV</td>
			<td>Isolement des îlots et dissociation non enzymatique</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase + Trypsine</td>
			<td>Examen des cellules canalaires dans le pancréas de souris</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase B</td>
			<td>Suspension unicellulaire du pancréas</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase NBI</td>
			<td>Isolation des îlots</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase P</td>
			<td>Suspension viable Acinar</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagénase XI</td>
			<td>Isolation des îlots</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Suspension à cellule unique</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Suspension à cellule unique</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Dissociation unicellulaire, pancréas entier</td>
			<td>4 °C, H/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Résumé des différents protocoles utilisés pour traiter les échantillons de pancréas de souris.

Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

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Biologie

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

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Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

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Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

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